CN111579795A - 猪蓝耳病毒GP5蛋白IgY抗体检测免疫荧光试纸及其制备方法和应用 - Google Patents

猪蓝耳病毒GP5蛋白IgY抗体检测免疫荧光试纸及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪蓝耳病毒GP5蛋白IgY抗体检测免疫荧光试纸及其制备方法和应用，属于猪蓝耳病毒GP5蛋白IgY抗体快速检测技术领域，所述试纸条的结合垫含有荧光微球标记的兔抗鸡IgY，硝酸纤维素膜上设有由山羊抗兔IgG包被的质控线和猪蓝耳病毒GP5重组抗原包被的检测线。本发明的试纸可用于现场快速检测或者实验室检测，只需要5‑10min，操作方便，操作人员不需要专业培训，且不需要专门的实验室，克服了现有检测方法的局限性，具有良好的市场前景，相比较ELISA抗体检测方法，本发明更加的方便快捷，灵敏度高，利于推广。

Description

猪蓝耳病毒GP5蛋白IgY抗体检测免疫荧光试纸及其制备方法 和应用
技术领域
本发明涉及猪蓝耳病毒GP5蛋白IgY抗体(猪蓝耳病毒GP5卵黄抗体)的快速检测技术领域，尤其涉及一种猪蓝耳病毒GP5蛋白IgY抗体检测免疫荧光纸质及其制备方法和应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveand respiratorysyndrome，PRRS)又称猪蓝耳病，是20世纪80年代末暴发的一种新型的高致病性猪传染病.由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的一种以感染猪发热、厌食，妊娠母猪晚期流产、早产、产死胎、弱胎和木乃伊胎，各种年龄猪(特别是仔猪)呼吸障碍为特征的高度传染性疾病。自2006年开始，高致病性猪蓝耳病在我国的爆发与流行给养猪业带来了巨大的经济损失。PRRS 病毒(PRRSV)具有高度变异性，有美洲型和欧洲型两种毒株，我国流行的均属于美洲型。
PRRSV有9个不分节段的开放阅读框编码。多种非结构蛋白和8个结构蛋白，其中GP5和M蛋白是病毒的主要结构蛋白。GP5蛋白又称为E蛋白，由ORF5编码。是一种跨膜糖蛋白，位于病毒粒子的包膜上，为糖基化的囊膜蛋白。GP5蛋白具有较好的免疫原性，可诱导产生中和抗体，能在体外中和病毒的感染性。动物机体在中和抗体出现之后，抗血清主要识别GP5蛋白。目前，针对猪蓝耳病毒GP5的疫苗较少，且无论进口或国产疫苗效果均不佳，而猪蓝耳病毒GP5卵黄抗体作为饲料添加剂在使用中发现对猪蓝耳病毒GP5有较好的治疗作用和预防作用。
现有技术中针对猪蓝耳病毒抗体检测的试剂包括胶体金检测试纸，如中国专利文献 CN200810112726.9公开了一种猪蓝耳病毒抗体胶体金检测试纸条、其制备方法及其应用，所述试纸条包括同时包被猪蓝耳病毒N蛋白(检测线)和抗猪蓝耳病毒N蛋白的多克隆抗体(质控线)的硝酸纤维膜，以及含有胶体金标记猪蓝耳病毒N蛋白的玻璃纤维膜(胶体金垫)。又如中国专利文献CN201911300052.X公开的一种猪蓝耳病毒嵌合抗原以及检测猪蓝耳病毒抗体的胶体金免疫层析试纸条，其中，所述试纸条是以猪蓝而病毒嵌合抗原包被检测线，以兔抗猪IgG抗体包被质控线，以胶体金颗粒标记的金黄色葡萄球菌蛋白A的复合物包被结合垫。目前市场上暂无针对猪蓝耳病毒GP5卵黄抗体检测的试剂。
免疫荧光免疫层析(Colloidal gold-based immunochromato graphic assay,GICA) 技术是一种将免疫荧光标记技术、免疫检测技术和层析分析技术等多种方法有机结合在一起的固相标记免疫检测技术，具有简便、省时、样本用量少、结果易判读等特点，常在资源匮乏或非实验室环境中进行目标物的定性、半定量和定量检测。应用范围包括生物医学中的病原体、药物、激素和代谢物检测，植物检疫，兽医，饲料/食品和环境指标的测试。相比较ELISA等其他检测手段，具有快速/方便/经济的特点。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种猪蓝耳病毒GP5蛋白IgY抗体检测免疫荧光试纸及其制备方法和应用，以提供一种针对猪蓝耳病毒GP5卵黄抗体的快速检测的方法，解决目前没有专门针对猪蓝耳病毒GP5蛋白IgY抗体检测试剂的技术空白，达到快速检测出饲料中是否真正含有GP5卵黄抗体的目的，保证饲养业主的利益。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
本发明提供了一种猪蓝耳病毒GP5蛋白IgY抗体免疫荧光检测试纸，包括包括PVC底板、及依次搭接在PVC底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中，所述结合垫为包被有兔抗鸡IgY-荧光微球复合物的兔抗鸡IgY-荧光微球结合垫，所述硝酸纤维素膜上设有由山羊抗兔IgG包被的质控线和猪蓝耳病毒GP5重组抗原包被的检测线。
本发明还提供了上述猪蓝耳病毒GP5蛋白IgY抗体免疫荧光检测试纸的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备纯化的猪蓝耳病毒GP5重组抗原；
(2)制备硝酸纤维素膜：将山羊抗兔IgG和纯化的猪蓝耳病毒GP5重组抗原分别稀释后，包被在硝酸纤维素膜的质控线和检测线上；
(3)荧光微球标记兔抗鸡IgY：取兔抗鸡IgY，将荧光微球与兔抗鸡IgY混合，离心，用稀释液重悬沉淀，获得兔抗鸡IgY-荧光微球复合物；
(4)制备结合垫：将兔抗鸡IgY-荧光微球复合物均匀喷在结合垫上，充分干燥，获得兔抗鸡IgY-荧光微球结合垫；
(5)试纸条的组装。
作为本发明的进一步优化方案，所述步骤(1)制备纯化的猪蓝耳病毒GP5重组抗原的步骤包括：根据已知猪蓝耳病毒GP5蛋白基因序列，制备猪蓝耳病毒GP5蛋白的大肠杆菌重组菌，将重组菌发酵表达并离心获得菌体，将菌体破碎，离心取上清，将上清过亲合层析柱，即为纯化的猪蓝耳病毒GP5重组抗原。
作为本发明的进一步优化方案，所述步骤(2)制备硝酸纤维素膜的步骤包括：山羊抗兔IgG和纯化的猪蓝耳病毒GP5重组抗原分别以10mM的PB缓冲液稀释至终浓度为 1mg/ml，再以0.7μL/cm的喷量喷施包被在质控线和检测线上，充分干燥。
作为本发明的进一步优化方案，所述步骤(3)荧光微球标记兔抗鸡IgY的步骤包括：将500μL的荧光微球溶液与100μL的0.5mg/ml的兔抗鸡IgY混合，室温反应3h；然后加入10μL10％BSA封闭微球表面未结合的位点，封闭反应2h；4℃10000rpm/min离心10min；弃去上清游离的抗体。用200μL准备好的稀释液重悬复合物，即兔抗鸡IgY- 荧光微球复合物，并于4℃保存。
作为本发明的进一步优化方案，所述步骤(4)的兔抗鸡IgY-荧光微球复合物在结合垫上的喷量为5μL/cm。
作为本发明的进一步优化方案，所述步骤(5)的试纸条的组装方法的步骤包括：在干燥环境下准备好样品垫、兔抗鸡IgY-荧光微球结合垫、包被的硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC底板，在PVC底板中央贴上包被好的硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上缘粘贴吸水垫，硝酸纤维素膜下缘粘贴兔抗鸡IgY-荧光微球结合垫，兔抗鸡IgY-荧光微球结合垫下缘粘贴样品垫，完成后将试纸板切成条状。
本发明还提供了利用上述荧光微球检测试剂检测猪蓝耳病毒GP5蛋白IgY抗体的方法，步骤包括：将检测试纸平放，取待测血清样品50μL，加入样品垫，室温静置15min 后，在紫外光的照射下根据以下情况判定结果：
试纸有效：在质控线出现绿色荧光线，即说明本试纸有效；
阴性：只在质控线出现绿色荧光线，在检测线不出现色线；
阳性：在质控线和检测线均出现一条绿色荧光线；
且荧光强度与GP5 IgY抗体含量成正比，即GP5 IgY抗体含量越高，荧光强度越深。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种猪蓝耳病毒GP5蛋白IgY抗体免疫荧光检测试纸及其制备方法和应用，利用检测试纸检测后，阳性结果说明所检测样本猪蓝耳病毒GP5 IgY抗体阳性且达到了要求的抗体水平，阴性结果说明样本猪蓝耳病毒GP5 IgY抗体阴性或未达到要求的抗体水平，该试纸条可迅速检测猪蓝耳病毒GP5 IgY抗体水平，填补了猪蓝耳病毒GP5 IgY抗体目前无针对性检测试剂的空白，相比较常规ELISA 抗体检测方法，本发明更加的方便快捷。
附图说明
图1是猪蓝耳病毒GP5 IgY抗体免疫免疫荧光检测试纸条结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。
实施例1
1、材料
本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
2、方法
2.1纯化的猪蓝耳病毒GP5重组抗原的制备
从GENBANK获取猪蓝耳病毒GP5蛋白基因序列(GENBANK登录号：GU047345.1)，送华大基因公司制备猪蓝耳病毒GP5蛋白的大肠杆菌重组菌，将重组菌发酵表达并离心获得菌体，将菌体使用高压均质机破碎并使用超声破碎仪二次破碎，离心取上清，将上清过亲合层析柱，即为纯化的猪蓝耳病毒GP5重组抗原。
2.2制备硝酸纤维素膜
将山羊抗兔IgG和纯化的猪蓝耳病毒GP5重组抗原分别以10mM的PB缓冲液稀释至终浓度为1mg/ml，然后分别均匀喷在硝酸纤维素膜4上的质控线C和检测线T上，喷量均为0.7μL/cm，充分干燥。
2.3荧光微球标记兔抗鸡IgY
将500μL的荧光微球溶液与100μL的0.5mg/ml的兔抗鸡IgY混合，室温反应3h；然后加入10μL10％BSA封闭微球表面未结合的位点，封闭反应2h。4℃10000rpm/min离心 10min；弃去上清游离的抗体。用200μL准备好的稀释液(20mM Tris,10％蔗糖，0.5％牛血清白蛋白，0.5％PEG2000，0.2％吐温20，pH 6.5-7.0)重悬复合物，即兔抗鸡IgY-荧光微球复合物，并于4℃保存。
2.4制备兔抗鸡IgY-荧光微球复合物结合垫
将上述制备的兔抗鸡IgY-荧光微球复合物按照5μL/cm的喷量均匀喷在玻璃纤维素膜上，充分干燥，获得兔抗鸡IgY-荧光微球结合垫3。
2.5试纸条的组装
在干燥间内准备好吸水垫5、样品垫2、PVC底板1，在PVC底板1中央贴上步骤2.2包被好的硝酸纤维素膜4，硝酸纤维素膜4上缘粘贴吸水垫5，硝酸纤维素膜4下缘粘贴步骤2.4制备的兔抗鸡IgY-荧光微球结合垫3，兔抗鸡IgY-荧光微球结合垫3下缘粘贴样品垫 2，各组分相互叠加部分为1-2mm，完成后用裁切机将贴好的试纸板切成3.8mm宽的试纸条，如图1所示。将切好的试纸条装入卡壳中，再将试纸条和干燥剂密封于铝箔袋中，完成产品的组装。
本发明所提供的检测试纸使用与结果判定方法可按照以下步骤进行：将试纸条平放于桌面上，取待测血清样品50μL，加入样品垫2，室温静置10min后，在紫外等照射下，根据以下情况判定结果：
试纸有效：在质控线C出现绿色荧光线，即说明本试纸有效；
阴性：只在质控线C出现绿色荧光线，在检测线T不出现色线；
阳性：在质控线C和检测线T均出现一条绿色荧光线；
且荧光强度与GP5 IgY抗体含量成正比，即GP5 IgY抗体含量越高，色线越深。
为了验证本发明免疫荧光试纸的效果，设置对照试验，包括：
试验例1
以纯化的猪蓝耳病毒GP5重组抗原包被检测线，以山羊抗兔IgG包被质控线，以兔抗鸡IgY-胶体金复合物包被结合垫制成胶体金垫，其中，兔抗鸡IgY-胶体金复合物的制备方法包括：采用柠檬酸三钠还原法制备20-50nm胶体金溶液：取质量分数为0.01％ -0.02％的HAuCl4水溶液100ml，加热煮沸，迅速加入质量分数为1％-5％的柠檬酸三钠水溶液1ml，继续煮沸约5min，制成粒径20-50nm金颗粒溶液，此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸三钠加入后很快变成灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成酒红色，冷却至室温后2℃-8℃避光保存。取高纯度兔抗鸡IgY溶于0.1-0.2ml的10mM的Tris缓冲液中，将胶体金溶液的pH值调至7.2，按以下组合将兔抗鸡IgY与胶体金混合：每20-50mg 兔抗鸡IgY，加入10ml40nm胶体金溶液；混合3-5min后，加入质量分数为0.05％的BSA，室温作用结合15min；先2000r/min低速离心15min，再12000r/min高速离心25min；用 100mmol/L的pH7.8的含0.2％质量分数Proclin300的Tris缓冲液重悬沉淀，获得兔抗鸡IgY- 胶体金复合物。
试验例2(中国专利文献CN200810112726.9)
以纯化的猪蓝耳病毒GP5重组抗原包被检测线，以抗猪蓝而病毒GP5蛋白的多克隆抗体包被质控线，以含有胶体金标记猪蓝耳病毒GP5蛋白包被结合垫制成胶体金垫，其它步骤同实施例1。
3、试纸条检测效果验证
根据猪蓝耳病毒GP5 IgY抗体出厂时要求的抗体水平，取猪蓝耳病毒GP5 IgY抗体，用10mM的PB溶液稀释至100ng/ml浓度、200ng/ml浓度、400ng/ml浓度、800ng/ml浓度，作为检测样品，同时设置空白对照，分别利用本发明的试纸条和酶联免疫吸附法(ELISA) 检测抗体浓度，结果如下表1所示：
表1：不同方法检测猪蓝耳病毒GP5 IgY抗体浓度
Figure RE-GDA0002587605620000061
表1可以看出，本发明的免疫荧光纸质条的检测结果与ELISA检测结果具有高度一致性，说明本发明免疫荧光纸质条的准确率为100％，利用本申请的免疫荧光纸质条检测猪蓝耳病毒GP5 IgY抗体及其含量是可行的。相比较于ELISA检测，检测时间仅仅需要 10min，更加方便快捷，由于荧光强度与抗体含量成正比，抗体含量越高，色线越深，若将一种猪蓝耳病毒GP5蛋白IgY抗体检测免疫荧光纸质条与荧光定量检测仪器联用，可实现定量检测。可由此来检测市售的猪蓝耳病毒GP5 IgY抗体产品是否达到了出厂抗体水平，以判断购买的产品是否为假货或掺假。
同时本发明与试验例1和2相比，其结合垫上包被的是兔抗鸡IgY-荧光微球复合物，通过对照实验可以明显看出本发明有更高的准确率和灵敏度以及线性范围，可以更准确有效的检测出猪蓝耳病毒GP5 IgY抗体及其含量。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种猪蓝耳病毒GP5蛋白IgY抗体免疫荧光检测试纸，包括PVC底板、及依次搭接在PVC底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其特征在于，所述结合垫为包被有兔抗鸡IgY-荧光微球复合物的兔抗鸡IgY-荧光微球结合垫，所述硝酸纤维素膜上设有由山羊抗兔IgG包被的质控线和猪蓝耳病毒GP5重组抗原包被的检测线。
2.一种如权利要求1所述的猪蓝耳病毒GP5蛋白IgY抗体免疫荧光检测试纸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备纯化的猪蓝耳病毒GP5重组抗原；
(2)制备硝酸纤维素膜：将山羊抗兔IgG和纯化的猪蓝耳病毒GP5重组抗原分别稀释后，包被在硝酸纤维素膜的质控线和检测线上；
(3)荧光微球标记兔抗鸡IgY：取兔抗鸡IgY，将荧光微球与兔抗鸡IgY混合，离心，用稀释液重悬沉淀，获得兔抗鸡IgY-荧光微球复合物；
(4)制备结合垫：将兔抗鸡IgY-荧光微球复合物均匀喷在结合垫上，充分干燥，获得兔抗鸡IgY-荧光微球结合垫；
(5)试纸条的组装。
3.根据权利要求2所述的一种猪蓝耳病毒GP5蛋白IgY抗体免疫荧光检测试纸的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)制备纯化的猪蓝耳病毒GP5重组抗原的步骤包括：根据已知猪蓝耳病毒GP5蛋白基因序列，制备猪蓝耳病毒GP5蛋白的大肠杆菌重组菌，将重组菌发酵表达并离心获得菌体，将菌体破碎，离心取上清，将上清过亲合层析柱，即为纯化的猪蓝耳病毒GP5重组抗原。
4.根据权利要求2所述的一种猪蓝耳病毒GP5蛋白IgY抗体免疫荧光检测试纸的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)制备硝酸纤维素膜的步骤包括：山羊抗兔IgG和纯化的猪蓝耳病毒GP5重组抗原分别以10mM的PB缓冲液稀释至终浓度为1mg/ml，再以0.7μL/cm的喷量喷施包被在质控线和检测线上，充分干燥。
5.根据权利要求2所述的一种猪蓝耳病毒GP5蛋白IgY抗体免疫荧光检测试纸的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)荧光微球标记兔抗鸡IgY的步骤包括：将500μL的荧光微球溶液与100μL的0.5mg/ml的兔抗鸡IgY混合，室温反应3h；然后加入10μL10％BSA封闭微球表面未结合的位点，封闭反应2h；4℃10000rpm/min离心10min；弃去上清游离的抗体。用200μL准备好的稀释液重悬复合物，即兔抗鸡IgY-荧光微球复合物，并于4℃保存。
6.根据权利要求2所述的一种猪蓝耳病毒GP5蛋白IgY抗体免疫荧光检测试纸的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)的兔抗鸡IgY-荧光微球复合物在结合垫上的喷量为5μL/cm。
7.根据权利要求2所述的一种猪蓝耳病毒GP5蛋白IgY抗体免疫荧光检测试纸的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)的试纸条的组装方法的步骤包括：在干燥环境下准备好样品垫、兔抗鸡IgY-荧光微球结合垫、包被的硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC底板，在PVC底板中央贴上包被好的硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上缘粘贴吸水垫，硝酸纤维素膜下缘粘贴兔抗鸡IgY-荧光微球结合垫，兔抗鸡IgY-荧光微球结合垫下缘粘贴样品垫，完成后将试纸板切成条状。
8.一种利用如权利要求1所述的荧光微球检测试剂检测猪蓝耳病毒GP5蛋白IgY抗体的方法，其特征在于，步骤包括：将检测试纸平放，取待测血清样品50μL，加入样品垫，室温静置15min后，在紫外光的照射下根据以下情况判定结果：
试纸有效：在质控线出现绿色荧光线，即说明本试纸有效；
阴性：只在质控线出现绿色荧光线，在检测线不出现色线；
阳性：在质控线和检测线均出现一条绿色荧光线；
且荧光强度与GP5 IgY抗体含量成正比，即GP5 IgY抗体含量越高，荧光强度越深。
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