CN111560080A - 半枝莲聚糖、提取方法及在制备抗SARS-CoV-2药物中的应用 - Google Patents

半枝莲聚糖、提取方法及在制备抗SARS-CoV-2药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本方案公开了医药技术领域的半枝莲聚糖、提取方法及在制备抗SARS‑CoV‑2药物中的应用。制备半枝莲聚糖时，包括以下步骤：一、将干燥的半枝莲植株粉碎得到半枝莲粉末；二、向半枝莲粉末中加入去离子水，调节其pH值至4.6～4.8得到混合液，混合液加热至50～60℃，然后加入纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶酶解35～45min，得到酶解溶液；三、将酶解溶液加热至100℃～110℃并保持1～1.2h，然后冷却过滤得到过滤液；四、将过滤液加热浓缩得到浓缩液，然后通过流动水对浓缩液透析处理2～3d得到透析液；五、将透析液加热浓缩，离心，去除沉淀后，加入上清液5～6倍体积的95％乙醇，静置过夜醇沉得到醇沉液；六、对醇沉液进行离心处理得到沉淀，沉淀用无水乙醇和丙酮交替洗涤3～5次得到半枝莲聚糖。

Description

半枝莲聚糖、提取方法及在制备抗SARS-CoV-2药物中的应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，特别涉及半枝莲聚糖、提取方法及在制备抗SARS-CoV-2药物中的应用。
背景技术
2019新型冠状病毒，又称SARS-CoV-2。人体感染SARS-CoV-2后的常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。目前对于新型冠状病毒所致疾病没有特异治疗方法。
本次新冠肺炎病毒SARS-Cov-2属于典型的冠状病毒2-5，病毒粒子直径约60～220nm。病毒粒子外包着脂肪膜，膜表面有三种糖蛋白：刺突糖蛋白(S，Spike Protein)、小包膜糖蛋白(E，Envelope Protein)和膜糖蛋白(M，Membrane Protein)。其中，Spike蛋白是与靶细胞受体结合的位点，与靶细胞膜上的ACE2蛋白结合，具有结合细胞作用，是主要的抗原位点6-8。
S蛋白含有S1亚基和S2亚基，S1主要包含有受体结合区(receptor bindingdomain，RBD)，负责识别细胞的受体。S2含有膜融合过程所需的基本元件，包括一个内在的膜融合肽(fusion peptide)，两个7肽重复序列(heptad repeat，HR)，一个富含芳香族氨基酸的膜临近区域(membrane proximal external region，MPER)，以及跨膜区(transmembrane，TM)。
半枝莲，又名并头草、韩信草、牙刷草等，是唇形科黄芩属多年生草本植物。半枝莲全草入药，具有清热解毒、活血祛瘀、消肿止痛、抗癌等功能。性寒味酸，全草含多糖、甾族化合物、鞣质、维生素、微量元素及氨基酸等成分；有凉血解毒，散瘀止痛，消肿和清热利湿之功效。但当前未见任何关于半枝莲聚糖可用于抗SARS-CoV-2的报道。
发明内容
本发明意在提供半枝莲聚糖、提取方法及在制备抗SARS-CoV-2药物中的应用，以扩充抗SARS-CoV-2药物的来源。
本方案中的半枝莲聚糖的提取方法，包括以下步骤：
步骤一、将干燥的半枝莲植株粉碎得到半枝莲粉末；
步骤二、向半枝莲粉末中加入其12～15倍质量的去离子水，调节其pH值至4.6～4.8得到混合液，混合液加热至50～60℃，然后分别加入纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶酶解35～45min，得到酶解溶液；其中，纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶的添加量分别为半枝莲粉末质量的0.5％～0.8％、0.5％～1％、0.4％～0.7％；
步骤三、将酶解溶液加热至100℃～110℃并保持1～1.2h，然后冷却过滤得到过滤液；
步骤四、将过滤液加热浓缩得到浓缩液，然后通过流动水对浓缩液透析处理2～3d得到透析液；
步骤五、将透析液加热浓缩，离心，去除沉淀后，加入上清液5～6倍体积的95％乙醇，静置过夜醇沉得到醇沉液；
步骤六、对醇沉液进行离心处理得到沉淀，沉淀用无水乙醇和丙酮交替洗涤3～5次，洗涤后的沉淀即为半枝莲聚糖。
本方案通过选用纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶对半枝莲粉末进行酶解，可提高半枝莲多糖的提取率；对半枝莲进行酶解前，混合液的pH值为4.6～4.8，有助于提高酶的活性，从而减少酶解时间并有助于提高半枝莲聚糖的含量。另外，在对半枝莲粉末进行酶酶解后，通过加热、过滤、透析、醇沉、离心和洗涤的操作，使得半枝莲聚糖得到进一步纯化。
进一步，步骤四中，对浓缩液的透析处理通过透析袋进行，透析袋的截留分子量为4000Da。
进一步，步骤二中，纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶的添加量分别为半枝莲粉末质量的0.6％、0.6％、0.5％。采用该分量的纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶，有助于提高半枝莲聚糖的得率。
进一步，步骤二中，去离子水的质量为半枝莲粉末的14倍。采用该质量比的设置，在确保半枝莲粉末充分溶解的同时，可以避免去离子水过多而导致纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶与半枝莲粉末之间接触的不足。
进一步，步骤三中，酶解溶液的加热温度为105℃。采用105℃的温度对酶解溶液进行加热，可以使酶充分失活，同时又可避免或减少对其他物质性状的影响。
本发明还提供了依据上述提取方法制得的半枝莲聚糖。
另外，发明人通过ELISA实验检测半枝莲聚糖对SARS-CoV-2的抑制作用，测试表明半枝莲聚糖对冠状病毒具有一定的抑制作用。尤其是对SARS-CoV-2具有显著的抑制作用；可用于制备抗SARS-CoV-2药物或药物组合物中。
附图说明
图1为半枝莲聚糖抑制SARS-Cov-2-S蛋白与ACE2蛋白结合的结果柱状图；其中a为阴性对照组、b1代表实施例1制备的半枝莲聚糖，b2代表实施例2制备的半枝莲聚糖，b3代表实施例3制备的半枝莲聚糖。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
半枝莲聚糖的制备：
实施例1：半枝莲聚糖的提取方法，包括以下步骤：
步骤一、将干燥的半枝莲植株粉碎得到半枝莲粉末；
步骤二、向半枝莲粉末中加入其14倍质量的去离子水，调节其pH值至4.8得到混合液，混合液加热至55℃，然后分别加入纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶酶解40min，得到酶解溶液；其中，纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶的添加量分别为半枝莲粉末质量的0.6％、0.6％、0.5％；
步骤三、将酶解溶液加热至105℃并保持1h，然后冷却过滤得到过滤液；
步骤四、将过滤液加热浓缩得到浓缩液，然后通过流动水对浓缩液透析处理2d得到透析液；
步骤五、将透析液加热浓缩，离心，去除沉淀后，加入上清液6倍体积的95％乙醇，静置过夜醇沉得到醇沉液；
步骤六、对醇沉液进行离心处理得到沉淀，沉淀用无水乙醇和丙酮交替洗涤4次，洗涤后的沉淀即为半枝莲聚糖。
实施例2：半枝莲聚糖的提取方法，包括以下步骤：
步骤一、将干燥的半枝莲植株粉碎得到半枝莲粉末；
步骤二、向半枝莲粉末中加入其12倍质量的去离子水，调节其pH值至4.6得到混合液，混合液加热至60℃，然后分别加入纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶酶解45min，得到酶解溶液；其中，纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶的添加量分别为半枝莲粉末质量的0.5％、1％、0.7％；
步骤三、将酶解溶液加热至110℃并保持1h，然后冷却过滤得到过滤液；
步骤四、将过滤液加热浓缩得到浓缩液，然后通过流动水对浓缩液透析处理3d得到透析液；
步骤五、将透析液加热浓缩，离心，去除沉淀后，加入上清液5倍体积的95％乙醇，静置过夜醇沉得到醇沉液；
步骤六、对醇沉液进行离心处理得到沉淀，沉淀用无水乙醇和丙酮交替洗涤3次，洗涤后的沉淀即为半枝莲聚糖。
实施例3：半枝莲聚糖的提取方法，包括以下步骤：
步骤一、将干燥的半枝莲植株粉碎得到半枝莲粉末；
步骤二、向半枝莲粉末中加入其15倍质量的去离子水，调节其pH值至4.7得到混合液，混合液加热至50℃，然后分别加入纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶酶解35min，得到酶解溶液；其中，纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶的添加量分别为半枝莲粉末质量的0.8％、0.5％、0.4％；
步骤三、将酶解溶液加热至100℃并保持1.2h，然后冷却过滤得到过滤液；
步骤四、将过滤液加热浓缩得到浓缩液，然后通过流动水对浓缩液透析处理3d得到透析液；
步骤五、将透析液加热浓缩，离心，去除沉淀后，加入上清液6倍体积的95％乙醇，静置过夜醇沉得到醇沉液；
步骤六、对醇沉液进行离心处理得到沉淀，沉淀用无水乙醇和丙酮交替洗涤5次，洗涤后的沉淀即为半枝莲聚糖。
实施例1～3中，纤维素酶(40万U/g)购于山东隆科特酶制剂有限公司；木瓜蛋白酶(100万U/g)和果胶酶(2,000U/g)购于南宁庞博生物工程有限公司；透析袋购于上海绿鸟公司(分子量截留4500Da)；95％乙醇、无水乙醇和丙酮均购买于国药集团化学试剂有限公司。
1、半枝莲聚糖的抗SARS-CoV-2性能(ELISA法)
1.1、将10ug/mL ACE2蛋白(用coating buffer:0.2M碳酸钠，pH 9.4稀释)铺在酶标板96孔板中(每孔100uL)，4℃过夜孵育；
1.2、弃去coating buffer，用200uL wash buffer(25mM Tris,0.15Mm NaCl,0.05％Tween 20,pH 7.2)洗涤孔三次，每次5min；
1.3、加入300uL blocking buffer(2％BSA in wash buffer)室温孵育2h；
1.4、对照组：加入100uL 750pg/mL的生物素标记的2019新型冠状病毒S1蛋白；样品组：加入100uL生物素标记的2019新型冠状病毒S1蛋白(750pg/mL)和不同浓度的半枝莲聚糖(5μg/ml、20μg/ml)，室温反应1h；本步骤中的半枝莲聚糖来自实施例1～3，且实施例1～3制备的半枝莲聚糖单独使用，不相互混合。
1.5、弃去孔中液体，洗涤孔三次，每次5min；
1.6、稀释Streptavidin-HRP至200ng/mL，并取100uL加入到孔中，室温反应1h；
1.7、弃去孔中液体，洗涤孔6次，每次5min；
1.8、加入100uL TMB，避光孵育25-35min，直至出现较明显的蓝色液体；
1.9、加入50uL stop solution(2M硫酸)终止反应，此时颜色由蓝变黄，酶标仪测定A450 nm。
2、实验结果
按照ELISA实验流程，考察半枝莲聚糖对SARS-Cov-2-S蛋白与ACE2蛋白结合的影响，结果如附图1所示；从图1中可以看出；半枝莲聚糖对SARS-Cov-2-S蛋白与ACE2蛋白的结合具有显著的抑制作用。说明半枝莲聚糖对于抑制SARS-CoV-2具有较好的效果；可广泛应用于制备抗SARS-CoV-2的药物或药物组合物中。
当然，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.半枝莲聚糖的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、将干燥的半枝莲植株粉碎得到半枝莲粉末；
步骤二、向半枝莲粉末中加入其12～15倍质量的去离子水，调节其pH值至4.6～4.8得到混合液，混合液加热至50～60℃，然后分别加入纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶酶解35～45min，得到酶解溶液；其中，纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶的添加量分别为半枝莲粉末质量的0.5％～0.8％、0.5％～1％、0.4％～0.7％；
步骤三、将酶解溶液加热至100℃～110℃并保持1～1.2h，然后冷却过滤得到过滤液；
步骤四、将过滤液加热浓缩得到浓缩液，然后通过流动水对浓缩液透析处理2～3d得到透析液；
步骤五、将透析液加热浓缩，离心，去除沉淀后，加入上清液5～6倍体积的95％乙醇，静置过夜醇沉得到醇沉液；
步骤六、对醇沉液进行离心处理得到沉淀，沉淀用无水乙醇和丙酮交替洗涤3～5次，洗涤后的沉淀即为半枝莲聚糖。
2.根据权利要求1所述的半枝莲聚糖的提取方法，其特征在于：步骤四中，对浓缩液的透析处理通过透析袋进行，透析袋的截留分子量为4000Da。
3.根据权利要求2所述的半枝莲聚糖的提取方法，其特征在于：步骤二中，纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶的添加量分别为半枝莲粉末质量的0.6％、0.6％、0.5％。
4.根据权利要求3所述的半枝莲聚糖的提取方法，其特征在于：步骤二中，去离子水的质量为半枝莲粉末的14倍。
5.根据权利要求4所述的半枝莲聚糖的提取方法，其特征在于：步骤三中，酶解溶液的加热温度为105℃。
6.根据权利要求1～5任一项所述的半枝莲聚糖的提取方法得到的半枝莲聚糖。
7.根据权利要求6所述的半枝莲聚糖在制备抗冠状病毒药物或药物组合物中的应用。
8.根据权利要求7所述的半枝莲聚糖在制备抗SARS-CoV-2药物或药物组合物中的应用。
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