CN111454376B

CN111454376B - 一种凤仙花聚糖、提取方法及在制备抗SARS-CoV-2药物中的应用

Info

Publication number: CN111454376B
Application number: CN202010427262.1A
Authority: CN
Inventors: 丁侃; 陈霞; 孙成新; 姚晓东; 王秋雨; 张艳丽
Original assignee: Anique Biological Medicine Suzhou Co ltd
Current assignee: Anique Biological Medicine Suzhou Co ltd
Priority date: 2020-05-19
Filing date: 2020-05-19
Publication date: 2022-01-04
Anticipated expiration: 2040-05-19
Also published as: CN111454376A

Abstract

本方案公开了医药技术领域的一种凤仙花聚糖的提取方法及在制备抗SARS‑CoV‑2药物中的应用。凤仙花聚糖提取时包括以下步骤：一、将干燥的凤仙花植株粉碎得到凤仙花粉末；二、向凤仙花粉末中加入其18～22倍质量的去离子水得到混合液，混合液加热后加入纤维素酶、淀粉酶和蛋白水解酶酶解1～1.5h，得到酶解溶液；三、将酶解溶液加热至100℃～110℃并保持1～1.2h，然后冷却过滤得到过滤液；四、将过滤液加热浓缩得到浓缩液，然后透析处理2～3d得到透析液；五、将透析液加热浓缩，离心，去除沉淀后，加入上清液5～6倍体积的95％乙醇，静置过夜醇沉得到醇沉液；六、对醇沉液进行离心处理得到沉淀，沉淀用无水乙醇和丙酮交替洗涤3～5次，洗涤后的沉淀即为凤仙花聚糖。

Description

一种凤仙花聚糖、提取方法及在制备抗SARS-CoV-2药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，特别涉及一种凤仙花聚糖、提取方法及在制备抗SARS-CoV-2药物中的应用。

背景技术

2019新型冠状病毒，又称SARS-CoV-2。人体感染SARS-CoV-2后的常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。目前对于新型冠状病毒所致疾病没有特异治疗方法。

本次新冠肺炎病毒SARS-Cov-2属于典型的冠状病毒2-5，病毒粒子直径约60～220nm。病毒粒子外包着脂肪膜，膜表面有三种糖蛋白：刺突糖蛋白(S，Spike Protein)、小包膜糖蛋白(E，Envelope Protein)和膜糖蛋白(M，Membrane Protein)。其中，Spike蛋白是与靶细胞受体结合的位点，与靶细胞膜上的ACE2蛋白结合，具有结合细胞作用，是主要的抗原位点6-8。

S蛋白含有S1亚基和S2亚基，S1主要包含有受体结合区(receptor bindingdomain，RBD)，负责识别细胞的受体。S2含有膜融合过程所需的基本元件，包括一个内在的膜融合肽(fusion peptide)，两个7肽重复序列(heptad repeat，HR)，一个富含芳香族氨基酸的膜临近区域(membrane proximal external region，MPER)，以及跨膜区(transmembrane，TM)。

凤仙花，又名金凤花、灯盏花、好女儿花、指甲花等，为双子叶植物纲、牻牛儿苗目、凤仙花科、凤仙花属一年生草本花卉，全株分根、茎、叶子、花、果实和种子六个部分。因其花头、翅、尾、足俱翘然如凤状，故又名金凤花。凤仙花是著名中药。主要用于活血消胀，祛风除湿，活血止痛，解毒杀虫；也用于治疗跌打损伤、麻木酸痛、骨折、痈疽疮毒等。但当前未见任何关于凤仙花聚糖可用于抗SARS-CoV-2的报道。

发明内容

本发明意在提供一种凤仙花聚糖、提取方法及在制备抗SARS-CoV-2药物中的应用，以扩充抗SARS-CoV-2药物的来源。

本方案中的一种凤仙花聚糖的提取方法，包括以下步骤：

步骤一、将干燥的凤仙花植株粉碎得到凤仙花粉末；

步骤二、向凤仙花粉末中加入其18～22倍质量的去离子水得到混合液，混合液加热至50～60℃，然后分别加入纤维素酶、淀粉酶和蛋白水解酶酶解1～1.5h，得到酶解溶液；其中，纤维素酶、淀粉酶和蛋白水解酶的添加量分别为凤仙花粉末质量的2.8％～3.2％、1％～1.3％、0.4％～0.6％；

步骤三、将酶解溶液加热至100℃～110℃并保持1～1.2h，然后冷却过滤得到过滤液；

步骤四、将过滤液加热浓缩得到浓缩液，然后通过流动水对浓缩液透析处理2～3d得到透析液；

步骤五、将透析液加热浓缩，离心，去除沉淀后，加入上清液5～6倍体积的95％乙醇，静置过夜醇沉得到醇沉液；

步骤六、对醇沉液进行离心处理得到沉淀，沉淀用无水乙醇和丙酮交替洗涤3～5次，洗涤后的沉淀即为凤仙花聚糖。

本方案通过选用纤维素酶、淀粉酶和蛋白水解酶对凤仙花粉末进行酶解，可提高凤仙花多糖的提取率；在对凤仙花粉末进行酶酶解后，通过加热、过滤、透析、醇沉、离心和洗涤的操作，使得凤仙花聚糖得到进一步纯化。

进一步，步骤四中，对浓缩液的透析处理通过透析袋进行，透析袋的截留分子量为4500Da。

进一步，步骤二中，去离子水的质量为凤仙花粉末的20倍。采用该质量比的设置，在确保凤仙花粉末充分溶解的同时，可以避免去离子水过多而导致纤维素酶、淀粉酶和蛋白水解酶与凤仙花粉末之间接触的不足。

进一步，步骤三中，酶解溶液的加热温度为105℃。采用105℃的温度对酶解溶液进行加热，可以使酶充分失活，同时又可避免或减少对其他物质性状的影响。

本发明还提供了依据上述提取方法制得的凤仙花聚糖。

另外，发明人通过ELISA实验检测凤仙花聚糖对SARS-CoV-2的抑制作用，测试表明凤仙花聚糖对冠状病毒具有一定的抑制作用。尤其是对SARS-CoV-2具有显著的抑制作用；可用于制备抗SARS-CoV-2药物或药物组合物中。

附图说明

图1为凤仙花聚糖抑制SARS-Cov-2-S蛋白与ACE2蛋白结合的结果柱状图；其中a为阴性对照组、b1代表实施例1制备的凤仙花聚糖，b2代表实施例2制备的凤仙花聚糖，b3代表实施例3制备的凤仙花聚糖。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细说明：

凤仙花聚糖的制备：

实施例1：一种凤仙花聚糖的提取方法，包括以下步骤：

步骤一、将干燥的凤仙花植株粉碎得到凤仙花粉末；

步骤二、向凤仙花粉末中加入其20倍质量的去离子水得到混合液，混合液加热至58℃，然后分别加入纤维素酶、淀粉酶和蛋白水解酶酶解1.5h，得到酶解溶液；其中，纤维素酶、淀粉酶和蛋白水解酶的添加量分别为凤仙花粉末质量的3.2％、1.2％、0.5％；

步骤三、将酶解溶液加热至105℃并保持1.2h，然后冷却过滤得到过滤液；

步骤四、将过滤液加热浓缩得到浓缩液，将浓缩液放入透析袋中，通过流动水对透析袋内的浓缩液透析处理2d得到透析液；透析袋的截留分子量为4500Da；

步骤五、将透析液加热浓缩，离心，去除沉淀后，加入上清液6倍体积的95％乙醇，静置过夜醇沉得到醇沉液；

步骤六、对醇沉液进行离心处理得到沉淀，沉淀用无水乙醇和丙酮交替洗涤4次，洗涤后的沉淀即为凤仙花聚糖。

实施例2：一种凤仙花聚糖的提取方法，包括以下步骤：

步骤一、将1kg干燥的凤仙花植株粉碎得到凤仙花粉末；

步骤二、向凤仙花粉末中加入其22倍质量的去离子水得到混合液，混合液加热至50℃，然后分别加入纤维素酶、淀粉酶和蛋白水解酶酶解1.2h，得到酶解溶液；其中，纤维素酶、淀粉酶和蛋白水解酶的添加量分别为凤仙花粉末质量的3％、1.3％、0.4％；

步骤三、将酶解溶液加热至110℃并保持1h，然后冷却过滤得到过滤液；

步骤四、将过滤液加热浓缩得到浓缩液，将浓缩液放入透析袋中，通过流动水对透析袋内的浓缩液透析处理3d得到透析液；透析袋的截留分子量为4500Da；

步骤五、将透析液加热浓缩，离心，去除沉淀后，加入上清液5倍体积的95％乙醇，静置过夜醇沉得到醇沉液；

步骤六、对醇沉液进行离心处理得到沉淀，沉淀用无水乙醇和丙酮交替洗涤5次，洗涤后的沉淀即为凤仙花聚糖。

实施例3：一种凤仙花聚糖的提取方法，包括以下步骤：

步骤一、将干燥的凤仙花植株粉碎得到凤仙花粉末；

步骤二、向凤仙花粉末中加入其18倍质量的去离子水得到混合液，混合液加热至60℃，然后分别加入纤维素酶、淀粉酶和蛋白水解酶酶解1h，得到酶解溶液；其中，纤维素酶、淀粉酶和蛋白水解酶的添加量分别为凤仙花粉末质量的2.8％、1％、0.6％；

步骤三、将酶解溶液加热至100℃并保持1.1h，然后冷却过滤得到过滤液；

步骤四、将过滤液加热浓缩得到浓缩液，将浓缩液放入透析袋中，通过流动水对透析袋内的浓缩液透析处理2.5d得到透析液；透析袋的截留分子量为4500Da；

步骤六、对醇沉液进行离心处理得到沉淀，沉淀用无水乙醇和丙酮交替洗涤3次，洗涤后的沉淀即为凤仙花聚糖。

实施例1～3中，纤维素酶(40万U/g)购于山东隆科特酶制剂有限公司；蛋白水解酶(100万U/g)和淀粉酶(2,000U/g)购于南宁庞博生物工程有限公司；透析袋购于上海绿鸟公司(分子量截留4500Da)；95％乙醇、无水乙醇和丙酮均购买于国药集团化学试剂有限公司。

1、凤仙花聚糖的抗SARS-CoV-2性能(ELISA法)

1.1、将10ug/mL ACE2蛋白(用coating buffer:0.2M碳酸钠，pH 9.4稀释)铺在酶标板96孔板中(每孔100uL)，4℃过夜孵育；

1.2、弃去coating buffer，用200uL wash buffer(25mM Tris,0.15Mm NaCl,0.05％Tween 20,pH 7.2)洗涤孔三次，每次5min；

1.3、加入300uL blocking buffer(2％BSA in wash buffer)室温孵育2h；

1.4、对照组：加入100uL 750pg/mL的生物素标记的2019新型冠状病毒S1蛋白；样品组：加入100uL生物素标记的2019新型冠状病毒S1蛋白(750pg/mL)和不同浓度的凤仙花聚糖(5μg/ml、20μg/ml)，室温反应1h；本步骤中的凤仙花聚糖来自实施例1～3，且实施例1～3制备的凤仙花聚糖单独使用，不相互混合。

1.5、弃去孔中液体，洗涤孔三次，每次5min；

1.6、稀释Streptavidin-HRP至200ng/mL，并取100uL加入到孔中，室温反应1h；

1.7、弃去孔中液体，洗涤孔6次，每次5min；

1.8、加入100uL TMB，避光孵育25-35min，直至出现较明显的蓝色液体；

1.9、加入50uL stop solution(2M硫酸)终止反应，此时颜色由蓝变黄，酶标仪测定A₄₅₀ nm。

2、实验结果

按照ELISA实验流程，考察凤仙花聚糖对SARS-Cov-2-S蛋白与ACE2蛋白结合的影响，结果如附图1所示；从图1中可以看出；凤仙花聚糖对SARS-Cov-2-S蛋白与ACE2蛋白的结合具有显著的抑制作用。说明凤仙花聚糖对于抑制SARS-CoV-2具有较好的效果；可广泛应用于制备抗SARS-CoV-2的药物或药物组合物中。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种凤仙花聚糖在制备抗SARS-CoV-2药物中的应用，其特征在于：凤仙花聚糖的提取方法包括以下步骤：

步骤一、将干燥的凤仙花植株粉碎得到凤仙花粉末；

步骤二、向凤仙花粉末中加入其18~22倍质量的去离子水得到混合液，混合液加热至50~60℃，然后分别加入纤维素酶、淀粉酶和蛋白水解酶酶解1~1.5h，得到酶解溶液；其中，纤维素酶、淀粉酶和蛋白水解酶的添加量分别为凤仙花粉末质量的2.8%~3.2%、1%~1.3%、0.4%~0.6%；

步骤三、将酶解溶液加热至100℃~110℃并保持1~1.2h，然后冷却过滤得到过滤液；

步骤四、将过滤液加热浓缩得到浓缩液，然后通过流动水对浓缩液透析处理2~3d得到透析液；

步骤五、将透析液加热浓缩，离心，去除沉淀后，加入上清液5~6倍体积的95%乙醇，静置过夜醇沉得到醇沉液；

步骤六、对醇沉液进行离心处理得到沉淀，沉淀用无水乙醇和丙酮交替洗涤3~5 次，洗涤后的沉淀即为凤仙花聚糖。

2.根据权利要求1所述的一种凤仙花聚糖在制备抗SARS-CoV-2药物中的应用，其特征在于：步骤四中，对浓缩液的透析处理通过透析袋进行，透析袋的截留分子量为4500Da。

3.根据权利要求2所述的一种凤仙花聚糖在制备抗SARS-CoV-2药物中的应用，其特征在于：步骤二中，去离子水的质量为凤仙花粉末的20倍。

4.根据权利要求3所述的一种凤仙花聚糖在制备抗SARS-CoV-2药物中的应用，其特征在于：步骤三中，酶解溶液的加热温度为105℃。