CN112592415B - 昆布多糖及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及昆布多糖及其制备方法和应用，以摩尔百分比计，所述昆布多糖的单糖组成为甘露糖醛酸89.3％和古洛糖醛酸10.7％。该昆布多糖及包含其的昆布多糖提取物具有治疗或者预防新型冠状病毒所导致的肺炎等的潜能，有望开发成为一种全新的治疗或预防新冠病毒的糖类药物。

Description

昆布多糖及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及药物技术领域，特别涉及昆布多糖及其制备方法和应用。
背景技术
昆布(Ecklonia kurome)，亦称“黑菜”、“鹅掌菜”、“五掌菜”等。属于海带科植物，海带或翅藻科植物黑昆布的叶状体。孢子体大型，褐色、革质，高30-100cm，分叶片、柄部、固着器、固着器假根状。假根两叉式分支，柄部圆柱状，近叶片部渐扁平，叶片两侧羽状或复羽状分支，中部稍厚，居间生长，长1-12cm，粗3-7mm，粗锯齿叶缘。游动孢子生于叶片两面，有明显的不等世代交替。生长于温带海洋中，主治瘿瘤，瘰疬，睾丸肿痛，痰饮水肿。
发明内容
本发明提供了一种昆布多糖及其制备方法和应用。
一种昆布多糖，以摩尔百分比计，所述昆布多糖的单糖组成为甘露糖醛酸89.3％和古洛糖醛酸10.7％。
在其中一实施例中，所述昆布多糖包含第一单元、第二单元和第三单元，所述第一单元和所述第二单元之间形成醚键，所述第二单元和所述第三单元之间形成醚键；
其中，所述第一单元为(G-G)a，所述第二单元为(G-M)b，所述第三单元为(M-M)c，其中，G表示古洛糖醛酸，M表示甘露糖醛酸，a、b和c为大于或等于1的整数。
在其中一实施例中，a和b各自独立地为1、2、3或4；c为5、6、7、8或9。
在其中一实施例中，所述昆布多糖具有以下结构：
Figure BDA0002883213530000021
在其中一实施例中，所述昆布多糖的分子量范围在20-30kDa之间，优选为27.9kDa。
在其中一实施例中，所述昆布多糖的红外光谱图在以下波长处具有伸缩振动峰：3453.88cm-1±0.2cm-1、2935.13cm-1±0.2cm-1、1616.06cm-1±0.2cm-1、1417.42cm-1±0.2cm-1、1035.59cm-1±0.2cm-1、956.52cm-1±0.2cm-1、890.95cm-1±0.2cm-1、821.53cm-1±0.2cm-1、792.12cm-1±0.2cm-1；或
所述昆布多糖的1H NMR谱图在以下位置具有峰：5.12ppm±0.02ppm、4.04ppm±0.02ppm、3.95ppm±0.02ppm、4.29ppm±0.02ppm、4.53ppm±0.02ppm\3.87ppm±0.02ppm、3.93ppm±0.02ppm、3.83ppm±0.02ppm、4.10ppm±0.02ppm、4.73ppm±0.02ppm；和/或
所述昆布多糖的13C NMR谱图在以下位置具有峰：102.45ppm±0.2ppm、65.87ppm±0.2ppm、78.46ppm±0.2ppm、81.2ppm±0.2ppm、68.57ppm±0.2ppm、176.58ppm±0.2ppm、101.22ppm±0.2ppm、71.12ppm±0.2ppm、72.55ppm±0.2ppm、79.06ppm±0.2ppm、76.69ppm±0.2ppm、175.96ppm±0.2ppm。
上述昆布多糖的制备方法，包括以下步骤：
提供昆布多糖提取物，所述昆布多糖提取物为昆布的水提取物；
采用柱分离技术将所述昆布多糖提取物进行分离，获得上述的昆布多糖。
在其中一实施例中，采用DEAE SepharoseTM Fast Flow阴离子交换柱将所述昆布多糖提取物进行分离。
在其中一实施例中，所述制备方法包括以下步骤：
将昆布和水混合，在温度为80℃-100℃的条件下进行提取，得到提取液；
将所述提取液进行浓缩，得到浓缩物；
向所述浓缩物中加入乙醇，有固体析出，收集固体，所述固体为昆布多糖提取物；
将所述昆布多糖提取物配制成昆布多糖溶液，并加入所述DEAE SepharoseTM FastFlow阴离子交换柱中；
依次采用水和浓度梯度递增的NaCl溶液进行梯度洗脱，收集流出液；
将所述流出液采用硫酸-苯酚法显色并用酶标仪在490nm下检测其吸光度；
用吸光度和洗脱体积绘制洗脱曲线，根据所述洗脱曲线，收集所需的昆布多糖组分；
将所述昆布多糖组分进行浓缩、透析、干燥，制得所述昆布多糖。
上述昆布多糖在制备抗病毒药物中的应用。
一种昆布多糖提取物的应用，所述应用是指昆布多糖提取物在制备抗病毒药物中的应用，所述昆布多糖提取物为昆布的水提取物。
在其中一实施例中，所述昆布多糖提取物主要由以下方法制备而成：
提供昆布；
采用水提法提取所述昆布，得到提取液；
采用醇沉淀法将所述提取液进行纯化，得到的沉淀物质为所述昆布多糖提取物。
在其中一实施例中，所述抗病毒药物为抗冠状病毒药物，优选为抗2019新型冠状病毒药物。
有益效果：
本发明技术人员以昆布为原料获得了一种褐藻胶，通过体外生物活性实验证明，本发明的昆布多糖能够与SARS-CoV-2RNA复制依赖的核糖核酸聚合酶成熟所需的关键因子之一3CLpro蛋白结合，结合常数Kd值为4.23×10-6M；同时其还能够竞争性地抑制SARS-CoV-2的S1蛋白与肺血管紧张素酶ACE2的结合，半数抑制浓度IC50值为56.06μg/mL。因此本发明的昆布多糖及包含其的昆布多糖提取物具治疗或者预防新型冠状病毒所导致的肺炎等的潜能，有望开发成为一种全新的治疗或预防新冠病毒的糖类药物。
附图说明
图1为制备实施例1中制得的昆布多糖的高效液相色谱的纯度图；
图2为制备实施例1中制得的昆布多糖的单糖组成分析图；
图3为制备实施例1中制得的昆布多糖的红外谱图；
图4为制备实施例1中制得的昆布多糖的1H NMR和13C NMR图谱；
图5为制备实施例1中制得的昆布多糖的COSY、HSQC和HMBC图谱；
图6为ELISA方法分析昆布多糖竞争性干预ACE2与SARS-CoV-2的S蛋白体外结合图谱；
图7为ITC方法分析昆布多糖与新型冠状病毒(SARS-CoV-2)3CLpro蛋白的体外结合图谱。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
术语解释
本发明的多糖、组合物或药物的剂型和施用方式没有特别限制。代表性的施用方式包括但并不限于：口服、瘤内、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)注射、和局部给药。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，具体例如，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物。除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。如悬浮液可包含悬浮剂，具体例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物。
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，以及用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水或非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
用于局部给药的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。由活性成分在无菌条件下与药学上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合而成。
本发明的昆布多糖、组合物或药物还可以做成中成药的形式。中成药的剂型包括但不限于丸剂、散剂、膏剂、片剂、颗粒剂(冲剂)、锭剂、胶囊剂、水剂、酊剂；
(1)丸剂
丸剂是药材细粉或药材提取物加适宜粘合剂或辅料，制成的球形或类球形的固体制剂，是中成药最古老的剂型之一。根据粘合剂的不同丸剂又分为蜜丸、水蜜丸、水丸、糊丸、浓缩丸、微丸等类型。优选使用浓缩丸。浓缩丸是全部药材或部分药材的煎液或提取液，与适宜的辅料或药物细粉加适宜的粘合剂制成。根据粘合剂的不同，又分为浓缩蜜丸、浓缩水丸、浓缩水蜜丸。浓缩丸体积小，药物有效成分含量高，易于服用，在体内溶化吸收比较缓慢。
在一种优选的实施方式中，将全部药材或部分药材的煎液或提取液，与辅料或药物细粉加粘合剂制成浓缩丸。优选地，将全部药材煎液或提取液与粘合剂和可选的辅料制成浓缩丸。
(2)散剂
散剂是一种或多种药材混合制成的粉末状制剂，分内服散剂和外用散剂，是我国古代剂型之一。散剂治疗范围广，服用后分散快，奏效迅速，且具有制作方便、携带方便、节省药材等优点。
(3)膏剂
膏剂系药物剂型之一。膏剂是将药物用水或植物油煎熬浓缩而成的剂型。有内服和外用两种。内服膏通常又分流浸膏、浸膏、煎膏三种；外用膏有软膏、硬膏两种。其中内服煎膏和外用软膏是膏剂中常见的剂型。内服的煎膏又叫膏滋，是把药物加水煎熬，滤滓，加入冰糖、蜂蜜等，熬成稠厚的膏，可长期服用。常用于慢性疾病或身体虚弱者。
(4)片剂
片剂是药材细粉或提取物与适宜的辅料或药材细粉压制而成的片状制剂，分浸膏片、半浸膏片和全粉片等，是常用的现代剂型之一。片剂体积小，用量准确，易崩解生效快，且具有生产效率高、成本低、服用及储运方便的优点。片剂适用于各种疾病。本发明优选使用浸膏片。
(5)颗粒剂
颗粒剂(冲剂)是药材提取物与适宜的辅料或与药材细粉制成的颗粒状制剂，是在汤剂、散剂和糖浆剂的基础上发展起来的新剂型。有颗粒状和块状两种，分为可溶性、混悬性、泡腾性及含糖型、无糖型等不同类型。颗粒剂体积小，重量轻，服用简单，口感好，作用迅速，多用于补益、止咳、清热等作用的药物。优选地，制备时采用水提取物(煎液)制备。
(6)锭剂
锭剂是药材细粉与适量粘合剂如蜂蜜、糯米粉或利用药材本身的粘性制成规定形状的固体制剂。可供内服或外用，内服作用与糊丸接近，外用多用水或醋磨汁后涂敷患处。锭剂型大多作噙化之用。优选地，本发明的锭剂为内服锭剂。
(7)胶囊剂
胶囊剂包括硬胶囊剂和软胶囊剂。
硬胶囊剂是将适量的药材提取物、药材提取物加药粉或辅料制成均匀的粉末或颗粒，填充于硬胶囊中而制成的剂型。主要是口服。硬胶囊外观整洁美观，易于吞服，可掩盖药物的不良嗅味，崩解快，吸收好。适用于对光敏感、不稳定或遇湿、热不稳定的药物，或有特异气味的药物，或需要定时定位释放的药物。儿童用药、对胃粘膜刺激性强的药物不宜制成胶囊剂。
软胶囊剂是将油类或对明胶等囊材无溶解作用的液体药物或混悬液封闭于囊材内制成的剂型。特点与硬胶囊相似。硬胶囊和软胶囊经过适宜方法处理或用其他药用高分子材料加工，使囊壳不溶于胃液，但在肠液中崩解释放活性成分，为肠溶胶囊。优选地，本发明的胶囊为将煎液或提取液获得的药材提取物加辅料制成均匀的粉末或颗粒，填充于硬胶囊中而制成的剂型。
(8)酊剂
酊剂是药物用规定浓度的乙醇浸出或溶解制成的澄清液体制剂，也可以用流浸膏稀释制成。分内服和外用两种。酊剂制备无需加热，成分较纯净，有效成分含量高，剂量准确，吸收迅速，适宜于制备含有挥发性成分或不耐热成分的制剂。优选地，本发明的酊剂为内服酊剂。
详细解释
本发明第一方面提供了一种昆布多糖，以摩尔百分比计，昆布多糖的单糖组成为甘露糖醛酸89.3％和古洛糖醛酸10.7％。
在一实施例中，昆布多糖包含第一单元、第二单元和第三单元，所述第一单元和所述第二单元之间形成醚键，所述第二单元和所述第三单元之间形成醚键；
其中，所述第一单元为(G-G)a，所述第二单元为(G-M)b，所述第三单元为(M-M)c，其中，G表示古洛糖醛酸，M表示甘露糖醛酸，a、b和c为大于或等于1的整数。
可理解的，本发明中G-G表示古洛糖醛酸和古洛糖醛酸之间通过化学键(例如醚键)连接，同样，G-M表示古洛糖醛酸和甘露糖醛酸之间通过化学键(例如醚键)连接，M-M表示甘露糖醛酸和甘露糖醛酸之间通过化学键(例如醚键)连接。
可理解的，本发明中第一单元的G可以和第二单元的G之间通过醚键连接，第二单元的M与第三单元的M之间通过醚键连接，即(G-G)a-(G-M)b-(M-M)c，也可以第一单元的G可以和第二单元的M之间通过醚键连接，第二单元的G与第三单元的M通过醚键连接，即(G-G)a-(M-G)b-(M-M)c。
在其中一实施例中，a和b各自独立地为1、2、3或4。
在其中一实施例中，c为5、6、7、8或9。
在其中一实施例中，所述昆布多糖的分子量范围在20-30kDa之间，优选为27.9kDa。
在其中一实施例中，昆布多糖具有以下结构：
Figure BDA0002883213530000081
在其中一实施例中，昆布多糖的红外光谱图在以下波长处具有伸缩振动峰：3453.88cm-1±0.2cm-1、2935.13cm-1±0.2cm-1、1616.06cm-1±0.2cm-1、1417.42cm-1±0.2cm-1、1035.59cm-1±0.2cm-1、956.52cm-1±0.2cm-1、890.95cm-1±0.2cm-1、821.53cm-1±0.2cm-1、792.12cm-1±0.2cm-1。
在一实施例中，昆布多糖的1H NMR谱图在以下位置具有峰：5.12ppm±0.02ppm、4.04ppm±0.02ppm、3.95ppm±0.02ppm、4.29ppm±0.02ppm、4.53ppm±0.02ppm、3.87ppm±0.02ppm、3.93ppm±0.02ppm、3.83ppm±0.02ppm、4.10ppm±0.02ppm、4.73ppm±0.02ppm。
在一实施例中，昆布多糖的1H NMR谱图如图4中B所示。
在一实施例中，昆布多糖的13C NMR谱图在以下位置具有峰102.45ppm±0.2ppm、65.87ppm±0.2ppm、78.46ppm±0.2ppm、81.2ppm±0.2ppm、68.57ppm±0.2ppm、176.58ppm±0.2ppm、101.22ppm±0.2ppm、71.12ppm±0.2ppm、72.55ppm±0.2ppm、79.06ppm±0.2ppm、76.69ppm±0.2ppm、175.96ppm±0.2ppm。
在一实施例中，昆布多糖的13C NMR谱图如图4中A所示。
本发明第二方面提供了上述第一方面的昆布多糖的制备方法，包括以下步骤：
S110：提供昆布多糖提取物，其中，昆布多糖提取物为昆布的水提物；
可理解的，本发明所述的昆布多糖提取物是指对昆布进行提取所得到的物质，水提物是指用水进行提取所得到的组分，可以为固体也可以为液体，应理解为均在本发明的保护范围内。本发明的昆布多糖提取物可以采用现有方法进行制备，例如：煎煮法、低温高压提取技术、低温萃取技术、复合式微波萃取技术和超临界二氧化碳萃取分离技术等，不应理解为对本发明的限制。在一实施例中，采用加热煎煮法获取昆布多糖提取物。
进一步地，步骤S110包括以下步骤：
S111：将昆布和水混合，在温度为80℃-100℃的条件下进行提取，得到提取液。
进一步地，步骤S111中，昆布和水的质量比约为(8-14):1，优选为12:1；
进一步地，步骤S111中，提取1-3次(优选2次)，每次3-5h(优选4h)。
进一步地，步骤S111中，将昆布和水加热煎煮后，还包括过滤步骤，以获得提取液。
S112：将提取液进行浓缩，得到浓缩物。
进一步地，步骤S112中，浓缩液用3,500kDa的透析袋包裹，用自来水进行透析，历时40-60h(优选48h)。
S113：向透析后的提取液中加入乙醇(优选为95％的工业乙醇)，有沉淀析出，自然静置过夜，收集沉淀，即为昆布粗多糖。
进一步地，步骤S113中，每1mL的提取液加入5mL的95％的工业乙醇。
S120：采用柱分离技术将昆布粗多糖进行分离，获得第一方面所述的昆布多糖。
进一步地，步骤S120中采用DEAE SepharoseTM Fast Flow阴离子交换柱进行分离。
进一步地，步骤S120包括以下步骤：
S121:将昆布粗多糖配制成昆布多糖溶液，并加入DEAE SepharoseTM Fast Flow阴离子交换柱中；
进一步地，步骤S121中，每1mg昆布多糖提取物加入0.05mL-0.15mL的去离子水。
S122：依次采用水和浓度梯度递增的NaCl溶液进行梯度洗脱，收集流出液。
进一步地，步骤S122中，依次采用去离子水和0.05M的NaCl溶液、0.1M的NaCl溶液和0.2M的NaCl溶液进行梯度洗脱。
进一步地，步骤S122中，流速为0.5mL/min-1mL/min；更进一步地，流速为0.7mL/min-0.9mL/min。
S123：将流出液采用硫酸-苯酚法显色并用酶标仪在490nm下检测其吸光度。
S124：用吸光度和洗脱体积绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集所需的昆布多糖组分。
进一步地，步骤S124的目标昆布多糖组分在0.2M洗脱液洗脱的组分中。
S125：将昆布多糖组分进行浓缩、透析、干燥。
进一步地，采用截留分子量为3,500kDa的透析袋进行透析；更进一步地，透析时间为24-72h。
进一步地，可以采用真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥的方法进行干燥；优选冷冻干燥的方法进行干燥。
本发明第三方面提供了第一方面的昆布多糖在制备抗病毒药物中的应用。
在一实施例中，抗病毒药物为抗新冠状病毒药物；优选为抗2019新型冠状病毒(2019-nCoV)药物。
3CLpro蛋白是SARS-CoV-2RNA复制依赖的核糖核酸聚合酶成熟所需的关键因子之一。因此，3CLpro已被认为是治疗冠状病毒的药物靶标之一。本发明技术人员采用等温滴定量热法(ITC)分析了本发明的昆布多糖与新型冠状病毒(SARS-CoV-2)3CLpro蛋白的体外结合实验。结果表明昆布多糖与3CLpro蛋白的结合常数Kd值为4.23×10-6M。
另外，目前ACE2是科学家公认的SARS-CoV-2的结合受体，因此如果化合物可以有效的干预SARS-CoV-2与ACE2的结合，即可以有效预防或治疗SARS-CoV-2的感染。本发明技术人员采用酶联免疫吸附实验(ELISA)分析了昆布多糖竞争性干预肺血管紧张素酶(Angiotensin-Converting Enzyme 2，简称“ACE2”)与SARS-CoV-2的棘突蛋白(Spikeprotein,，简称“S蛋白”)的S1体外结合实验(S1介导病毒入侵宿主)。结果表明昆布多糖可以竞争性干预ACE2与SARS-CoV-2的S1蛋白结合，半抑制浓度(IC50)值为56.06μg/mL。综上，本发明的昆布多糖具有治疗冠状病毒，特别是2019新型冠状病毒的潜能，特别适用于制备抗冠状病毒药物。
本发明第四方面提供了一种药物，包括：
1)第一方面的昆布多糖；
2)药学上可接受辅料。
进一步地，药物的剂型为胶囊剂、片剂、丸剂、散剂或颗粒剂。
本发明第五方面提供了一种治疗或预防病毒感染疾病的方法，包括向待施加对象施加第四方面所述的药物的步骤。进一步地，待施加对象为哺乳动物；更进一步地，待施加对象为人。进一步地，病毒感染疾病为新冠状病毒所导致的肺炎。
本发明第六方面提供了一种昆布多糖提取物，其中，昆布多糖提取物为昆布的水提物。
在一实施例中，昆布多糖提取物主要由以下方法制备而成：
(1)提供昆布；(2)采用水提法提取所述昆布，得到提取液；(3)采用醇沉淀法将所述提取液进行纯化，得到的沉淀物质为所述昆布多糖提取物。
进一步地，昆布多糖提取物采用步骤S110的方法制备而成，具体如上步骤S110所述，在此不再进行赘述。
本发明第七方面提供了第六方面所述的昆布多糖提取物在制备抗病毒药物中的应用。进一步地，抗病毒药物为抗冠状病毒药物，优选为抗2019新型冠状病毒药物。
本发明技术人员通过研究发现本发明第一方面的昆布多糖抗冠状病毒的潜能，故含有该昆布多糖的昆布多糖提取物同样具有相应的作用。且昆布多糖提取物中还含有丰富的多糖、蛋白质、脂肪、纤维素和矿物质等，适宜制备中药制剂等。
本发明第八方面提供了一种中成药，包括第六方面的昆布多糖提取物。进一步地，中成药为丸剂、散剂、膏剂、片剂、颗粒剂(冲剂)、锭剂、胶囊剂、水剂、酊剂。
本发明第九方面提供了一种治疗或预防病毒感染疾病的方法，包括向待施加对象施加第八方面的中成药的步骤。
进一步地，待施加对象为哺乳动物；更进一步地，待施加对象为人。
下面列举具体实施例来对本发明进行说明。
制备实施例1昆布多糖(以下简称37502，或多糖37502)的分离纯化和结构表征
(一)多糖的纯化
每次取200mg昆布多糖提取物溶解于20mL去离子水中，搅拌过夜，离心取上清上样于DEAE SepharoseTM Fast Flow阴离子交换柱，用去离子水和不同浓度的NaCl溶液(0.05M、0.1M、0.2M)进行梯度洗脱，流速控制在13mL/15min，用自动收集仪收集。每管取100μL用硫酸-苯酚法显色并用酶标仪在490nm下检测其吸光度，用吸光度和洗脱体积绘制洗脱曲线。根据洗脱曲线收集分离的多糖进行减压浓缩、透析、冷冻干燥，最后得到0.2M NaCl洗脱液的洗脱组分(次级粗多糖37502)。
(二)多糖的结构鉴定
多糖37502在串连UltrahydrogelTM 802和UltrahydrogelTM 804分析凝胶柱上的特征图谱如图1所示，其色谱条件为：流动相：0.1M NaNO3；流速：0.6mL/min；柱温：40℃；Agilent 1260液相色谱仪；检测器：示差检测器和紫外检测器。
取多糖37502样品约4mg于鸡心瓶中，溶于2M TFA(2mL)，在110℃下密闭反应4h，反应完毕后用甲醇进行旋蒸除去TFA，将反应物复溶于200μL水中，取其中50μL进行PMP衍生化反应，萃取完毕后取上层水相500μL于液相瓶，在高效液相上用C-18柱进行37502样品的单糖组成分析，同时取各单糖(甘露糖、甘露糖醛酸、古罗糖醛酸、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖)作为混标做相同的处理进行分析。标准图谱与样品图谱如图2所示。单糖组成结果显示，37502中含有古罗糖醛酸和甘露糖醛酸，其比例为10.7％和89.3％。
取37502样品约2mg，采用溴化钾压片法测定多糖的红外光谱，结果如图3所示。其中，3453.88cm-1为O-H的伸缩振动峰。2935.13cm-1为C-H的伸缩振动峰。1616.06cm-1和1417.42cm-1为COO-的不对称和对称的伸缩振动峰，证明了该糖中有糖醛酸的存在。1035.59cm-1代表了C-C单键的伸缩振动。956.52cm-1代表了糖醛酸的伸缩振动。890.95cm-1代表了β甘露糖醛酸的C1-H的变角振动。821.53cm-1是甘露糖醛酸的特殊吸收峰。792.12cm-1是古洛糖醛酸的特殊吸收峰。
取37502多糖30mg，加D2O 0.5mL溶解，加2.5μL丙酮为内标(δH＝2.29ppm，δC＝31.5ppm)，于Bruker AVANCE III 500M核磁共振仪上，25℃分别测定一维和二维核磁共振谱，结果如图4和图5所示。
图4的A中的异头碳区域，102.45ppm属于1,4连接的古洛糖醛酸的异头碳的信号峰，101.22ppm属于1,4连接的甘露糖醛酸的异头碳的信号峰。在图4的A中的非异头碳区域，71.12ppm，72.55ppm和76.69ppm被归属于甘露糖醛酸的C2，C3和C5信号峰。三个信号峰65.87ppm，78.46ppm和68.87ppm归属于1,4连接的古洛糖醛酸的C2，C3和C5。同时81.2ppm和79.06ppm被归属于古洛糖醛酸和半乳糖醛酸的C-4。根据图5中的二维核磁图谱A和B，图4B中异头氢同时被归属，5.12ppm和4.73ppm属于古洛糖醛酸的甘露糖醛酸的H1信号。4.04ppm和4.10ppm被归属于古洛糖醛酸和甘露糖醛酸的H2信号。其余的信号峰见表1。在图5C中37502的糖残基连接方式被归属。信号峰1(101.22/3.93)表示了甘露糖醛酸的C-1和H-4的相关峰，信号峰2(79.06/4.73)表示了甘露糖醛酸的H-1和C-4的相关峰。信号峰3(101.22/4.29)表示了甘露糖醛酸的C1和古洛糖醛酸的H4的相关峰，信号峰4(81.2/4.73)表示了古洛糖醛酸的C4和甘露糖醛酸的H1的相关峰。信号峰5(102.45/4.29)代表了古洛糖醛酸的C1和H4的相关信号峰。信号峰6(102.45/3.93)代表了古洛糖醛酸的C1和甘露糖醛酸的H4的相关信号峰。信号峰7(79.06/5.12)代表了古洛糖醛酸的H1和甘露糖醛酸的C4的相关信号峰。因此该多糖结构如下所示：
Figure BDA0002883213530000141
表1.昆布多糖的核磁化学位移归属表
Figure BDA0002883213530000142
其中，Residues表示糖残基；1,4-linked guluronic acid(G)表示1，4-相连古洛糖醛酸残基，1,4-linked mannuronic acid(M)表示1，4-相连甘露糖醛酸残基)
活性测试
测试方法：
(一)酶联免疫吸附(ELISA)
1.1包被
10μg/mL的含ACE2的包被液加到96孔板中4℃孵育过夜。
1.2洗涤
包被结束后弃掉包被液，孔中加满PBST，静置5-10min，弃掉洗液，重新加满PBST,重复洗涤3-5次，最后拍干96孔板进行下一步的封闭。
1.3封闭
96孔板中加入包被液两倍体积的3％的BSA在室温下封闭2h。
1.4洗涤
洗涤条件同1.2。
1.5加入一抗
加入100μL一抗(生物素化的S1蛋白)室温孵育1h，同时设置阴性对照组和实验组(37502)，孵育完毕后再次进行洗涤。
1.6加入二抗
加入100μL HRP标记的链霉亲和素室温孵育1h后洗涤。
1.7显色
加入100μL TMB进行显色，35min后加入50μL的终止液终止反应，立即用酶标仪监测A450 nm处的OD值。
(二)等温滴定量热法(ITC)
2.1确定合适的反应物浓度，准备样品。
2.2滴定，收集数据。
2.3对原始数据进行校正。
2.4校正后的数据非线性回归得出热力学参数。
结果分析:
1.酶联免疫吸附实验
通过ELISA实验结果显示，ACE2和S1蛋白的结合在多糖37502的存在下受到干扰。表明多糖37502能有效的抑制ACE2蛋白和SARS CoV-2S1蛋白的结合，同时半数有效抑制率(IC50)在56.06μg/mL(图6)。说明37502具有能够阻断新冠病毒S1蛋白与人体ACE2蛋白结合的能力。
2.等温定量热法
通过ITC实验，将底物37502多糖(300μM)滴加到含600μM的3CL pro的溶液中，设定相同的滴加底物的时间间隔，经数据校正和非线性回归分析后得出理论曲线(图7)，显示37502能有效地与3CL pro结合，结合常数Kd值为：4.23×10-6M，说明37502能够通过与3CLpro的结合从而干扰SARS CoV-2病毒的复制。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种昆布多糖，其特征在于，以摩尔百分比计，所述昆布多糖的单糖组成为甘露糖醛酸89.3％和古洛糖醛酸10.7％；所述昆布多糖具有以下结构：
Figure FDA0003351297360000011
所述昆布多糖的分子量为27.9kDa。
2.根据权利要求1所述的昆布多糖，其特征在于，所述昆布多糖的红外光谱图在以下波长处具有伸缩振动峰：3453.88cm-1±0.2cm-1、2935.13cm-1±0.2cm-1、1616.06cm-1±0.2cm-1、1417.42cm-1±0.2cm-1、1035.59cm-1±0.2cm-1、956.52cm-1±0.2cm-1、890.95cm-1±0.2cm-1、821.53cm-1±0.2cm-1、792.12cm-1±0.2cm-1；和/或
所述昆布多糖的1H NMR谱图在以下位置具有峰：5.12ppm±0.02ppm、4.04ppm±0.02ppm、3.95ppm±0.02ppm、4.29ppm±0.02ppm、4.53ppm±0.02ppm、3.87ppm±0.02ppm、3.93ppm±0.02ppm、3.83ppm±0.02ppm、4.10ppm±0.02ppm、4.73ppm±0.02ppm；和/或
所述昆布多糖的13C NMR谱图在以下位置具有峰：102.45ppm±0.2ppm、65.87ppm±0.2ppm、78.46ppm±0.2ppm、81.2ppm±0.2ppm、68.57ppm±0.2ppm、176.58ppm±0.2ppm、101.22ppm±0.2ppm、71.12ppm±0.2ppm、72.55ppm±0.2ppm、79.06ppm±0.2ppm、76.69ppm±0.2ppm、175.96ppm±0.2ppm。
3.一种昆布多糖提取物，其特征在于，含有权利要求1-2中任一项所述昆布多糖。
4.一种药物，其特征在于，包括：
1)权利要求1-2中任一项所述的昆布多糖；
2)药学上可接受辅料。
5.权利要求1-2任一项所述的昆布多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
提供昆布多糖提取物，所述昆布多糖提取物为昆布的水提物；
采用柱分离技术将所述昆布多糖提取物进行分离，采用DEAE SepharoseTMFast Flow阴离子交换柱，洗脱程序为：依次采用去离子水和0.05M的NaCl溶液、0.1M的NaCl溶液和0.2M的NaCl溶液进行梯度洗脱，收集0.2M NaCl洗脱液的洗脱组分，获得权利要求1-2任一项所述的昆布多糖。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将昆布和水混合，在温度为80℃-100℃的条件下进行提取，得到提取液；
将所述提取液进行浓缩，得到浓缩物；
向所述浓缩物中加入乙醇，有固体析出，收集固体，所述固体为昆布多糖提取物；
将所述昆布多糖提取物配制成昆布多糖溶液，并加入所述DEAE SepharoseTM FastFlow阴离子交换柱中；
依次采用水和浓度梯度递增的NaCl溶液进行梯度洗脱，收集流出液；
将所述流出液采用硫酸-苯酚法显色并用酶标仪在490nm下检测其吸光度；
用吸光度和洗脱体积绘制洗脱曲线，根据所述洗脱曲线，收集所需的昆布多糖组分；
将所述昆布多糖组分进行浓缩、透析、干燥，制得所述权利要求1-2任一项所述的昆布多糖。
7.权利要求1-2任一项所述的昆布多糖、权利要求3所述昆布多糖提取物、权利要求4所述药物在制备抗2019新型冠状病毒药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述昆布多糖提取物为昆布的水提物，且所述昆布多糖提取物由包括以下步骤的方法制备而成：
提供昆布；
采用水提法提取所述昆布，得到提取液；
采用醇沉淀法将所述提取液进行纯化，得到的沉淀物质为所述昆布多糖提取物。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物为中成药，所述中成药为丸剂、散剂、膏剂、片剂、颗粒剂、锭剂、胶囊剂、水剂或酊剂。
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