CN111548435B - 一种舒更葡糖的分离纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种舒更葡糖的分离纯化方法。方法首先将舒更葡糖样品用混合溶液溶解，过滤掉不溶物；然后将过滤后的样品溶液上样到ODS柱；接着采用单柱内循环模式或双柱内循环模式进行分离；最后采用混合溶剂作为流动相对样品进行梯度洗脱或等度洗脱，分段收集目标峰，对目标峰符合要求的组分进行汇总得到纯化后的样品。本发明方法具有分离条件温和、分离效率高、分离速度快、通用性强等优点，很好实现样品分离纯化，可实现短时间内富集，可通过改变洗脱条件和切换阀纯化乃至其他类型化合物，应用前景好。

Description

一种舒更葡糖的分离纯化方法

技术领域

本发明属于药物分离纯化领域，具体地涉及一种舒更葡糖的分离纯化方法，利用组装的单柱或双柱种内循环增强柱效模式的循环装备，采用0.1％三氟乙酸水和甲醇或乙腈为流动相，即可得到高纯度的舒更葡糖。

背景技术

舒更葡糖(Sugammadex)是一种伽马环糊精修饰后的衍生物，分子结构保留了伽马环糊精由亲脂核心和亲水外端组成筒状空腔，它能与常用的手术麻醉剂罗库溴铵、维库溴铵快速结合，使血液和麻醉组织中高浓度的肌松药短时间内迅速逆转，使神经肌肉接头恢复常态，是一种对提高全身麻醉的安全性具有显著作用的选择性肌松药拮抗剂。

舒更葡糖(Sugammadex)分子式如下：

截至目前，国内外相关期刊文献和专利著作等对对舒更葡糖的报道多为工艺合成和临床应用两方面，而对于它的分离纯化方法鲜有报道，总数不超过二十篇文献，如CN1402737报道了一种利用渗析法纯化舒更葡糖的方法，但该渗透法回收率仅达34％，不利于工业生产。CN107892727A发明了利用活性炭对舒更葡糖钠进行纯化，但该方法不利于环保。CN108456264A报道了利用硅胶 C18为填料的层析柱进行纯化，该方法装柱较为繁琐。WO2012025937公开了一种利用硅胶色谱和凝胶色谱Sephadex G-25分离纯化舒更葡糖的方法，该方法上样量有所限制。

此外，研究人员也发明了利用重结晶方式如WO2014125501、CN104844732A、CN105273095A以及精制等方法纯化舒更葡糖钠。CN105348412A开发了将舒更葡糖钠转化为舒更葡糖铵盐后，利用乙醇重结晶再将其调整为钠盐。

虽然以上文献中都有报道了多种纯化舒更葡糖的方法，但目前多为活性炭吸附、重结晶纯化及制备色谱纯化，活性炭吸附的缺点是不利于环保，重结晶纯化步骤繁琐，溶剂用量大且产品通常不稳定，由于γ-环糊精极性大且结构类似物较多，结构较为复杂且包含多个手性中心，在制备色谱时几乎无保留，一次纯化结束后无法实现二次纯化，故纯化成本高、溶剂用量大，上述方法都具有一定的弊端和局限性。为了满足高纯度舒更葡糖的分离且实现工业放大生产的需求，需要开发通用的适用于舒更葡糖的纯化方法。

发明内容

为了解决背景技术中存在的问题，本发明提供了一种舒更葡糖的分离纯化方法，利用自组装的循环制备装置，采用三氟乙酸水溶液和甲醇或乙腈为流动相，即可得到高纯度的舒更葡糖。

且设计了一种舒更葡糖通用的循环制备及分离纯化装置，具有易于自组装，单柱和双柱两种循环模式，可得到高纯度舒更葡糖。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

方法首先将舒更葡糖样品用混合溶液溶解，过滤掉不溶物；然后将过滤后的样品溶液上样到ODS柱；接着采用单柱内循环模式或双柱内循环模式进行分离；最后采用混合溶剂作为流动相对样品进行梯度洗脱或等度洗脱，分段收集目标峰，对目标峰符合要求(HPLC纯度≥99％)的组分进行汇总得到纯化后的样品。

所述的混合溶液为体积比为1/1的乙腈/水，混合溶剂是主要由乙腈和三氟乙酸构成，包括作为A溶液的质量分数为0.1％的三氟乙酸(TFA)水溶液和作为B溶液的乙腈。

所述的目标峰具体为梯度洗脱模式下出峰时间在115～140min峰或等度洗脱模式下的出峰时间在75～85min的峰。

所述等度洗脱过程为：在0-80min内，流动相均为体积分数78％的A溶液和体积分数22％的B溶液的混合溶液。

所述梯度洗脱过程为：在0-15min内，流动相为体积分数98％的A溶液和体积分数2％的B溶液的混合溶液；在15.01-140min内，流动相为体积分数78％的A溶液和体积分数22％的B溶液的混合溶液；在140.01-150min内，流动相为体积分数20％的A溶液和体积分数80％的B溶液的混合溶液；在 150.01-173min内，流动相仅为体积分数100％的B溶液。这样处理的梯度洗脱能更好地进行纯化分离。

所述流动相中含有三氟乙酸，所述酸为本领域技术人员所知或可确定，可为甲酸、乙酸、磷酸、三氟乙酸，优选为三氟乙酸。

优选的，所述0.1％三氟乙酸水溶液，三氟乙酸可选0.05～1％，优选为0.1％。

优选的，上样前，对所述ODS柱进行平衡，其中平衡时间为≥15min，优选 15min。

所述方法采用以下循环制备及分离纯化装置，装置包括检测器、第一泵、第二泵、第一柱、第二柱、第一切换阀、第二切换阀、第三切换阀和第四切换阀；第二流动相输出端、第二泵的输入端、馏分收集口和检测器的输出口分别连接到第一切换阀的三个阀口，第二柱的第一端、第二泵的输出端、废液收集口分别连接到第二切换阀的三个阀口，第二柱的第二端、第一柱的第一端分别连接到第三切换阀的两个阀口，第一柱内装有舒更葡糖的样品，第一流动相输出端、第一泵的输入端、检测器的输入口分别连接到第四切换阀的三个阀口，第一泵的输出端连接到第一柱的第一端，第二柱的第二端、第二泵的输出端、废液收集口分别连接到第二切换阀的三个阀口，同时第二切换阀的一个阀口和第三切换阀的一个阀口直接连通，第三切换阀的一个阀口和第四切换阀的一个阀口直接连通。

所述方法在装置控制下具体如下进行：

1)粗品上样：将舒更葡糖样品用混合溶液溶解并过滤，将过滤后的样品溶液上样到第一柱，然后以下控制：第一泵开启工作，第二泵不开启不工作；打开第一切换阀，仅使得检测器的输出端和馏分收集口连通；关闭第二切换阀不工作；打开第三切换阀，使得第一柱的第二端依次经第三切换阀、第四切换阀后和检测器的输入端连通；打开第四切换阀，使得第一流动相输出端和第一泵的输入端连通；第一流动相输出后经第四切换阀的一个流通通道进入第一泵，被第一泵泵出后再依次经第一柱、第三切换阀的一个流通通道、第四切换阀的另一个流通通道进入检测器，从检测器输出后经第一切换阀的一个流通通道进入馏分收集口；

这样使得第一柱内的样品大部分上样到检测器中，待检测器检测到目标峰后切换阀进入单柱内循环模式或者双柱内循环模式；

2)采用单柱内循环模式或双柱内循环模式进行分离；

若为单柱内循环模式，则待检测器检测到目标峰后按照顺序切换阀1、阀2、阀3后进入单柱内循环模式；

若为双柱内循环模式，则待检测器检测到目标峰后按照顺序切换阀1、阀2、阀3、阀4后进入双柱内循环模式。

3)采用混合溶剂作为流动相对样品进行梯度洗脱或等度洗脱，待检测器检测到主成分已经得到完全分离则切换阀1且开启第二泵后按照目标峰收集模式进行目标峰收集，目标峰收集模式分为单柱目标峰收集模式和双柱目标峰收集模式，并汇总得到纯化后的样品；

若为单柱内循环模式，则采用单柱目标峰收集模式进行收集；

若为双柱内循环模式，则采用双柱目标峰收集模式进行收集。

4)收集样品后，平衡第一柱和第二柱，切换各个阀回到步骤1)进入下一次粗品上样。

所述步骤2)中，单柱内循环模式具体为：第一泵不开启不工作，第二泵开启工作；打开第一切换阀，仅使得检测器的输出端和第二泵的输入端连通；打开第二切换阀，仅使得第二泵的输出端和第二柱的第一端连通；打开第三切换阀和第四切换阀，仅使得第二柱的第二端依次经第三切换阀、第四切换阀后和检测器的输入端连通；检测器内的样品液经第一切换阀的一个流通通道输入到第二泵中，从第二泵泵出后再经第二切换阀的一个流通通道进入第二柱，第二柱流出后再依次经第三切换阀的一个流通通道、第四切换阀的一个流通通道回到检测器，完成循环；

所述步骤3)中，单柱目标峰收集模式具体为：第一泵不开启不工作，第二泵开启工作；打开第一切换阀，使得检测器的输出端和馏分收集口连通，且第二流动相输出端和第二泵的输入端连通；打开第二切换阀，仅使得第二泵的输出端和第二柱的第一端连通；打开第三切换阀和第四切换阀，仅使得第二柱的第二端依次经第三切换阀、第四切换阀后和检测器的输入端连通；第二流动相输出后经第一切换阀的一个流通通道进入第二泵，被第二泵泵出后经第二切换阀的一个流通通道进入第二柱，第二柱流出后再依次经第三切换阀的一个流通通道、第四切换阀的一个流通通道进入检测器，从检测器输出后经第一切换阀的另一个流通通道进入馏分收集口；

所述步骤2)中，双柱内循环模式具体为：第一泵和第二泵均开启工作；打开第一切换阀，仅使得检测器的输出端和第二泵的输入端连通；打开第二切换阀，仅使得第二泵的输出端和第二柱的第一端连通；打开第三切换阀，仅使得第二柱的第二端和第一柱的第二端连通；打开第四切换阀，仅使得第一泵的输入端和检测器的输入端连通，且第一泵反向工作；检测器内的样品液经第一切换阀的一个流通通道输入到第二泵中，从第二泵泵出后再经第二切换阀的一个流通通道进入第二柱，第二柱流出后再依次经第三切换阀的一个流通通道进入第一柱，第一柱第二柱流出后再依次经第一泵和第四切换阀的一个流通通道回到检测器，完成循环；

所述步骤3)中，双柱目标峰收集模式具体为：第一泵和第二泵均开启工作；打开第一切换阀，使得检测器的输出端和馏分收集口连通，且第二流动相输出端和第二泵的输入端连通；打开第二切换阀，仅使得第二泵的输出端和第二柱的第一端连通；打开第三切换阀，仅使得第二柱的第二端和第一柱的第二端连通；打开第四切换阀，仅使得第一泵的输入端和检测器的输入端连通，且第一泵反向工作；第二流动相输出后经第一切换阀的一个流通通道进入第二泵，被第二泵泵出后再依次经第二切换阀的一个流通通道进入第二柱，第二柱流出后再经第三切换阀的一个流通通道进入第一柱，第一柱流出后经第一泵、第四切换阀的一个流通通道进入检测器，从检测器输出后经第一切换阀的另一个流通通道进入馏分收集口。

所述ODS柱为自组装柱。所述自组装柱中填料型号为SiliaSphere系列ODS，其粒径50μm，孔径

本发明中收集纯化的舒更葡糖纯度在99.0％以上且其单杂小于0.1％。

本发明中所涉及柱均可根据个人需求自行组装成不同内径不同填料的柱子，且机身外即可实现循环，可避免传统高校液相色谱受色谱柱和运行时压力过高等限制。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明能很好地进行舒更葡糖结构的分离纯化，可实现短时间内高纯度舒更葡糖的富集，可通过改变洗脱条件和切换阀纯化舒更葡糖乃至其他类型化合物，具有较好的市场应用前景。

本发明方法不仅能纯化舒更葡糖产品，甚至可以纯化与其结构极其相似的其他物质，对这类结构具有较好的普适性及通用性。此外，本发明所述的循环制备方法具有分离条件温和、分离效率高、分离速度快等优点。

本发明可以通过调节切换阀实现单柱和双柱2种循环模式，特别适用于舒更葡糖这一类极性特别大的样品，在普通高效液相色谱一次经过柱子后并未实现分离，而在本发明中可实现再次或者多次分离，以得到高纯度舒更葡糖。

综合来说，本发明装置能同时实现两种样品的循环制备、让一次纯化无保留能再次进入柱子，实现二次纯化，得到高纯度舒更葡糖，节约高昂的仪器成本、有利于溶剂的环保，可实现工业化市场化等优点。

附图说明

图1为粗品上样模式结构示意图(模式A)；

图2为双柱内循环模式结构示意图(模式B)；

图3为双柱目标峰收集模式结构示意图(模式C)；

图4为实施例纯化后舒更葡糖HPLC谱图。

图中：第一切换阀1、第二切换阀2、第三切换阀3、第四切换阀4。

具体实施方式

下面将结合本发明实例中的附图，对本发明实例中的技术方案进行清楚、完整地描述。本发明中所描述的实例仅仅只是部分实例，并不是全部的实施实例。

如图1-图3所示，具体实施的实验装置包括检测器、第一泵、第二泵、第一柱、第二柱、第一切换阀1、第二切换阀2、第三切换阀3和第四切换阀4；第二流动相输出端、第二泵的输入端、馏分收集口和检测器的输出口分别连接到第一切换阀1的三个阀口，第二柱的第一端、第二泵的输出端、废液收集口分别连接到第二切换阀2的三个阀口，第二柱的第二端、第一柱的第一端分别连接到第三切换阀3的两个阀口，第一柱内装有舒更葡糖的样品，第一流动相输出端、第一泵的输入端、检测器的输入口分别连接到第四切换阀4的三个阀口，第一泵的输出端连接到第一柱的第一端，第二柱的第二端、第二泵的输出端、废液收集口分别连接到第二切换阀2的三个阀口，同时第二切换阀2的一个阀口和第三切换阀3的一个阀口直接连通，第三切换阀3的一个阀口和第四切换阀4的一个阀口直接连通。

第一切换阀1、第二切换阀2、第三切换阀3和第四切换阀4均具有四个阀口，通过各个切换阀1控制四个阀口之间的流通切换。

第一柱和第二柱均为ODS柱，相同或者不相同。

具体实施在检测器和第一切换阀1的阀口之间的管道上设有排空口，排空口连接排空阀。利用排空口通过排空阀在流动中存在空气时进行排空处理，通常在粗品上样过程中进行操作。

检测器具体采用紫外检测器，样品经过柱子分离后检测器监测到目标峰出现在85min左右时切换，切换阀1，进入产品收集模式图3。

馏分收集口连接馏分收集器，废液收集口为废液收集器，馏分收集器和废液收集器均为玻璃器皿。

第一泵和第二泵均为蠕动泵，第一泵用于抽取第一流动相，第二泵用于抽取第二流动相。

具体实施中，可以使用第二柱进行循环为单柱循环模式，也可以同时使用第一柱和第二柱串联循环为双柱循环模式图2实线。

第二切换阀2可实现废液和第二柱之间的切换，第三切换阀3可实现第二切换阀2、第二柱与检测器三者之间的切换，第一切换阀1可实现第二泵与馏分收集器之间的切换。

具体实施中，流动相存放于储液瓶内，储液瓶瓶盖顶部开设有2个小孔；泵为蠕动泵，也可与各品牌的高效液相色谱泵配合使用。上样前，第一柱和第二柱都需平衡约15min，从第一泵上样。本发明涉及的切换阀均为四通切换阀。

采用上述装置使得样品的循环处理模式包括单柱循环和双柱循环，单柱循环时顺序切换切换阀2和阀1，双柱循环时切换阀2、阀3和阀1。方法按照45min 时顺序切换阀2、阀3和阀4，进入单柱内循环模式。方法或者按照75min时顺序切换阀2和阀1，开启第二泵，进入双柱内循环模式C图2。

具体实施采用以下循环制备及分离纯化装置，分离纯化控制过程如下：

1)粗品上样：将样品用混合溶液溶解并过滤，将过滤后的样品溶液上样到第一柱，然后按照粗品上样模式进行上样。

这样使得第一柱内的样品大部分上样到检测器中，待检测器检测到目标峰后切换阀进入单柱内循环模式或者双柱内循环模式；

2)采用单柱内循环模式或双柱内循环模式进行分离；

若为单柱内循环模式，则待检测器检测到目标峰后按照顺序切换阀1、阀2、阀3后进入单柱内循环模式；

若为双柱内循环模式，则待检测器检测到目标峰后按照顺序切换阀1、阀2、阀3、阀4后进入双柱内循环模式。

3)采用混合溶剂作为流动相对样品进行梯度洗脱或等度洗脱，待检测器检测到主成分已经得到完全分离则切换阀1且开启第二泵后按照目标峰收集模式进行目标峰收集，目标峰收集模式分为单柱目标峰收集模式和双柱目标峰收集模式，并汇总得到纯化后的样品；

若为单柱内循环模式，则采用单柱目标峰收集模式进行收集；

若为双柱内循环模式，则采用双柱目标峰收集模式进行收集。

4)收集样品后，平衡第一柱和第二柱，切换各个阀回到步骤1)进入下一次粗品上样。

步骤1)中，如图1所示，粗品上样模式具体为：将舒更葡糖样品用混合溶液溶解并过滤，将过滤后的样品溶液上样到第一柱，然后以下控制：第一泵开启工作，第二泵不开启不工作；打开第一切换阀1，仅使得检测器的输出端和馏分收集口连通；关闭第二切换阀2不工作；打开第三切换阀3，使得第一柱的第二端依次经第三切换阀3、第四切换阀4后和检测器的输入端连通；打开第四切换阀4，使得第一流动相输出端和第一泵的输入端连通；第一流动相输出后经第四切换阀4的一个流通通道进入第一泵，被第一泵泵出后再依次经第一柱、第三切换阀3的一个流通通道、第四切换阀4的另一个流通通道进入检测器，从检测器输出后经第一切换阀1的一个流通通道进入馏分收集口；使得第一柱内的样品大部分上样到检测器中，待检测器检测到目标峰后切换阀进入单柱内循环模式或者双柱内循环模式。

步骤2)中，单柱内循环模式具体为：第一泵不开启不工作，第二泵开启工作；打开第一切换阀1，仅使得检测器的输出端和第二泵的输入端连通；打开第二切换阀2，仅使得第二泵的输出端和第二柱的第一端连通；打开第三切换阀3 和第四切换阀4，仅使得第二柱的第二端依次经第三切换阀3、第四切换阀4后和检测器的输入端连通；检测器内的样品液经第一切换阀1的一个流通通道输入到第二泵中，从第二泵泵出后再经第二切换阀2的一个流通通道进入第二柱，第二柱流出后再依次经第三切换阀3的一个流通通道、第四切换阀4的一个流通通道回到检测器，完成循环；所述单柱内循环模式为开启第二泵，仅通过单柱内部循环，增加柱效进行分离。

步骤2)中，如图2所示，双柱内循环模式具体为：第一泵和第二泵均开启工作；打开第一切换阀1，仅使得检测器的输出端和第二泵的输入端连通；打开第二切换阀2，仅使得第二泵的输出端和第二柱的第一端连通；打开第三切换阀 3，仅使得第二柱的第二端和第一柱的第二端连通；打开第四切换阀4，仅使得第一泵的输入端和检测器的输入端连通，且第一泵反向工作；检测器内的样品液经第一切换阀1的一个流通通道输入到第二泵中，从第二泵泵出后再经第二切换阀2的一个流通通道进入第二柱，第二柱流出后再依次经第三切换阀3的一个流通通道进入第一柱，第一柱第二柱流出后再依次经第一泵和第四切换阀4 的一个流通通道回到检测器，完成循环。所述双柱内循环模式为通过第一柱和第二柱串联内循环增加柱效模式，能更好地提高样品纯化和分离的纯度，提高收率，如图2实线标注流路线。

步骤3)中，单柱目标峰收集模式具体为：第一泵不开启不工作，第二泵开启工作；打开第一切换阀1，使得检测器的输出端和馏分收集口连通，且第二流动相输出端和第二泵的输入端连通；打开第二切换阀2，仅使得第二泵的输出端和第二柱的第一端连通；打开第三切换阀3和第四切换阀4，仅使得第二柱的第二端依次经第三切换阀3、第四切换阀4后和检测器的输入端连通；第二流动相输出后经第一切换阀1的一个流通通道进入第二泵，被第二泵泵出后经第二切换阀2的一个流通通道进入第二柱，第二柱流出后再依次经第三切换阀3的一个流通通道、第四切换阀4的一个流通通道进入检测器，从检测器输出后经第一切换阀1的另一个流通通道进入馏分收集口；这样使得检测器内的样品进入馏分收集口被提纯收集。

步骤3)中，如图3所示，双柱目标峰收集模式具体为：第一泵和第二泵均开启工作；打开第一切换阀1，使得检测器的输出端和馏分收集口连通，且第二流动相输出端和第二泵的输入端连通；打开第二切换阀2，仅使得第二泵的输出端和第二柱的第一端连通；打开第三切换阀3，仅使得第二柱的第二端和第一柱的第二端连通；打开第四切换阀4，仅使得第一泵的输入端和检测器的输入端连通，且第一泵反向工作；第二流动相输出后经第一切换阀1的一个流通通道进入第二泵，被第二泵泵出后再依次经第二切换阀2的一个流通通道进入第二柱，第二柱流出后再经第三切换阀3的一个流通通道进入第一柱，第一柱流出后经第一泵、第四切换阀4的一个流通通道进入检测器，从检测器输出后经第一切换阀1的另一个流通通道进入馏分收集口。这样使得检测器内的样品进入馏分收集口被提纯收集，如图3实线标注流路线。

采用上述装置的本发明实施例如下：

实施例1：

舒更葡糖分离和纯化：取舒更葡糖加乙腈/水(v/v，1/1)配制成浓度 50g/100mL溶液。待溶液澄清后，用孔径为0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用。采用自组装柱，柱填料型号为SiliaSphere系列ODS，其粒径50μm，孔径

以0.1％三氟乙酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，流速80mL/min。如图1 所示，第一柱和第二柱平衡时间大约15min，由第一泵进行粗品上样(图1)， 45min(检测器检测到目标峰)时，顺序切换阀1、阀2、阀3和阀4进入图2所示(实线标注)双柱内循环模式C。75min时开启第二泵进入图3所示双柱内循环产品收集模式二，并收集115～140min的目标成分。对符合要求的组分液进行汇总，经高效液相色谱分析，舒更葡糖目标成分纯度大于80.0％，回收率大于 70％。梯度洗脱模式，洗脱程序如表2。

表2.舒更葡糖分离和纯化洗脱程序

时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0-15	98	2
15.01-140	78	22
			140.01-150	20	80
150.01-173	0	100

实施例2：

舒更葡糖分离和纯化：取舒更葡糖加乙腈/水(v/v，1/1)配制成浓度50g/100mL溶液。待溶液澄清后，用孔径为0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用。采用自组装柱，柱填料型号为SiliaSphere系列ODS，其粒径50μm，孔径

以0.1％三氟乙酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，流速80mL/min。如图1 所示，第一柱和第二柱平衡时间大约15min，由第一泵进行粗品上样(图1)， 35min(检测器检测到目标峰)时进入入图2所示(实线标注)双柱内循环模式 C。55min时开启第二泵进入图3所示双柱内循环产品收集模式二，并收集 75～85min的目标成分。洗脱时间为100min，等度洗脱模式(A相：78％，B相： 22％)。对符合要求的组分液进行汇总，经高效液相色谱分析，舒更葡糖目标成分纯度大于99.0％。单杂小于0.1％，回收率大于90％。

采用HPLC法测定本品纯度，色谱柱为Phenomenex Aqua C18 150×2.0mm， 3μm的2根相同类型的柱子串联，流速为0.27mL/min，柱温为40℃，检测器为 DAD，检测波长为200nm，进样量为2.5μL，运行时间105min。流动相A为用磷酸调节PH＝3±0.03的NaH2PO4·2H2O缓冲溶液与乙腈的混合溶液(缓冲液与乙腈比例约83比20)，每1000mL溶液约含3.899gNaH2PO4·2H2O；流动相B 为乙腈。洗脱程序如表3。

表3.舒更葡糖HPLC洗脱程序

时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	100	0
21	100	0
			35	98	2
50	92	8
			55	75	25
60	50	50
			65	30	70
80	30	70
			85	100	0
105	100	0

在上述实施例中采用的舒更葡糖粗品，HPLC总纯度70.3703％，杂质含量大于0.1％的杂质个数约30个，如表4。

表4.舒更葡糖粗品各组分含量表

本申请中采用单柱内循环模式或双柱内循环模式进行分离，大大提高了分离柱效，收率和纯度均具有显著的优势，纯化后的舒更葡糖纯度可达99％，原来五十几个杂质减少为十二个，且这12个单杂含量均小于0.1％。如附图4和表 5。

表5.纯化后的舒更葡糖各组分含量表

序号	保留时间(min)	峰面积(％)
			1	9.335	5.258e-3
2	9.828	6.763e-3
			3	10.490	6.266e-3
4	11.241	0.0272
			5	14.719	0.0320
6	16.385	0.0274
			7	22.192	0.0389
8	26.063	99.7483
			9	29.884	0.0131
10	36.678	0.0258
			11	50.641	3.922e-3
12	52.034	0.0104
			13	54.816	0.0547

结果表明，本申请中的舒更葡糖纯化方法将产品纯度提高至99.7483％，杂质总量大大降低，且单杂均小于0.1％，有利于降低舒更葡糖的毒性进而提高其用药安全性。

尽管已经详细描述了本发明的优选实施例，但对于相关领域的技术人员而言，可以在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变换、改替和变型直接或间接运用在其他相关领域，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (5)

1.一种舒更葡糖的分离纯化方法，其特征在于，方法首先将舒更葡糖样品用混合溶液溶解，过滤掉不溶物；然后将过滤后的样品溶液上样到ODS柱；接着采用单柱内循环模式或双柱内循环模式进行分离；最后采用混合溶剂作为流动相对样品进行梯度洗脱或等度洗脱，分段收集目标峰，对目标峰符合要求的组分进行汇总得到纯化后的样品；

所述的混合溶液为体积比为1/1的乙腈/水，混合溶剂是主要由乙腈和三氟乙酸构成，包括作为A溶液的质量分数为0.1%的三氟乙酸（TFA）水溶液和作为B溶液的乙腈；

所述的目标峰具体为梯度洗脱模式下出峰时间在115~140min峰或等度洗脱模式下的出峰时间在75~85min的峰；

所述等度洗脱过程为：在0-80min内，流动相均为体积分数78%的A溶液和体积分数22%的B溶液的混合溶液；

所述梯度洗脱过程为：在0-15min内，流动相为体积分数98% 的A溶液和体积分数2%的B溶液的混合溶液；在15.01-140min内，流动相为体积分数78%的A溶液和体积分数22%的B溶液的混合溶液；在140.01-150min内，流动相为体积分数20%的A溶液和体积分数80%的B溶液的混合溶液；在150.01-173min内，流动相仅为体积分数100%的B溶液；

所述方法采用以下循环制备及分离纯化装置，装置包括检测器、第一泵、第二泵、第一柱、第二柱、第一切换阀（1）、第二切换阀（2）、第三切换阀（3）和第四切换阀（4）；第二流动相输出端、第二泵的输入端、馏分收集口和检测器的输出口分别连接到第一切换阀（1）的三个阀口，第二柱的第一端、第二泵的输出端、废液收集口分别连接到第二切换阀（2）的三个阀口，第二柱的第二端、第一柱的第一端分别连接到第三切换阀（3）的两个阀口，第一流动相输出端、第一泵的输入端、检测器的输入口分别连接到第四切换阀（4）的三个阀口，第一泵的输出端连接到第一柱的第一端，第二柱的第二端、第二泵的输出端、废液收集口分别连接到第二切换阀（2）的三个阀口，同时第二切换阀（2）的一个阀口和第三切换阀（3）的一个阀口直接连通，第三切换阀（3）的一个阀口和第四切换阀（4）的一个阀口直接连通；

单柱内循环模式具体为：第一泵不开启不工作，第二泵开启工作；打开第一切换阀（1），仅使得检测器的输出端和第二泵的输入端连通；打开第二切换阀（2），仅使得第二泵的输出端和第二柱的第一端连通；打开第三切换阀（3）和第四切换阀（4），仅使得第二柱的第二端依次经第三切换阀（3）、第四切换阀（4）后和检测器的输入端连通；检测器内的样品液经第一切换阀（1）的一个流通通道输入到第二泵中，从第二泵泵出后再经第二切换阀（2）的一个流通通道进入第二柱，第二柱流出后再依次经第三切换阀（3）的一个流通通道、第四切换阀（4）的一个流通通道回到检测器，完成循环；

双柱内循环模式具体为：第一泵和第二泵均开启工作；打开第一切换阀（1），仅使得检测器的输出端和第二泵的输入端连通；打开第二切换阀（2），仅使得第二泵的输出端和第二柱的第一端连通；打开第三切换阀（3），仅使得第二柱的第二端和第一柱的第二端连通；打开第四切换阀（4），仅使得第一泵的输入端和检测器的输入端连通，且第一泵反向工作；检测器内的样品液经第一切换阀（1）的一个流通通道输入到第二泵中，从第二泵泵出后再经第二切换阀（2）的一个流通通道进入第二柱，第二柱流出后再依次经第三切换阀（3）的一个流通通道进入第一柱，第一柱第二柱流出后再依次经第一泵和第四切换阀（4）的一个流通通道回到检测器，完成循环。

2.根据权利要求1所述的一种舒更葡糖的分离纯化方法，其特征在于：

所述方法在装置控制下具体如下进行：

1)粗品上样：将舒更葡糖样品用混合溶液溶解并过滤，将过滤后的样品溶液上样到第一柱，然后以下控制：第一泵开启工作，第二泵不开启不工作；打开第一切换阀（1），仅使得检测器的输出端和馏分收集口连通；关闭第二切换阀（2）不工作；打开第三切换阀（3），使得第一柱的第二端依次经第三切换阀（3）、第四切换阀（4）后和检测器的输入端连通；打开第四切换阀（4），使得第一流动相输出端和第一泵的输入端连通；第一流动相输出后经第四切换阀（4）的一个流通通道进入第一泵，被第一泵泵出后再依次经第一柱、第三切换阀（3）的一个流通通道、第四切换阀（4）的另一个流通通道进入检测器，从检测器输出后经第一切换阀（1）的一个流通通道进入馏分收集口；

这样使得第一柱内的样品大部分上样到检测器中，待检测器检测到目标峰后切换阀进入单柱内循环模式或者双柱内循环模式；

2)采用单柱内循环模式或双柱内循环模式进行分离；

3)采用混合溶剂作为流动相对样品进行梯度洗脱或等度洗脱，待检测器检测到主成分已经得到完全分离则后按照目标峰收集模式进行目标峰收集，目标峰收集模式分为单柱目标峰收集模式和双柱目标峰收集模式，并汇总得到纯化后的样品；

4)收集样品后，平衡第一柱和第二柱，切换各个阀回到步骤1)进入下一次粗品上样。

3.根据权利要求2所述的一种舒更葡糖的分离纯化方法，其特征在于：

所述步骤3)中，单柱目标峰收集模式具体为：第一泵不开启不工作，第二泵开启工作；打开第一切换阀（1），使得检测器的输出端和馏分收集口连通，且第二流动相输出端和第二泵的输入端连通；打开第二切换阀（2），仅使得第二泵的输出端和第二柱的第一端连通；打开第三切换阀（3）和第四切换阀（4），仅使得第二柱的第二端依次经第三切换阀（3）、第四切换阀（4）后和检测器的输入端连通；第二流动相输出后经第一切换阀（1）的一个流通通道进入第二泵，被第二泵泵出后经第二切换阀（2）的一个流通通道进入第二柱，第二柱流出后再依次经第三切换阀（3）的一个流通通道、第四切换阀（4）的一个流通通道进入检测器，从检测器输出后经第一切换阀（1）的另一个流通通道进入馏分收集口。

4.根据权利要求2所述的一种舒更葡糖的分离纯化方法，其特征在于：

所述步骤3)中，双柱目标峰收集模式具体为：第一泵和第二泵均开启工作；打开第一切换阀（1），使得检测器的输出端和馏分收集口连通，且第二流动相输出端和第二泵的输入端连通；打开第二切换阀（2），仅使得第二泵的输出端和第二柱的第一端连通；打开第三切换阀（3），仅使得第二柱的第二端和第一柱的第二端连通；打开第四切换阀（4），仅使得第一泵的输入端和检测器的输入端连通，且第一泵反向工作；第二流动相输出后经第一切换阀（1）的一个流通通道进入第二泵，被第二泵泵出后再依次经第二切换阀（2）的一个流通通道进入第二柱，第二柱流出后再经第三切换阀（3）的一个流通通道进入第一柱，第一柱流出后经第一泵、第四切换阀（4）的一个流通通道进入检测器，从检测器输出后经第一切换阀（1）的另一个流通通道进入馏分收集口。

5.根据权利要求1所述的一种舒更葡糖的分离纯化方法，其特征在于：所述ODS柱为自组装柱。

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