CN107840864A - 一种螺旋霉素的纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种螺旋霉素的纯化方法，主要采用两套中压层析色谱设备，使用现有螺旋霉素粉末作为原料，用有机溶剂溶解，抽滤并经过第一道层析色谱柱以去除多糖、蛋白质等杂质；随后用旋转蒸发工艺将原有有机溶剂替换为适宜第二步层析所适宜的溶剂。经过提纯得到的低浓度洗脱液多批合并浓缩后结晶，得到的螺旋霉素纯度为98.8％以上。通过本发明所示出的一种螺旋霉素的纯化方法，避免了有机溶剂残留，安全环保，具有生产周期短、操作方便等特点，为螺旋霉素的分离纯化提供了一种可行工艺，且最终纯化制备得到的螺旋霉素的纯度较高。

Description

一种螺旋霉素的纯化方法

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，尤其涉及一种螺旋霉素的纯化方法。

背景技术

螺旋霉素(Spiramycin)为白色或微黄色粉末，微有味；微吸湿；本品在甲醇、乙醇、丙酮或乙醚中溶解，在水中几乎不溶，在石油醚中不溶。是从Streptomyces ambofaciens的培养液中获得的一种大环内酯类抗生素。螺旋霉素为乙酰螺旋霉素的醋酸酯，口服后去乙酰基而显示较强抗菌作用。

螺旋霉素是一种很强的抑菌剂，仅在很高的浓度时才呈杀菌作用。本品具有强大的体内抗菌作用和抗菌后效应(PAE)，能够增强吞噬细胞的吞噬作用，广泛分布于体内。本品在组织细胞内浓度较红霉素高，而副作用小于红霉素。本品可用于治疗由革兰阳性菌和某些革兰阴性菌引起的耳、鼻、喉和呼吸道感染，适用于治疗敏感菌所致的中耳炎、牙周炎、急性鼻窦炎等口腔及耳鼻咽喉科感染。也可用于治疗弓形虫病。

螺旋霉素口服后，在体内显示较强的抗菌活性，并很快分布到组织和体液中，胆汁中浓度最高，为血中浓度的7～10倍，且有一定量透过血-脑脊液屏障，尤其是脑膜炎时脑脊液中浓度更高。

据报道治疗孕期与育龄妇女弓形虫感染及对宫内传播的影响，结果显示，孕妇与育龄妇女弓形虫近期感染率为11.61％和7.81％，治疗组孕妇和育龄妇女IgM转阴率分别为67.16％和70.49％，而非治疗组的自然转阴率分别为14.29％和13.64％；治疗组宫内传播率为7.46％，非治疗组为21.05％，差异非常显著。螺旋霉素是治疗弓形虫感染的安全有效的药物，可明显降低宫内传播率。

国内对低纯度螺旋霉素原料粉末的生产研究已经日渐成熟，产量与疗效都经过了长时间的生产检验，但在创新研究、提高纯度、改进有效成分所占比例的研究上尚处于起步阶段。

发明内容

本发明的目的在于公开一种螺旋霉素的纯化方法，用以实现从低纯度的螺旋霉素中将杂质进行分离，以得到高纯度的螺旋霉素。

为实现上述发明目的，本发明提供了一种螺旋霉素的纯化方法，包括以下步骤：

1)将低纯度螺旋霉素粉末使用乙酸乙酯溶解，使用过滤孔径为0.45微米的微孔有机滤膜抽滤去除大分子杂质，得样液；

2)在第一套中压层析色谱设备中使用柱层析硅胶作为固定相，使用乙酸乙酯和/或乙醇进行清洗和平衡；

3)将步骤1)中所得的样液在第一套中压层析色谱设备中上样，使用乙酸乙酯和/或乙醇洗脱，收集洗脱液，旋转蒸发，使用乙酸乙酯和/或乙醇溶解，使用过滤孔径为0.45微米的微孔有机滤膜抽滤，得混合溶液；

4)在第二套中压层析色谱设备中使用凝胶柱作为固定相，装柱后备用；

5)使用清洗剂清洗凝胶柱，将步骤3)中所得的混合溶液在第二套中压层析色谱设备中上样，使用洗脱剂经过多段洗脱得到洗脱液；

6)将步骤5)中所得的洗脱液多批合并，使用纳滤膜浓缩，并进行除盐操作，得浓缩液；

7)将步骤6)中所得的浓缩液进行结晶，抽滤并烘干。

作为本发明的进一步改进，所述步骤2)中的柱层析硅胶的粒径范围为300～400目，压力条件为80psi～100psi。

作为本发明的进一步改进，所述步骤3)中的旋转蒸发的蒸发温度为40℃温度，转速为70rpm，真空度为-0.09MPa～-0.1MPa。

作为本发明的进一步改进，所述步骤5)中的清洗剂与洗脱剂均为以下任一溶剂：

PH4.15±0.05，电导率90±10μs/cm的醋酸-醋酸钠缓冲溶液；

PH4.60±0.05，电导率600±10μs/cm的醋酸-醋酸钠缓冲溶液；

PH5.80±0.05，电导率820±10μs/cm的醋酸-醋酸钠缓冲溶液。

作为本发明的进一步改进，所述步骤5)中混合溶液在第二套中压层析色谱设备中上样的指标为：电导率320±10μs/cm、PH4.5±0.05。

作为本发明的进一步改进，所述步骤6)中所选用的纳滤膜的分子量为200，浓缩条件为：温度10℃～30℃、压力0.8MPa～1.2MPa。

作为本发明的进一步改进，所述步骤6)中除盐合格标准为：浓缩液电导率小于或者等于300μs/cm。

作为本发明的进一步改进，所述步骤7)中，结晶前的浓缩液应满足以下条件：浓度为75g/L～80g/L、PH9.30～9.60。

作为本发明的进一步改进，所述步骤7)中，将步骤6)中所得的浓缩液进行结晶具体为：使用纯蒸汽加热步骤6)中所得的浓缩液至60℃～65℃，随后立即抽滤并用65℃～70℃的纯化水淋洗，以进行结晶。

作为本发明的进一步改进，所述步骤7)中的烘干具体为：抽滤所得样品以滤纸包裹，置于真空烘箱中烘干；

所述真空烘箱中的烘干温度设定为35℃～40℃，真空烘箱的真空度为-0.098MPa～-0.102MPa。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：通过本发明所示出的一种螺旋霉素的纯化方法，避免了有机溶剂残留，安全环保，具有生产周期短、操作方便等特点，为螺旋霉素的分离纯化提供了一种可行工艺，且最终纯化制备得到的螺旋霉素的纯度较高。

附图说明

图1为通过实施例1所最终得到的螺旋霉素的HPLC图谱。

具体实施方式

下面结合附图所示的各实施方式对本发明进行详细说明，但应当说明的是，这些实施方式并非对本发明的限制，本领域普通技术人员根据这些实施方式所作的功能、方法、或者结构上的等效变换或替代，均属于本发明的保护范围之内。

实施例1：

本实施例所示出的一种螺旋霉素的纯化方法，其包括以下步骤：

步骤1)：称取250g低纯度的螺旋霉素粉末(纯度为92％左右)，用乙酸乙酯溶解并抽滤。

步骤2)：在第一套中压层析色谱设备中使用柱层析硅胶作为固定相，使用乙酸乙酯进行清洗和平衡。柱层析硅胶的粒径范围为300目，压力条件为80psi。

步骤3)：将步骤1)中所得的样液在第一套中压层析色谱设备中上样，使用乙酸乙酯和/或乙醇洗脱，收集洗脱液，旋转蒸发，使用乙酸乙酯和/或乙醇溶解，使用过滤孔径为0.45微米的微孔有机滤膜抽滤，得混合溶液。所述步骤3)中的旋转蒸发的蒸发温度为40℃温度，转速为70rpm，真空度为-0.09MPa。在本实施例中，通过第一套中压层析色谱设备，有效地去除了低纯度的螺旋霉素中的多糖、蛋白质等大分子杂质。

步骤4)：在第二套中压层析色谱设备中使用凝胶柱作为固定相，装柱后备用。凝胶柱为美国GE公司生产的SP-HP凝胶或者其他适合的填料，并以其吸附与梯度分离效果为准。在本步骤中，应避免吸入空气。例如，可使用四通阀装置将气泡从旁路中排出，或者避免抽取液体的管道口暴露在空气中等技术手段，避免吸入空气。

步骤5)：使用清洗剂清洗凝胶柱，将步骤3)中所得的混合溶液在第二套中压层析色谱设备中上样，使用洗脱剂经过多段洗脱得到洗脱液。其中，所述步骤5)中的清洗剂与洗脱剂均为：PH4.15±0.05，电导率90±10μs/cm的醋酸-醋酸钠缓冲溶液。步骤5)中混合溶液在第二套中压层析色谱设备中上样的指标为：电导率310μs/cm、PH4.45。

步骤6)：将步骤5)中所得的洗脱液多批合并，使用纳滤膜浓缩，并进行除盐操作，得浓缩液。步骤6)中所选用的纳滤膜的分子量为200，浓缩条件为：温度10℃、压力0.8MPa。步骤6)中除盐合格标准为：浓缩液电导率小于或者等于300μs/cm。在本实施例中，通过对洗脱液多批合并、使用纳滤膜浓缩及除盐操作，以确保灰分合格。合并洗脱液的次数可为一次，也可为两次或者三次，以浓缩液电导率小于或者等于300μs/cm为判断标准。

步骤7)：将步骤6)中所得的浓缩液进行结晶，抽滤并烘干，得高纯度螺旋霉素粉末。具体的，步骤7)中使用纯蒸汽加热步骤6)中所得的浓缩液至60℃，随后立即抽滤并用65℃的纯化水淋洗，以进行结晶。抽滤所得样品以滤纸包裹，置于真空烘箱中烘干，真空烘箱中的烘干温度设定为35℃，真空烘箱的真空度为-0.098MPa。在本实施例中，结晶前浓缩液满足以下条件：浓度为75g/LL，PH9.30。另外，抽滤操作可使用步骤3)中所使用的过滤孔径为0.45微米的微孔有机滤膜。

本实施例所最终制备得到的高纯度螺旋霉素粉末使用高效液相色谱检测，测得螺旋霉素的纯度为99％，总收率21％。其中，高效液相色谱检测方法参考EP8.0标准，作为固定相的填料为Agela Venusil XBP C18(A)，粒径：5μm，柱规格：4.6×250mm或性能相当柱，流速1.0ml/min，柱温60℃，检测波长232nm，进样量20μl。流动相为pH6.5的磷酸盐缓冲溶液、乙腈与水以5:38:57比例(摩尔比)混合，该比例可适当调整使螺旋霉素组分的保留时间为20～30min，以便于螺旋霉素被更为有效地洗脱分离。

实施例2：

本实施例所示出的一种螺旋霉素的纯化方法，其包括以下步骤：

步骤1)：称取260g低纯度的螺旋粉末(纯度为92％左右)，用乙酸乙酯与乙醇以任意比例混合而成的有机溶剂进行溶解并抽滤。

步骤2)：在第一套中压层析色谱设备中使用柱层析硅胶作为固定相，使用乙酸乙酯和/或乙醇进行清洗和平衡。柱层析硅胶的粒径范围为400目，压力条件为100psi。

步骤3)：将步骤1)中所得的样液在第一套中压层析色谱设备中上样，使用乙酸乙酯和/或乙醇洗脱，收集洗脱液，旋转蒸发，使用乙酸乙酯和/或乙醇溶解，使用过滤孔径为0.45微米的微孔有机滤膜抽滤，得混合溶液。步骤3)中的旋转蒸发的蒸发温度为40℃温度，转速为70rpm，真空度为-0.1MPa。

步骤4)：在第二套中压层析色谱设备中使用凝胶柱作为固定相，装柱后备用。

步骤5)：使用清洗剂清洗凝胶柱，将步骤3)中所得的混合溶液在第二套中压层析色谱设备中上样，使用洗脱剂经过多段洗脱得到洗脱液。所述步骤5)中的清洗剂与洗脱剂均为：PH4.60±0.05，电导率600±10μs/cm的醋酸-醋酸钠缓冲溶液。混合溶液在第二套中压层析色谱设备中上样的指标为：电导率320μs/cm、PH4.5。

步骤6)：将步骤5)中所得的洗脱液多批合并，使用纳滤膜浓缩，并进行除盐操作，得浓缩液。步骤6)中所选用的纳滤膜的分子量为200，浓缩条件为：温度30℃、压力1.2MPa。步骤6)中除盐合格标准为：浓缩液电导率小于或者等于300μs/cm。

步骤7)：将步骤6)中所得的浓缩液进行结晶，抽滤并烘干，得高纯度螺旋霉素粉末。具体的，步骤7)中使用纯蒸汽加热步骤6)中所得的浓缩液至65℃，随后立即抽滤并用70℃的纯化水淋洗，以进行结晶。抽滤所得样品以滤纸包裹，置于真空烘箱中烘干，真空烘箱中的烘干温度设定为40℃，真空烘箱的真空度为-0.102MPa。在本实施例中，结晶前浓缩液满足以下条件：浓度为80g/L、PH9.60。

本实施例所最终制备得到的高纯度螺旋霉素粉末使用高效液相色谱检测，测得螺旋霉素的纯度为98.8％，总收率22％。在本实施例中，对最终制备得到的螺旋霉素粉末进行高效液相色谱检测的条件参实施例1所述，在此不再赘述。同时，本实施例中与实施例1相同部分的技术方案，参实施例1所述。

实施例3：

本实施例所示出的一种螺旋霉素的纯化方法，其包括以下步骤：

步骤1)：称取250g低纯度的螺旋霉素粉末(纯度为92％左右)，用乙醇溶解并抽滤。

步骤2)：在第一套中压层析色谱设备中使用柱层析硅胶作为固定相，使用乙酸乙酯和/或乙醇进行清洗和平衡。柱层析硅胶的粒径范围为370目，压力条件为95psi。

步骤3)：将步骤1)中所得的样液在第一套中压层析色谱设备中上样，使用乙酸乙酯和/或乙醇洗脱，收集洗脱液，旋转蒸发，使用乙酸乙酯和/或乙醇溶解，使用过滤孔径为0.45微米的微孔有机滤膜抽滤，得混合溶液。

步骤4)：在第二套中压层析色谱设备中使用凝胶柱作为固定相，装柱后备用。

步骤5)：使用清洗剂清洗凝胶柱，将步骤3)中所得的混合溶液在第二套中压层析色谱设备中上样，使用洗脱剂经过多段洗脱得到洗脱液。所述步骤5)中的清洗剂与洗脱剂均为：PH5.80±0.05，电导率820±10μs/cm的醋酸-醋酸钠缓冲溶液。混合溶液在第二套中压层析色谱设备中上样的指标为：电导率330μs/cm、PH4.55。

步骤6)：将步骤5)中所得的洗脱液多批合并，使用纳滤膜浓缩，并进行除盐操作，得浓缩液。步骤6)中所选用的纳滤膜的分子量为200，浓缩条件为：温度20℃、压力0.9MPa。步骤6)中除盐合格标准为：浓缩液电导率小于或者等于300μs/cm。

步骤7)：将步骤6)中所得的浓缩液进行结晶，抽滤并烘干，得高纯度螺旋霉素粉末。具体的，步骤7)中使用纯蒸汽加热步骤6)中所得的浓缩液至62℃，随后立即抽滤并用68℃的纯化水淋洗，以进行结晶。抽滤所得样品以滤纸包裹，置于真空烘箱中烘干，真空烘箱中的烘干温度设定为35℃，真空烘箱的真空度为-0.100MPa。在本实施例中，结晶前浓缩液满足以下条件：浓度为78g/L，PH9.50。

本实施例所最终制备得到的高纯度螺旋霉素粉末使用高效液相色谱检测，测得螺旋霉素的纯度为99％，总收率28％。在本实施例中，对最终制备得到的螺旋霉素粉末进行高效液相色谱检测的条件参实施例1所述，在此不再赘述。同时，本实施例中与实施例1和/或实施例2相同部分的技术方案，参实施例1和/或实施例2所述。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (10)

1.一种螺旋霉素的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将低纯度螺旋霉素粉末使用乙酸乙酯溶解，使用过滤孔径为0.45微米的微孔有机滤膜抽滤去除大分子杂质，得样液；

2)在第一套中压层析色谱设备中使用柱层析硅胶作为固定相，使用乙酸乙酯和/或乙醇进行清洗和平衡；

3)将步骤1)中所得的样液在第一套中压层析色谱设备中上样，使用乙酸乙酯和/或乙醇洗脱，收集洗脱液，旋转蒸发，使用乙酸乙酯和/或乙醇溶解，使用过滤孔径为0.45微米的微孔有机滤膜抽滤，得混合溶液；

4)在第二套中压层析色谱设备中使用凝胶柱作为固定相，装柱后备用；

5)使用清洗剂清洗凝胶柱，将步骤3)中所得的混合溶液在第二套中压层析色谱设备中上样，使用洗脱剂经过多段洗脱得到洗脱液；

6)将步骤5)中所得的洗脱液多批合并，使用纳滤膜浓缩，并进行除盐操作，得浓缩液；

7)将步骤6)中所得的浓缩液进行结晶，抽滤并烘干。

2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤2)中的柱层析硅胶的粒径范围为300～400目，压力条件为80psi～100psi。

3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤3)中的旋转蒸发的蒸发温度为40℃温度，转速为70rpm，真空度为-0.09MPa～-0.1MPa。

4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤5)中的清洗剂与洗脱剂均为以下任一溶剂：

PH4.15±0.05，电导率90±10μs/cm的醋酸-醋酸钠缓冲溶液；

PH4.60±0.05，电导率600±10μs/cm的醋酸-醋酸钠缓冲溶液；

PH5.80±0.05，电导率820±10μs/cm的醋酸-醋酸钠缓冲溶液。

5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤5)中混合溶液在第二套中压层析色谱设备中上样的指标为：电导率320±10μs/cm、PH4.5±0.05。

6.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤6)中所选用的纳滤膜的分子量为200，浓缩条件为：温度10℃～30℃、压力0.8MPa～1.2MPa。

7.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤6)中除盐合格标准为：浓缩液电导率小于或者等于300μs/cm。

8.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤7)中，结晶前的浓缩液应满足以下条件：浓度为75g/L～80g/L、PH9.30～9.60。

9.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤7)中，将步骤6)中所得的浓缩液进行结晶具体为：使用纯蒸汽加热步骤6)中所得的浓缩液至60℃～65℃，随后立即抽滤并用65℃～70℃的纯化水淋洗，以进行结晶。

10.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤7)中的烘干具体为：抽滤所得样品以滤纸包裹，置于真空烘箱中烘干；

所述真空烘箱中的烘干温度设定为35℃～40℃，真空烘箱的真空度为-0.098MPa～-0.102MPa。