CN111534593A - 反义RNAch-MYC-AS1表达Northern blot检测引物、试剂盒 - Google Patents

反义RNAch-MYC-AS1表达Northern blot检测引物、试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明具体涉及一种反义RNAch‑MYC‑AS1表达Northern blot检测引物、试剂盒，属于分子生物学领域。所述引物的序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示。本发明进一步提供了ch‑MYC‑AS1表达Northern blot检测试剂盒，为ch‑MYC‑AS1表达规律分析提供了方法和基础。

Description

反义RNAch-MYC-AS1表达Northern blot检测引物、试剂盒
技术领域
本发明涉及一种反义RNAch-MYC-AS1表达Northern blot检测引物、试剂盒，属于分子生物学领域。
背景技术
原癌基因c-myc最先被鉴定为禽白血病病毒诱导淋巴瘤的常见整合位点，并在肿瘤发生中扮演着关键角色。在禽白血病病毒易感品系鸡中，由于“强”病毒启动子的插入，前病毒整合入c-myc原癌基因后由病毒启动子LTR驱动c-myc基因高表达从而诱发法氏囊淋巴瘤。禽白血病病毒感染引起的致癌蛋白MYC的异常高表达影响了鸡法氏囊组织的基因表达谱，这是导致淋巴瘤发生的重要原因。而在禽白血病病毒抗性品系鸡中，机体通过减少病毒启动子LTR驱动的c-myc基因高表达，从而对前病毒整合入c-myc原癌基因后诱导的淋巴瘤产生了抗性。因此，通过降低致癌蛋白MYC表达是一种抵抗禽白血病病毒诱导淋巴瘤发生的有效策略。
对反义RNA的研究中，我们意外发现不仅抑癌基因存在反义RNA，许多癌基因也存在反义RNA。在癌细胞中，这些反义RNA处于沉默(Silencing)状态，DNA甲基化抑制剂AZA可明显激活这些反义RNA表达，且反义RNA与对应的正义癌基因呈显著负相关关系。因此，癌细胞中的一些癌基因可能受其反义RNA的调控，这些癌基因的激活可能归因于它们反义RNA的表观遗传沉默，致使癌基因去抑制，从而导致癌基因的激活。这种全新的癌基因的致癌表观遗传学机制，不仅对基础研究和临床医学研究均具重大意义，也对抗肿瘤病毒研究具有重要意义。癌基因衍生的反义RNA在抑制肿瘤细胞和肿瘤病毒增殖中的作用及其表观遗传学机制将逐渐被阐明，有望成为新型的抗肿瘤和病毒药物。
发明内容
本发明通过双链RNA文库测序在鸡2号染色体上鉴定出一条原癌基因c-myc衍生的反义RNA，命名为ch-MYC-AS1。研究表明，ch-MYC-AS1可以抑制原癌基因c-myc表达并抑制J亚群禽白血病病毒增殖。因此，进一步了解ch-MYC-AS1在不同组织细胞的表达规律显得尤为重要。本发明的目的是提供一种反义RNAch-MYC-AS1表达Northern blot检测引物、试剂盒。
本发明的目的是这样实现的，一种反义RNAch-MYC-AS1表达Northern blot检测引物，其特征在于，所述引物的序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；其中：
SEQ ID NO.8为：5’-GTATTCTAAGTGATGTCCAAG-3’；
SEQ ID NO.9为：5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGAACAAGAAGAAGATGAGG-3’。
一种反义RNA ch-MYC-AS1表达Northern blot检测试剂盒，包括DIG标记探针、杂交液和检测液，其特征在于，用于制备DIG标记探针的特异性引物序列如SEQ ID NO.8和SEQID NO.9所示；其中：
SEQ ID NO.8为：5’-GTATTCTAAGTGATGTCCAAG-3’；
SEQ ID NO.9为：5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGAACAAGAAGAAGATGAGG-3’。
利用引物在制备ch-MYC-AS1 Northern blot试剂盒中的应用。
通过本发明，提供了用于检测反义RNAch-MYC-AS1表达的特异性引物，所述特异性引物的序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示。本发明进一步公开了所述特异性引物在制备ch-MYC-AS1 Northern blot试剂盒中的应用。本发明还提供了一种反义RNAch-MYC-AS1表达Northern blot检测试剂盒，包括DIG标记探针、杂交液和检测液，用于制备DIG标记探针的特异性引物序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示。
本发明提供的反义RNA ch-MYC-AS1 Northern blot检测引物、试剂盒，为检测ch-MYC-AS1的表达规律提供了研究方法和基础。
附图说明
图1是ch-MYC-AS1Northern blot结果图；
图2A是鸡原癌基因c-myc反义RNA ch-MYC-AS1的鉴定，ch-MYC-AS1在鸡2号染色体上的位置示意图；
图2B是鸡原癌基因c-myc反义RNAch-MYC-AS1的鉴定，ch-MYC-AS1 5′-RACE琼脂糖凝胶电泳图；
图2C是鸡原癌基因c-myc反义RNAch-MYC-AS1的鉴定，ch-MYC-AS1 3′-RACE琼脂糖凝胶电泳图。
图3A是ch-MYC-AS1抑制原癌基因c-myc基因表达能力分析，RT-qPCR分析过表达ch-MYC-AS1对原癌基因c-myc基因表达的影响；
图3B是ch-MYC-AS1抑制原癌基因c-myc基因表达能力分析，Western-blot分析过表达ch-MYC-AS1对原癌基因c-myc基因表达的影响。
图4A是ch-MYC-AS1抑制J亚群禽白血病病毒增殖能力分析，ELISA分析过表达ch-MYC-AS1对J亚群禽白血病病毒增殖的影响；
图4B是ch-MYC-AS1抑制J亚群禽白血病病毒增殖能力分析，TCID50分析过表达ch-MYC-AS1对J亚群禽白血病病毒增殖的影响；
图4C是ch-MYC-AS1抑制J亚群禽白血病病毒增殖能力分析，RT-qPCR分析过表达ch-MYC-AS1对J亚群禽白血病病毒增殖的影响；
图4D是ch-MYC-AS1抑制J亚群禽白血病病毒增殖能力分析，Western-blot分析过表达ch-MYC-AS1对J亚群禽白血病病毒增殖的影响。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1ch-MYC-AS1全长序列的测定。
(1)鉴定ch-MYC-AS1的5′和3′末端序列
主要由Takara公司提供的
Figure BDA0002494935370000031
RACE 5’/3’Kit试剂盒来完成。
首先，用
Figure BDA0002494935370000032
Reagent提取鸡巨噬细胞系HD11总RNA，然后用RNase-free DNaseI去除基因组。在SMARTScribeReverse Transcriptase(试剂盒提供)的作用下分别将1μg去除基因组的RNA逆转录合成5′-或3′-RACE产物。
然后，按照
Figure BDA0002494935370000033
RACE 5’/3’Kit试剂盒的操作说明，利用通用引物UPM分别与5′-末端或3′-末端基因特异性引物(gene-specific primer，GSP)进行PCR扩增(RACE琼脂糖凝胶电泳图见图2B、图2C)，克隆测序获得ch-MYC-AS1的5′末端和3′末端序列。其中，所用5′-末端或3′-末端基因特异性引物的核苷酸序列如下：
ch-MYC-AS1-5-race：
5′-TCAGAGGAGAACGACAAGAGGCGAACG-3′(SEQ ID NO.6)
ch-MYC-AS1-3-race：
5′-TCCTCCGCCTCAACTGCTCTTTCTCTG-3′(SEQ ID NO.7)。
(2)常规PCR扩增ch-MYC-AS1产物。其中，所用引物ch-MYC-AS1-F和ch-MYC-AS1-R的核苷酸序列如下：
ch-MYC-AS1-F：5′-GATTCTAAGTGATGTCCAAG-3′(SEQ ID NO.2)
ch-MYC-AS1-R：5′-TTTTTCTTCCGACACGCC-3′(SEQ ID NO.3)
其反应体系包括：100ng鸡胚成纤维细胞cDNA产物作为模板，1μL(10μM)上游引物ch-MYC-AS1-F与1μL(10μM)ch-MYC-AS1-R分别作为扩增引物，1μL DNA Polymerase，10μL5x SF Buffer，1μL(10μM)dNTP Mix和32μL ddH2O。
其反应条件为：95℃3min；95℃15s，58℃90s，72℃1min，35x循环；72℃7min；4℃维持。
(3)TA克隆测序获得ch-MYC-AS1的全长cDNA序列，该序列在鸡2号染色体上的位置示意图见图2A。具体cDNA序列如SEQ ID NO.1。
SEQ ID NO.1
gtattctaagtgatgtccaagagttcctatgcacgagagttccttagctgctcaaggttgtgtttcaactgttctctcctccgcctcaactgctctttctctgcgatcagtctgtgctcgtccgattggatagacagaacgtactccgtggcttttttcaggatgacaaccttgggcgccttctcgttgttggccaccccgggtatctggtcacgcagggcaaagaatctcagcttcagctcattccttcgctggcgctccaagacgtcgtgcgttcgcctcttgtcgttctcctctgagtctaacgtgcggggactggagcattttcggttgttgctgatctgtttgaggaccctgccactgtccaactttagcctcttggcggctgggtattccaccttggtggagggaggagcagcgtagttgtgttggtggatgttgacgtgacaccgcttgaggaccagcggactgtggtggggcttacagtgctcctctgatgcttctgtgctggactctgtgctggattcagactcgttcgcttcagctaatgtaacgacatcgatttcctcatcttcttcttgttcttcttccgagtcgctgctggtcgtgggcggcgtgtcg
实施例2ch-MYC-AS1过表达载体构建。
本实施例2中，使用从实施例1中所获得的ch-MYC-AS1全长序列，构建lnc-ALVE1-AS1过表达质粒。
具体包括如下步骤：
(1)从鸡巨噬细胞系HD11中，使用
Figure BDA0002494935370000041
Reagent提取总RNA，然后用RNase-freeDNase I去除基因组。使用PrimeScript RT reagent Kit试剂盒将其逆转录成cDNA产物。
(2)以实施例2步骤(1)所获得的cDNA产物为模板，使用高保真酶扩增ch-MYC-AS1全长序列，其中，所用引物ch-MYC-AS1-HindIII-F和ch-MYC-AS1-BamHI-R的核苷酸序列如下：
ch-MYC-AS1-HindIII-F:
5′-cccaagcttGATTCTAAGTGATGTCCAAG-3′(SEQ ID NO.4)
ch-MYC-AS1-BamHI-R:
5′-cgcggatccTTTTTCTTCCGACACGCC-3′(SEQ ID NO.5)
其反应体系包括：100ng实施例2步骤(1)所获得的cDNA产物作为模板，1μL(10μM)上游引物ch-MYC-AS1-HindIII-F与1μL(10μM)ch-MYC-AS1-BamHI-R分别作为扩增引物，1μLDNA Polymerase，10μL 5x SF Buffer，1μL(10μM)dNTP Mix和32μL ddH2O。
其反应条件为：95℃3min；95℃15s，58℃90s，72℃1min，35x循环；72℃7min；4℃维持。
(3)以实施例2步骤(2)中PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后切胶回收产物并连接至T载体进行克隆测序。测序正确的阳性克隆质粒与pcDNA3.1(+)(Invitrogen)过表达质粒载体分别用HindIII和-BamHI酶切。最后，酶切回收的lnc-ALVE1-AS1目的片段DNA和pcDNA3.1(+)载体DNA用T4 DNA ligase进行连接，连接产物直接转化大肠杆菌。重组子经PCR、酶切和克隆测序鉴定正确后，命名为pcDNA3.1-ch-MYC-AS1。
实施例3ch-MYC-AS1抑制原癌基因c-myc基因表达能力分析。
本实施例3中，使用从实施例2中所获得的pcDNA3.1-ch-MYC-AS1过表达质粒，通过荧光定量PCR和Western-blot方法评估了ch-MYC-AS1抑制鸡原癌基因c-myc基因表达能力。
具体包括如下步骤：
(1)将鸡巨噬细胞系HD11细胞接种至6孔细胞培养板，然后转染pcDNA3.1-ch-MYC-AS1过表达质粒。同时转染GFP过表达质粒作为载体对照。
(2)转染后48小时，收集细胞；
(3)提取总RNA，使用荧光定量PCR方法检测原癌基因c-myc表达水平。
(4)提取总蛋白，Western-blot分析原癌基因c-myc蛋白表达水平。将pcDNA3.1-ch-MYC-AS1和GFP过表达质粒转染后的细胞裂解液进行SDS-PAGE,然后按照Western-blot操作步骤转移到硝酸纤维素膜，5％脱脂乳封闭后分别加入鸡c-MYC抗体和HRP标记的山羊抗鼠IgG进行孵育，观察结果。
通过荧光定量PCR和Western-blot分析，我们观察到ch-MYC-AS1可以显著抑制原癌基因c-myc表达(图3A、图3B)。
实施例4ch-MYC-AS1抗J亚群禽白血病病毒增殖能力分析。
本实施例4中，使用从实施例2中所获得的pcDNA3.1-ch-MYC-AS1过表达质粒，通过ELISA、TCID50、荧光定量PCR和Western-blot方法评估了ch-MYC-AS1抗J亚群禽白血病病毒增殖能力。
具体包括如下步骤：
(1)将鸡巨噬细胞系HD11接种至6孔细胞培养板，然后感染J亚群禽白血病病毒(J亚群禽白血病病毒毒株JS09GY3，GenBank accession number GU982308)。
(2)病毒感染后4小时后转染ch-MYC-AS1过表达质粒；同时转染GFP过表达质粒作为载体对照。
(3)转染后48小时，收集上清，使用IDEXX禽白血病抗原检测试剂盒检测J亚群禽白血病病毒p27蛋白表达水平。
(4)转染后48小时，收集细胞和上清，使用TCID50方法测定J亚群禽白血病病毒滴度。
(5)转染后48小时，收集细胞，分别提取总RNA和蛋白，使用荧光定量PCR和Western-blot检测J亚群禽白血病病毒env基因mRNA和蛋白表达水平通过ELISA、TCID50、荧光定量PCR和Western-blot实验，我们观察到ch-MYC-AS1可以显著抑制J亚群禽白血病病毒增殖(图4A、图4B、图4C、图4D)。
实施例5ch-MYC-AS1 Northern blot检测。
(1)ch-MYC-AS1探针制备。根据Roche公司提供的DIG Northern Starter Kit试剂盒说明书，使用含有T7 RNA聚合酶启动子序列的引物和高保真酶进行常规PCR扩增获得ch-MYC-AS1部分片段用于探针标记。其中，所用引物ch-MYC-AS1-probe-F和ch-MYC-AS1-T7-probe-R的核苷酸序列如下：
ch-MYC-AS1-probe-F(SEQ ID NO.8)：
5’-GTATTCTAAGTGATGTCCAAG-3’
ch-MYC-AS1-T7-probe-R(SEQ ID NO.9)：
5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGAACAAGAAGAAGATGAGG-3’
取4μl PCR产物并用RNase-free水补充至10μl，依次加入4μl 5×Labeling mix、4μl 5×Transcription buffer和2μl T7 RNA polymerase，混匀并短暂离心后42度孵育1小时。然后加入2μl DNase I,RNase-free去除模板DNA，37度作用15分钟；最后加入2μl0.2MEDTA(pH 8.0)终止反应。所获得的反应产物就是针对lnc-ALVE1-AS1的探针混合物。
(2)总RNA提取。使用
Figure BDA0002494935370000061
Reagent从AZA或DMSO处理48小时的鸡巨噬细胞系HD11提取总RNA，测定浓度后用RNase-free DNase I去除基因组。
(3)RNA电泳。在含有2％甲醛凝胶中进行RNA电泳。
(4)转膜。电泳结束后，采用毛细管电泳转印法在20×SSC中转膜过夜。
(5)固定。将尼龙膜放在80度下真空烘烤2小时使RNA固定到膜上。
(6)预杂交。将尼龙膜移至含有预杂交液的杂交管中，在分子杂交仪中68度温和震荡30分钟，进行预杂交。
(7)杂交。将尼龙膜移至含有ch-MYC-AS1探针杂交液的杂交管中，在分子杂交仪中68度温和震荡，进行过夜杂交。
(8)免疫检测。杂交结束后，使用DIG Northern Starter Kit试剂盒中提供的地高辛检测试剂进行免疫反应。
(9)显色拍照。结果如图1所示，该方法可以检测ch-MYC-AS1表达。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 反义RNAch-MYC-AS1表达Northern blot检测引物、试剂盒
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 621
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 1
gtattctaag tgatgtccaa gagttcctat gcacgagagt tccttagctg ctcaaggttg 60
tgtttcaact gttctctcct ccgcctcaac tgctctttct ctgcgatcag tctgtgctcg 120
tccgattgga tagacagaac gtactccgtg gcttttttca ggatgacaac cttgggcgcc 180
ttctcgttgt tggccacccc gggtatctgg tcacgcaggg caaagaatct cagcttcagc 240
tcattccttc gctggcgctc caagacgtcg tgcgttcgcc tcttgtcgtt ctcctctgag 300
tctaacgtgc ggggactgga gcattttcgg ttgttgctga tctgtttgag gaccctgcca 360
ctgtccaact ttagcctctt ggcggctggg tattccacct tggtggaggg aggagcagcg 420
tagttgtgtt ggtggatgtt gacgtgacac cgcttgagga ccagcggact gtggtggggc 480
ttacagtgct cctctgatgc ttctgtgctg gactctgtgc tggattcaga ctcgttcgct 540
tcagctaatg taacgacatc gatttcctca tcttcttctt gttcttcttc cgagtcgctg 600
ctggtcgtgg gcggcgtgtc g 621
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 2
gattctaagt gatgtccaag 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 3
tttttcttcc gacacgcc 18
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 4
cccaagcttg attctaagtg atgtccaag 29
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 5
cgcggatcct ttttcttccg acacgcc 27
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 6
tcagaggaga acgacaagag gcgaacg 27
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 7
tcctccgcct caactgctct ttctctg 27
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 8
gtattctaag tgatgtccaa g 21
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 9
taatacgact cactataggg agaacaagaa gaagatgagg 40

Claims (3)

1. 一种反义RNAch-MYC-AS1表达Northern blot检测引物，其特征在于，所述引物的序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；其中：
SEQ ID NO.8为：5’-GTATTCTAAGTGATGTCCAAG-3’；
SEQ ID NO.9为：5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGAACAAGAAGAAGATGAGG-3’。
2. 一种反义RNA ch-MYC-AS1表达Northern blot检测试剂盒，包括DIG标记探针、杂交液和检测液，其特征在于，用于制备DIG标记探针的特异性引物序列如SEQ ID NO.8和SEQID NO.9所示；其中：
SEQ ID NO.8为：5’-GTATTCTAAGTGATGTCCAAG-3’；
SEQ ID NO.9为：5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGAACAAGAAGAAGATGAGG-3’。
3. 利用权利要求1所述的引物在制备ch-MYC-AS1 Northern blot试剂盒中的应用。
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