CN111484635B - 一种温敏性水凝胶材料的改性方法、改性温敏性水凝胶材料和生物3d打印墨水 - Google Patents

一种温敏性水凝胶材料的改性方法、改性温敏性水凝胶材料和生物3d打印墨水 Download PDF

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Abstract

一种温敏性水凝胶材料的改性方法、改性温敏性水凝胶材料和生物3D打印墨水，属于水凝胶技术领域。温敏性水凝胶材料的改性方法包括使温敏性水凝胶材料的交联网络部分结晶化。结晶体是一种高度有序且稳定的物体，温敏性水凝胶材料的交联网络部分结晶化后有助于稳定水凝胶的交联网络结构从而使其在剪切力的作用下能够得到恢复。交联网络部分结晶化使温敏性水凝胶材料的交联网络存在结晶区域，相较于无定型的交联网络，结晶区域的存在能够显著提高交联网络的稳定性及水凝胶的力学强度，并且水凝胶依旧保持具备剪切变稀和快速固化的性质。

Description

一种温敏性水凝胶材料的改性方法、改性温敏性水凝胶材料 和生物3D打印墨水
技术领域
本申请涉及水凝胶技术领域，具体而言，涉及一种温敏性水凝胶材料的改性方法、改性温敏性水凝胶材料和生物3D打印墨水。
背景技术
生物3D打印技术是一种高分辨高精度的快速成型技术，作为一个新兴研究方向而受到广泛关注。生物3D打印技术多样，其中微挤出是一种强有力的方法，料筒中的生物墨水在压力的作用下通过喷嘴挤出并在平台上逐层堆叠。因此，就需要生物墨水不仅能够流畅挤出而且能在沉积后可以快速定型。也就是说，作为可打印的生物材料需要同时具备剪切变稀和快速固化的性质。而水凝胶，尤其是温度响应性水凝胶因其能够通过温度调节实现3D建构，是微挤出的一种理想可打印材料。然而，这类水凝胶往往力学强度表现较差而导致在打印过程中发生挤出胀大甚至结构坍塌的现象。这是因为通常这类水凝胶的交联机制基于作用力较弱的氢键或是亲疏水相互作用，其交联网络往往在较强的剪切作用下会发生不可逆的破坏。
发明内容
本申请提供了一种温敏性水凝胶材料的改性方法、改性温敏性水凝胶材料和生物3D打印墨水，其能够在保证温敏性水凝胶材料具备剪切变稀和快速固化的性质的前提下，提高机械强度。
本申请的实施例是这样实现的：
在第一方面，本申请示例提供了一种温敏性水凝胶材料的改性方法，其包括使温敏性水凝胶材料的交联网络部分结晶化。
在上述技术方案中，结晶体是一种高度有序且稳定的物体，温敏性水凝胶材料的交联网络部分结晶化后有助于稳定水凝胶的交联网络结构从而使其在剪切力的作用下能够得到恢复。交联网络部分结晶化使温敏性水凝胶材料的交联网络存在结晶区域，相较于无定型的交联网络，结晶区域的存在能够显著提高交联网络的稳定性及水凝胶的力学强度，并且水凝胶依旧保持具备剪切变稀和快速固化的性质。
结合第一方面，在本申请的第一方面的第一种可能的示例中，将亲水性聚合物聚乙二醇与具有结晶性的可生物降解的聚酯的单体形成共聚物，共聚物在水凝胶状态下具有结晶性的交联网络结构。
在上述示例中，具有结晶性的聚酯的单体与亲水性的聚乙二醇共聚得到的交联网络能够部分结晶，使共聚物的结晶性能提高，有利于稳定水凝胶的交联网络结构从而使其在剪切力的作用下能够得到恢复，从而提高其机械强度。
结合第一方面，在本申请的第一方面的第二种可能的示例中，上述共聚物包括嵌段共聚物。
在上述示例中，聚乙二醇和聚酯的单体共聚形成的嵌段共聚物同时具备剪切变稀和快速固化的性能，是一种性能良好的温敏性水凝胶材料。
结合第一方面，在本申请的第一方面的第三种可能的示例中，上述聚酯包括聚己内酯。
在上述示例中，聚己内酯不仅具有较强的结晶能力，而且属于生物可降解聚酯，即生物可降解性优异。
结合第一方面，在本申请的第一方面的第四种可能的示例中，上述共聚物包括聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯。
在上述示例中，中间嵌段为聚乙二醇两端为疏水链段的聚己内酯的ABA型三嵌段共聚物相较于其他结构(两嵌段、BAB型，星型以及多嵌段结构)具有更高的凝胶模量，因为此种结构能够在水溶液中形成花瓣形的胶束，疏水段在胶束间的彼此渗透扩散能够有效桥接胶束从而形成更为稳定的交联网络结构。
结合第一方面，在本申请的第一方面的第五种可能的示例中，上述共聚包括：将聚乙二醇与ε-己内酯混合在催化剂存在下于130～150℃反应6～10h。
可选地，催化剂包括异辛酸亚锡。
可选地，聚乙二醇的分子量为4000～10000Da。
可选地，聚乙二醇与ε-己内酯的摩尔比为1：(35～50)。
第二方面，本申请提供一种改性温敏性水凝胶材料，其根据上述的温敏性水凝胶材料的改性方法改性得到。
在上述技术方案中，本申请的改性温敏性水凝胶材料的交联网络部分结晶化，不仅具有剪切变稀和快速固化的性质，而且具有较高的机械强度。能够应用于生物3D打印墨水中。
结合第二方面，在本申请的第二方面的第一种可能的示例中，上述改性温敏性水凝胶材料包括聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯，其中聚己内酯与聚乙二醇的分子量的比为0.5～1.2。
可选地，聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯中聚己内酯与聚乙二醇的分子量的比为0.55～0.75。
可选地，聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯中聚己内酯与聚乙二醇的分子量的比为0.55。
结合第二方面，在本申请的第二方面的第二种可能的示例中，上述改性温敏性水凝胶材料在水凝胶状态下的结晶度≥15％。
在上述示例中，当改性温敏性水凝胶材料在水凝胶状态下的结晶度≥15％时，改性温敏性水凝胶材料的机械性能具有较大提升。
在第三方面，本申请示例提供了一种生物3D打印墨水，其包括上述的改性温敏性水凝胶材料。
在上述技术方案中，本申请的生物3D打印墨水具有剪切变稀和快速固化的性质，而且具有较高的机械强度和生物可降解性，能够打印得到机械强度较高的水凝胶结构体。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本申请中PCL-PEG-PCL、PLLA-PEG-PLLA和PCLA-PEG-PCLA的1H NMR谱图；
图2为本申请中PCL-PEG-PCL的GPC谱图；
图3为本申请中PLLA-PEG-PLLA的GPC谱图；
图4为本申请中PCLA-PEG-PCLA的GPC谱图；
图5为本申请中PCL-PEG-PCL的DSC谱图；
图6为本申请中PLLA-PEG-PLLA的DSC谱图；
图7为本申请中PCLA-PEG-PCLA的DSC谱图；
图8为本申请中PCL-PEG-PCL的XRD谱图；
图9为本申请中PLLA-PEG-PLLA的XRD谱图；
图10为本申请中PCLA-PEG-PCLA的XRD谱图；
图11为本申请中水凝胶的第二次升温曲线的变化曲线图；
图12为本申请中浓度为50w/v％的PC2水凝胶室温下的偏光显微镜图；
图13为本申请中浓度为50w/v％的PC3水凝胶室温下的偏光显微镜图；
图14为本申请中浓度为50w/v％的PC3水凝胶65℃下15分钟后的偏光显微镜图；
图15为本申请中浓度为50w/v％的PC3水凝胶从65℃退火至室温15分钟后的偏光显微镜图；
图16为本申请中浓度为50w/v％的PC1、PC4、PA1～PA4和PCA1～PCA2室温下的偏光显微镜图；
图17为本申请中水凝胶不同浓度下随温度变化的凝胶-溶胶转变图；
图18为本申请中浓度为20w/v％的PC和PCA水凝胶的复数模量随温度上升的变化曲线图；
图19为本申请中浓度为40w/v％的PA水凝胶的复数模量随温度上升的变化曲线图；
图20为本申请中浓度为20w/v％的PC3水凝胶的不同温度下的模量-应变扫描曲线图；
图21为本申请中浓度为20w/v％的PCA1水凝胶的不同温度下的模量-应变扫描曲线图；
图22为本申请中浓度为20w/v％的PC3和PCA1水凝胶的模量-频率扫描曲线图；
图23为本申请中温度为37℃、剪切速率为0.01～100rad/s的剪切变稀测试图；
图24为本申请中水凝胶浓度为20w/v％、应变分别为0.01％和100％的触变性测试；
图25为本申请中水凝胶的3D打印效果图；
图26为本申请中成纤维细胞与浓度为5mg/mL的PC3共培养下及空白对照组的荧光显微镜图；
图27为本申请中CCK-8技术测定3天内的细胞存活率示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
温敏性水凝胶往往力学强度表现较差而导致在打印过程中发生挤出胀大甚至结构坍塌的现象。为了弥补此种缺陷，在材料上修饰碳碳双键并通过光固化的技术是比较广泛使用的方法，因为基于共价键的相互作用具有足够的强度来增强原材料的交联网络。甲基丙烯酸化的明胶(GelMA)便是这种方法的典型代表，即在本就有温度响应性的明胶上修饰碳碳双键，在体系中加入光引发剂后在特定光照下能够快速交联。光照后的GelMA的机械强度较之于未修饰的明胶有显著提高。虽然此种修饰碳碳双键的方法不仅快速简便，而且修饰方法简单，非常适合应用于微挤出。然而，该技术仍然存在问题，尤其是在原位固化过程中，光辐照会影响细胞存活率，导致材料的细胞相容性较差。
以下针对本申请实施例的一种温敏性水凝胶材料的改性方法、改性温敏性水凝胶材料和生物3D打印墨水进行具体说明：
本申请提供一种温敏性水凝胶材料的改性方法，其包括使温敏性水凝胶材料的交联网络部分结晶化。
由于温敏性水凝胶的固化方式不涉及光辐照，即温敏性水凝胶的固化方式不会影响到细胞存活率。但是基于亲疏水相互作用的成胶机制致使所形成的温敏性水凝胶机械强度较低，无法满足生物3D打印的需求。
结晶体是一种高度有序且稳定的物体，发明人想到如果聚合物能够进行有效的结晶有利于稳定水凝胶的交联网络结构从而使其在剪切力的作用下能够得到恢复。交联网络部分结晶化使温敏性水凝胶材料的交联网络存在结晶区域，相较于无定型的交联网络，结晶区域的存在能够显著提高交联网络的稳定性及水凝胶的力学强度，并且水凝胶依旧保持具备剪切变稀和快速固化的性质。
使温敏性水凝胶材料的交联网络部分结晶化的方法包括：将亲水性聚合物聚乙二醇与具有结晶性的可生物降解的聚酯的单体形成共聚物，共聚物在水凝胶状态下具有结晶性的交联网络结构。
具有结晶性的聚合物是指具有较强的结晶能力的聚合物，当具有结晶性的聚合物的单体与聚乙二醇(PEG)共聚形成共聚物后，共聚物中具有结晶性的聚合物链段能够结晶提高整个共聚物的结晶性，从而提高共聚物的力学性能。
可选地，共聚物包括嵌段共聚物。
脂肪族聚酯-聚乙二醇所形成的水凝胶，因其特有的温度敏感性、单一组分、温和的成胶过程、良好的生物相容性及生物可降解性，是生物3D打印中理想的墨水。
聚酯包括聚己内酯(PCL)。
聚己内酯不仅具有较强的结晶能力，而且属于生物可降解聚酯，即生物可降解性优异。
共聚物包括聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯。
发明人发现中间嵌段为聚乙二醇两端为疏水链段的聚己内酯的ABA型三嵌段共聚物相较于其他结构(两嵌段、BAB型，星型以及多嵌段结构)具有更高的凝胶模量，且此种结构能够在水溶液中形成花瓣形的胶束，疏水段在胶束间的彼此渗透扩散能够有效桥接胶束从而形成更为稳定的交联网络结构。
聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯的制备方法如下：
将聚乙二醇与ε-己内酯混合在催化剂存在下于130～150℃反应6～10h，其反应式如下：
待反应结束后在-20℃以下淬冷终止，并用CH2Cl2超声溶解，将溶解后的CH2Cl2溶液逐滴滴加到冰乙醚中进行沉降，白色产物逐渐析出。将混合物抽滤并用无水乙醚洗涤至少2次，所得产物进行真空干燥，得到白色固体粉末。
可选地，催化剂包括异辛酸亚锡。
可选地，聚乙二醇的分子量为4000～10000Da。
可选地，聚乙二醇与ε-己内酯的摩尔比为1：(35～50)。
可选地，反应环境为无氧无水环境。
聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯共聚物的分子量及分子量组成比例通过投料比进行控制。
本申请还提供一种改性温敏性水凝胶材料，其根据上述的温敏性水凝胶材料的改性方法改性得到。
本申请的改性温敏性水凝胶材料的交联网络部分结晶化，不仅具有剪切变稀和快速固化的性质，而且具有较高的机械强度。能够应用于生物3D打印墨水中。
当改性温敏性水凝胶材料为聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯时，聚己内酯与聚乙二醇的分子量的比为0.5～1.2。
可选地，聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯中聚己内酯与聚乙二醇的分子量的比为0.55～0.75。
可选地，聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯中聚己内酯与聚乙二醇的分子量的比为0.55。
当改性温敏性水凝胶材料的结晶度≥15％时，改性温敏性水凝胶材料的机械性能具有较大提升。
本申请还提供一种生物3D打印墨水，其包括上述的改性温敏性水凝胶材料。
本申请的生物3D打印墨水具有剪切变稀和快速固化的性质，而且具有较高的机械强度和生物可降解性，能够打印得到机械强度较高的水凝胶结构体。
以下结合实施例对本申请的一种温敏性水凝胶材料的改性方法、改性温敏性水凝胶材料和生物3D打印墨水作进一步的详细描述。
实施例1
本申请实施例提供一种温敏性水凝胶材料的改性方法、改性温敏性水凝胶材料，其包括以下步骤：
取2g末端均为羟基的聚乙二醇(Mn＝4000Da，0.5mmol)、2.28g(2.2mL、20mmol)ε-己内酯加入到25mL圆底烧瓶中，随后滴加3‰的Sn(Oct)2并在60℃下熔化，通过Ar气抽充三次除氧后，在140℃下反应8h，反应结束后在-20℃下淬冷终止，并用5mL的CH2Cl2超声溶解，将溶解的CH2Cl2溶液逐滴滴加到200mL的冰乙醚中进行沉降，白色产物逐渐析出。将混合物用砂芯漏斗抽滤并用无水乙醚洗涤3次，所得产物进行真空干燥，得到白色固体粉末PC1，共聚物为PCL-PEG-PCL。
实施例2
本申请实施例提供一种温敏性水凝胶材料的改性方法、改性温敏性水凝胶材料，其包括以下步骤：
取3g末端均为羟基的聚乙二醇(Mn＝6000Da，0.5mmol)、2.28g(2.2mL、20mmol)ε-己内酯加入到25mL圆底烧瓶中，随后滴加3‰的Sn(Oct)2并在60℃下熔化，通过Ar气抽充三次除氧后，在140℃下反应8h，反应结束后在-20℃下淬冷终止，并用5mL的CH2Cl2超声溶解，将溶解的CH2Cl2溶液逐滴滴加到200mL的冰乙醚中进行沉降，白色产物逐渐析出。将混合物用砂芯漏斗抽滤并用无水乙醚洗涤3次，所得产物进行真空干燥，得到白色固体粉末PC2，共聚物为PCL-PEG-PCL。
实施例3
本申请实施例提供一种温敏性水凝胶材料的改性方法、改性温敏性水凝胶材料，其包括以下步骤：
取4g末端均为羟基的聚乙二醇(Mn＝8000Da，0.5mmol)、2.28g(2.2mL、20mmol)ε-己内酯加入到25mL圆底烧瓶中，随后滴加3‰的Sn(Oct)2并在60℃下熔化，通过Ar气抽充三次除氧后，在140℃下反应8h，反应结束后在-20℃下淬冷终止，并用5mL的CH2Cl2超声溶解，将溶解的CH2Cl2溶液逐滴滴加到200mL的冰乙醚中进行沉降，白色产物逐渐析出。将混合物用砂芯漏斗抽滤并用无水乙醚洗涤3次，所得产物进行真空干燥，得到白色固体粉末PC3，共聚物为PCL-PEG-PCL。
实施例4
本申请实施例提供一种温敏性水凝胶材料的改性方法、改性温敏性水凝胶材料，其包括以下步骤：
取5g末端均为羟基的聚乙二醇(Mn＝10000Da，0.5mmol)、2.28g(2.2mL、20mmol)ε-己内酯加入到25mL圆底烧瓶中，随后滴加3‰的Sn(Oct)2并在60℃下熔化，通过Ar气抽充三次除氧后，在140℃下反应8h，反应结束后在-20℃下淬冷终止，并用5mL的CH2Cl2超声溶解，将溶解的CH2Cl2溶液逐滴滴加到200mL的冰乙醚中进行沉降，白色产物逐渐析出。将混合物用砂芯漏斗抽滤并用无水乙醚洗涤3次，所得产物进行真空干燥，得到白色固体粉末PC4，共聚物为PCL-PEG-PCL。
对比例1
本申请对比例提供一种温敏性水凝胶材料的改性方法、改性温敏性水凝胶材料，其包括以下步骤：
取2g末端均为羟基的聚乙二醇(Mn＝4000Da，0.5mmol)、2.52g(17.5mmol)丙交酯加入到25mL圆底烧瓶中，随后滴加3‰的Sn(Oct)2并在60℃下熔化，通过Ar气抽充三次除氧后，在140℃下反应8h，其反应式如下：
反应结束后在-20℃下淬冷终止，并用5mL的CH2Cl2超声溶解，将溶解的CH2Cl2溶液逐滴滴加到200mL的冰乙醚中进行沉降，白色产物逐渐析出。将混合物用砂芯漏斗抽滤并用无水乙醚洗涤3次，所得产物进行真空干燥，得到白色固体粉末PA1，共聚物为PLLA-PEG-PLLA。
对比例2
本申请对比例提供一种温敏性水凝胶材料的改性方法、改性温敏性水凝胶材料，其包括以下步骤：
取3g末端均为羟基的聚乙二醇(Mn＝6000Da，0.5mmol)、2.52g(17.5mmol)丙交酯加入到25mL圆底烧瓶中，随后滴加3‰的Sn(Oct)2并在60℃下熔化，通过Ar气抽充三次除氧后，在140℃下反应8h，反应结束后在-20℃下淬冷终止，并用5mL的CH2Cl2超声溶解，将溶解的CH2Cl2溶液逐滴滴加到200mL的冰乙醚中进行沉降，白色产物逐渐析出。将混合物用砂芯漏斗抽滤并用无水乙醚洗涤3次，所得产物进行真空干燥，得到白色固体粉末PA2，共聚物为PLLA-PEG-PLLA。
对比例3
本申请对比例提供一种温敏性水凝胶材料的改性方法、改性温敏性水凝胶材料，其包括以下步骤：
取4g末端均为羟基的聚乙二醇(Mn＝8000Da，0.5mmol)、2.52g(17.5mmol)丙交酯加入到25mL圆底烧瓶中，随后滴加3‰的Sn(Oct)2并在60℃下熔化，通过Ar气抽充三次除氧后，在140℃下反应8h，反应结束后在-20℃下淬冷终止，并用5mL的CH2Cl2超声溶解，将溶解的CH2Cl2溶液逐滴滴加到200mL的冰乙醚中进行沉降，白色产物逐渐析出。将混合物用砂芯漏斗抽滤并用无水乙醚洗涤3次，所得产物进行真空干燥，得到白色固体粉末PA3，共聚物为PLLA-PEG-PLLA。
对比例4
本申请对比例提供一种温敏性水凝胶材料的改性方法、改性温敏性水凝胶材料，其包括以下步骤：
取5g末端均为羟基的聚乙二醇(Mn＝10000Da，0.5mmol)、2.52g(17.5mmol)丙交酯加入到25mL圆底烧瓶中，随后滴加3‰的Sn(Oct)2并在60℃下熔化，通过Ar气抽充三次除氧后，在140℃下反应8h，反应结束后在-20℃下淬冷终止，并用5mL的CH2Cl2超声溶解，将溶解的CH2Cl2溶液逐滴滴加到200mL的冰乙醚中进行沉降，白色产物逐渐析出。将混合物用砂芯漏斗抽滤并用无水乙醚洗涤3次，所得产物进行真空干燥，得到白色固体粉末PA4，共聚物为PLLA-PEG-PLLA。
对比例5
本申请对比例提供一种温敏性水凝胶材料的改性方法、改性温敏性水凝胶材料，其包括以下步骤：
取3g末端均为羟基的聚乙二醇(Mn＝6000Da，0.5mmol)、1.44g(10mmol)丙交酯和1.14g(1.1mL、10mmol)ε-己内酯加入到25mL圆底烧瓶中，随后滴加3‰的Sn(Oct)2并在60℃下熔化，通过Ar气抽充三次除氧后，在140℃下反应8h，其反应式如下：
反应结束后在-20℃下淬冷终止，并用5mL的CH2Cl2超声溶解，将溶解的CH2Cl2溶液逐滴滴加到200mL的冰乙醚中进行沉降，白色产物逐渐析出。将混合物用砂芯漏斗抽滤并用无水乙醚洗涤3次，所得产物进行真空干燥，得到白色固体粉末PCA1，共聚物为PCLA-PEG-PCLA。
对比例6
本申请对比例提供一种温敏性水凝胶材料的改性方法、改性温敏性水凝胶材料，其包括以下步骤：
取4g末端均为羟基的聚乙二醇(Mn＝8000Da，0.5mmol)、1.44g(10mmol)丙交酯和1.14g(1.1mL、10mmol)ε-己内酯加入到25mL圆底烧瓶中，随后滴加3‰的Sn(Oct)2并在60℃下熔化，通过Ar气抽充三次除氧后，在140℃下反应8h，反应结束后在-20℃下淬冷终止，并用5mL的CH2Cl2超声溶解，将溶解的CH2Cl2溶液逐滴滴加到200mL的冰乙醚中进行沉降，白色产物逐渐析出。将混合物用砂芯漏斗抽滤并用无水乙醚洗涤3次，所得产物进行真空干燥，得到白色固体粉末PCA2，共聚物为PCLA-PEG-PCLA。
试验例1共聚物的结构表征
共聚物的分子量，亲疏水链段间的占比会影响交联网络的构建，进而影响到凝胶强度。选用分子量从4000到10000Da的PEG，通过调节酯单体与PEG投料比控制两端的聚酯嵌段在2000Da，获得一系列PCL-PEG-PCL(实施例1～4的PC1～PC4)，PLLA-PEG-PLLA(对比例1～4的PA1～PA4)和PCLA-PEG-PCLA(对比例5～6的PCA1～PCA2)三嵌段共聚物。
各取实施例1～4和对比例1～6制得的聚合物进行核磁共振氢谱(1H NMR)检测：
将10mg聚合物样品溶解在0.5mL的CDCl3中，以四甲基硅烷(TMS)作为内标，通过Bruker DMX-400超导核磁共振仪对聚合物的结构进行表征，如图1所示，各共聚物的氢谱峰归属如下：
PCL-PEG-PCL,δ4.06(t,2H,-(C＝O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-),δ3.65(m,4H,-O-CH2-CH2-O-),δ2.31(t,2H,-(C＝O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-),δ1.65(m,4H,-(C＝O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-),δ1.39(m,2H,-(C＝O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-)；
PLLA-PEG-PLLA,δ5.18(m,1H,-(C＝O)-CH(-CH3)-O-),δ3.66(m,4H,-O-CH2-CH2-O-),δ1.55(m,3H,-(C＝O)-CH(-CH3)-O-)；
PCLA-PEG-PCLA,δ5.12(m,1H,-(C＝O)-CH(-CH3)-O-),δ3.65(m,4H,-O-CH2-CH2-O-),δ2.35(t,2H,-(C＝O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-),δ1.66(m,4H,-(C＝O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-),δ1.54(m,3H,-(C＝O)-CH(-CH3)-O-),δ1.40(m,2H,-(C＝O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-)。
通过计算，各共聚物两端疏水链段的分子量控制在2 000Da左右，即在相同聚酯链段长度下，随PEG分子量增大，共聚物的聚酯链段占比变小的趋势，便于后续对比。与此同时，PCA系列的两个样品的CL/LA摩尔比分别为0.95和0.9，接近于1:1的等分布，从而确保疏水段的无定型状态。
各取实施例1～4和对比例1～6制得的聚合物进行凝胶渗透色谱(GPC)分析：
配置样品浓度为0.3％的聚合物THF溶液，并用0.22μm的有机系针头过滤器进行过滤，在Waters公司的P100-310凝胶渗透色谱仪进行表征，其中，流动相为THF，淋洗液温度为40℃，淋出速度为1.0mL/min。
如图2～4所示，各样品的分子量分布均处于较低的水平，表明所得到的共聚物具有较窄的分子量分布。
试验例2共聚物的热力学及结晶性表征
各取实施例1～4和对比例1～6制得的聚合物进行差示扫描量热(DSC)检测：
称量5mg聚合物样品用固体坩埚封好，在TA的热分析系统Q20上进行测试。为了考察聚合物的非等温结晶过程，首先从室温加热到100℃以消除热历史，然后下降到-20℃，最后再加热至100℃，升降温速率为10℃/min。
各取实施例1～4和对比例1～6制得的聚合物样品进行XRD测试。
如图5～10所示，PCL-PEG-PCL、PLLA-PEG-PLLA和PCLA-PEG-PCLA三者的结晶情况差异明显。
其中，PCL-PEG-PCL样品在DSC中均出现明显的双峰。在第一次降温过程中，PEG的结晶温度随着其自身分子量的增大而向高温移动，PCL的结晶温度则下降显著，到PC4样品时，几乎观察不到PCL的结晶峰，同样在第二次升温曲线中，PCL的熔融峰随着PEG分子量的增大而明显减弱。在XRD谱图中也出现类似的结果，PEG和PCL嵌段均产生衍射峰，分别为PEG(2θ:19.26°和23.44°)和PCL(2θ:21.48°和22.19°)，且随着PEG的分子量增大，PEG的衍射峰变强而PCL的衍射峰明显减弱，说明在共聚物中，PCL和PEG嵌段均能在室温下产生结晶区域，且PCL嵌段的结晶能力受制于PEG的分子量大小，随着PEG分子量的增大，PCL的结晶能力下降。
而对于PLLA-PEG-PLLA共聚物，在DSC中无论是升降温曲线，均只能观察到PEG单峰的结果，其结晶温度和熔融温度随着PEG分子量的增大而增大，而在XRD中则能观察到两种衍射峰，分别为PEG(2θ:19.12°和23.32°)以及PLLA(2θ:16.85°)，且随着PEG分子量的增大而减弱，到PA4时，已观察不到明显的PLLA的衍射峰。说明PLLA-PEG-PLLA共聚物中聚乳酸嵌段的结晶能力较PCL显著下降，在DSC中无法观测到PLLA的熔融或结晶，仅在XRD中观察到衍射峰的变化。
而对于疏水段无规共聚的PCLA-PEG-PCLA而言，无论是DSC和XRD均只有PEG链段的结晶或熔融的谱峰出现，疏水段则无法观察到明显可以结晶的证据，说明无规共聚的PCLA嵌段在本体状态下是无定型，无法形成有效的结晶区域。
试验例3水凝胶的结晶能力测试
聚酯的结晶能力差异直接影响共聚物本体状态下的结晶性，此种差异同样会影响共聚物在水凝胶状态下的交联网络的结晶能力。
各取实施例1～4和对比例1～6制得的聚合物制备成水凝胶：
将称量好的聚合物溶于计量好的去离子水中，在65℃下搅拌溶解，随后将配置的水凝胶放置4℃下过夜备用。
各取实施例1～4和对比例1～6制得的水凝胶进行DSC表征：
取5mg 50w/v％的三嵌段聚合物水凝胶密封在液体坩埚中。先加热至70℃消除热历史，再降温至-70℃，最后升温至70℃，升降温速率为10℃/min。
如图11所示，PA和PCA系列的样品均是平稳的直线，没有明显的熔融峰，而PC系列的水凝胶则在40℃附近有明显的不同程度地熔融峰，说明只有PC的水凝胶在升温过程中发生结晶融化的过程，而其余样品的交联网络均是无定型形态，升温过程中不表现出结晶熔化的过程。PEG为亲水性的高分子，在室温下其高分子链段趋于无规舒展的构象，不会表现出结晶的趋势。并且通过DSC考察了相同浓度下PEG水溶液的热力学性质，其升温曲线也是预料之中的平稳直线。即证明PC系列的水凝胶的结晶片段来源于PCL链段，共聚物在水中自组装成以PCL为内核的胶束，在此过程中内核部分地形成了结晶片段。
将四个PC样品的熔融峰进行计算来比较不同嵌段组成比对PCL疏水内核结晶能力的影响，即彼此结晶度(χc)的差异，依据以下公式：
χc＝ΔHm/ΔHm 0/w*100％ (1)
其中χc为PCL的结晶度，ΔHm为目标样品的熔融焓，ΔHm 0为PCL在100％结晶度下的熔融焓为135J/g，w为PCL占整个水凝胶的质量分数。
计算结果如表1所示，亲疏水嵌段间的比例会影响水凝胶交联网络的结晶性能。
在PCL链段的长度相对固定的情况下，随着PEG分子量的增大，结晶度出现了先增大后减小的趋势，其中PC3达到了最高结晶度，为64.29％。这与共聚物本体的热力学规律不同，由于PEG链段在水相条件下不具有结晶性，稳定的PCL疏水核心是结晶的前提，而过长或过短的PEG链均不利于PCL疏水核心的形成。因此在合适的PEG分子量范围内，共聚物中PCL链段能在水凝胶形成最佳的结晶状态。
表1 PCL-PEG-PCL水凝胶结晶性能表征
其中，a由DSC测定并计算得到，b水凝胶中PCL的结晶度由公式(1)计算得到。
各取实施例1～4和对比例1～6制得的水凝胶进行偏光显微镜(POM)测试：
如图12～16所示，在室温条件下，相同浓度(50w/v％)的PA和PCA系列的水凝胶均无法观察到结晶光斑的存在，验证了这两种水凝胶的无定型交联网络结构。
而对于PCL-PEG-PCL水凝胶而言，四个样品在POM也观察到了彼此间的差异，其中PC1和PC4虽在DSC中能够观察到熔融峰，但在偏光显微镜中很难观察到结晶光斑，仅PC2和PC3样品能明显看到，且PC3的效果最好，与表1中最高结晶度的结果相一致。
然后将平台加热至65℃，即高于熔融温度(Tm)时，在显微镜中无法观察到明显的结晶光斑，说明结晶片段熔融，而当温度重新下降到室温条件并静置一段时间后，结晶光斑又在此出现，以上结果很好地表明PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物所形成的水凝胶较其余共聚物具有更好的结晶性能，且共聚物中亲疏水嵌段比影响水凝胶中交联网络的结晶度。
不仅如此，水凝胶在温度超过Tm时，交联网络的结晶区发生熔融，温度回到室温时，结晶区重现，显示良好的可逆性。
试验例4水凝胶的相转变行为和流变学表征
本申请的水凝胶具有温度敏感的特性，会根据外界温度的变化而产生相转变行为，而交联网络的结晶及结晶度是否同样会影响到此类水凝胶的温敏性质。
各取实施例1～4和对比例1～6制得的水凝胶进行凝胶-溶胶转变测试：
采用凝胶倒置方法测试水凝胶的凝胶-溶胶转变情况，在菌种瓶中配置5mL左右的10～40w/v％的不同浓度的三嵌段聚合物水凝胶，放置在恒温水浴或金属浴中，升温以1℃一次为间隔，每个温度点静置5min左右后取出菌种瓶进行倒置观察，直到水凝胶液面发生流动，将当前温度记录为溶胶转变点。
如图17～19所示，三种水凝胶均呈现出凝胶-溶胶(gel-sol)转变的特性，即水凝胶存在有低临界成胶温度(Lower critical gelation temperature,LCGT)，在高于此温度时，低浓度的水凝胶会转变为可流动的溶胶，高浓度水凝胶会出现失水沉淀的情况。
不仅如此，如图17所示，结晶与无定型的交联网络在这一过程中具有显著差异。对于PLLA-PEG-PLLA水凝胶而言，根据之前的检测结果可认为是非晶的交联网络，PA系列的水凝胶具有较高的临界成胶浓度(Critical gelation concentration,CGC)，尤其是PA1的CGC达到将近30w/v％，说明无定型的交联网络不稳定，需要较高的共聚物浓度才能满足水凝胶的形成。同时CGC和LCGT随着PEG的分子量上增大而提高，说明在相同PLLA链长的前提下，较高分子量的PEG有助于交联网络的产生和稳定。在流变学中的模量-温度扫描中也表现出类似的结果，在40w/v％浓度下，水凝胶的复数模量(G*)随着温度的上升而下降，且PEG的分子量增大有助于G*的提高。
而对于PCL-PEG-PCL水凝胶而言，在凝胶倒置实验中能够清晰地看到，具有结晶性的交联网络，显著提高了水凝胶的LCGT以及降低了CGC，说明相较于PLLA-PEG-PLLA水凝胶而言，在相对更低浓度和更高温度的范围内，PCL-PEG-PCL更易处于水凝胶形态，这意味着交联网络中的结晶片段有助于稳定水凝胶。不仅如此，结晶片段的多少，即结晶度(χc)会进一步影响水凝胶转变行为，从图中能够看到具有最高结晶度的PC3的转变曲线处在最高位，说明PC3所能形成稳定水凝胶的温度和浓度范围最广，而结晶度第二高的PC2次之，PC4随后，PC1最低，与试验例3中计算的χc的大小相吻合。
而PCLA-PEG-PCLA所形成的水凝胶，其疏水段加入LLA单体进行无规共聚从而破坏了PCL链段的结晶区域，形成非晶的交联网络，其水凝胶所能形成的温度浓度范围也随之缩小。同样的，如图18所示，在温度扫描曲线中也观察到了类似的结果，结晶度最高的PC3水凝胶具有最高的复数模量G*，而无定型的PCA系列水凝胶则因交联网络无法形成有效的结晶区域而在流变学中表现为模量的显著下降。
通过凝胶倒置实验和流变学的温度扫描能够看到相较于无定型的交联网络，具有结晶区域的交联网络有助于在更大浓度/温度范围内形成水凝胶。与此同时，结晶区域的存在也在凝胶模量上表现出巨大的差异，在室温条件下，在更高浓度(40w/v％)下的PA系列水凝胶，其G*<5kPa。而对于PC系列的水凝胶，在仅有20w/v％浓度的情况下，其G*仍然高于PA系列的水凝胶。说明结晶区域的存在不仅能够形成更为稳定的水凝胶，而且有助于提高水凝胶的机械强度。
试验例5水凝胶的流变学测试
选用相同浓度下(20w/v％)结晶度最高的PC3和无定型的PCA1作为对象，对两者分别进行不同温度下的应变扫描(γ：0.01～1000％)。
如图20～21所示，在室温条件下，两者在线性粘弹区的储能模量(G’)均高于损耗模量(G”)，为典型的弹性体的结果。且PC3的模量远高于PCA1的模量，说明在室温下PC3具有更高的水凝胶强度。当应变幅度继续增大到一定程度，水凝胶的模量陡然下降，且出现G’<G”的情况，即在大应变下，水凝胶转变为类流体状态。不同之处在于，PC3在大幅度振荡应变(Large amplitude oscillatory strain,LAOS)下产生了一个弱应变过冲(Weak strainovershoot,WSO)现象，即G”在应变达到一定程度时会有一个陡然上升在急剧下降的情况，但在PCA1中没有观察到类似现象。而这一现象的产生源于水凝胶在应变幅度增大的过程，其交联网络体系破坏重组导致能量耗散陡然上升。
即PCL的结晶部分是出现这一差异的关键，结晶区的存在使交联网络在LAOS下破坏重组所需的能量耗散明显，而无定型的交联网络则不需要如此大的能量耗散。
为了证明这一论点，需要考察两种水凝胶在不同温度下的应变扫描情况。对于PC3水凝胶而言，先对其在45℃，即熔点附近处进行应变扫描，水凝胶的模量有所下降，但更为关键的是在LAOS处的WSO现象较之于在室温条件下的情况明显减弱，说明结晶区的熔化过程使交联网络在大幅度应变下其结构破坏重组所需的能量耗散有所下降。当温度达到65℃，即高于熔点时，根据之前的结果可知，结晶区已然熔化彻底，而在应变扫描的结果也与预想的一样，WSO几乎观察不到了。而对于PCA1而言，当将温度上升至65℃时，仅观察到了水凝胶模量较之于室温条件下的显著下降。
以上结果表明，PCL结晶区的存在有助于稳定交联网络结构从而提高水凝胶的力学强度。
结合应变扫描的结果进一步考察两者的模量随频率变化的情况，如图22所示，在0.1到100rad/s范围内，两种水凝胶均为G’>G”，典型的弹性体效应，且随着频率的提高，模量整体呈上升趋势。然而PC3较之于PCA1，具有更高的G’和更低的G”，表明PC3的弹性体效应更为明显，且PC3的模量随频率变化更具稳定性，PCA1则更易受频率的影响。尤其是在低频范围中(0.1～1rad/s)，PCA1的G’和G”差距急剧缩小，而PC3没有明显变化，这一点表明在低频的剪切速率下，即在长时间的松弛过程中，PC3较之于PCA1，其在水凝胶的交联网络尺度上，具有更长的松弛时间，而较长的松弛时间有助于水凝胶在3D打印成型后的形状维持，这有赖于PC3交联网络中PCL结晶区域的存在，起到了稳定交联网络结构的作用，在剪切过程中提供了更多的有效交联点。
通过频率和应变扫描充分证实了结晶片段能够有效提高交联网络的稳定性及水凝胶的力学强度，而两种水凝胶的可打印性也同样需要流变学上的测试。对于微挤出这类3D打印技术手段，剪切变稀性质是评价一种材料是否适合挤出的关键指标，为此需要考察在0.01～100rad/s范围两种材料的粘度变化情况。
各取实施例1～4和对比例5～6制得的水凝胶进行流变学性质(Rheology)测试：
流变学测试采用TA的DHR2-2183旋转流变仪。配制20％(w/v％)浓度的水凝胶，采用25mm平板法向传感器，应变值保持在水凝胶的线性黏弹性区间。
a)倾斜升温实验：频率1Hz，升温范围25～80℃，升温速率1℃/min；
b)应变扫描实验：频率为1Hz，应变范围为0.01～1000％，分别在25，45和65℃下进行测试；
c)频率扫描实验：频率范围为0.1～100rad/s；
d)动态粘度实验：设置温度为37℃，剪切速率范围为0.01～100rad/s；
e)触变性实验：应变幅度分别选取0.01％和100％，每个应变下分别作用100s，重复6次。
如图23所示，在37℃下，两种材料均呈现出典型的非牛顿流体性质，且随着剪切速率增大，粘度呈线性下降趋势，很好地证明了两者的剪切变稀的性质。
进一步地，材料的触变性同样得到了检测，这一指标能够用于考察材料在大应变剪切后强度可否得到恢复，此性能的优劣对于3D打印后的材料能否快速定型至关重要。
如图24所示，在小幅度应变(γ＝0.01％)下，两者依旧显示出弹性体性质(G’>G”)。当应变转为大幅度应变(γ＝100％)时，PC3的G’由低幅应变下的4.4kPa陡然降至0.1kPa，而PCA1的G’则由1kPa下降至0.6kPa，显示出了试验例5提到的在大幅应变下的类流体现象。不同的是，在这6次循环过程中，当应变恢复至小幅应变时，从图中看到PC3能够迅速恢复到凝胶状态，而PCA1则需要10s左右的时间才能恢复到凝胶状态，这一结果不仅说明了PC3具有更高的模量强度，而且在大小幅度应变循环往复的转变过程中，PC3具有更好的触变性。
试验例6水凝胶的3D打印可行性测试
本申请通过流变学方面的测试考察了PC3和PCA1这两种水凝胶的机械性能，并且肯定了结晶区域对增强水凝胶强度的促进作用。根据理论依据及数据支撑，利用捷诺飞公司的型号3D打印机作为平台，将这两种水凝胶分别作为生物墨水来进行3D打印的评估；
如图25中A所示，在20w/v％浓度下，由于良好的剪切变稀性质，两者均能在37℃下顺利挤出成丝。但是，两者的流变学差异体现在了随后的打印成型上。
如图25中B和C所示，PC3水凝胶能够依托微挤出成型构建稳定而无明显瑕疵的形状，这有赖于水凝胶中具有PCL结晶区域的交联网络体系。在高倍光学显微镜下观察到打印的图案具有较高的分辨率和精确度，每根丝清晰可见且线宽均一，没有明显的挤出胀大效应。
如图25中D所示，PCA1的水凝胶在打印完仅20分钟内，形状图案就已经无法辨认，打印的结构也很快坍塌融合成一整块水凝胶，两者间打印效果的差异之显著，也印证了之前流变学的数据结果。
随后将打印好的PC3的水凝胶图案冻干后在扫描电镜(SEM)下观察，如图25中E所示，能够看到清晰的图案的骨架结构，如图25中F所示，在高倍镜下还能够清楚地看到多孔的交联网络形貌。
从上述结果得到，结晶片段的引入显著增强了水凝胶的力学强度，有效提高了3D打印的效果，也与流变学评价的结果相互印证。
试验例7水凝胶的细胞相容性测试
水凝胶的细胞相容性也是同样重要的，选用成纤维细胞作为对象，测试其与不同浓度的PC3共培养72小时下的细胞毒性评估。
首先通过死活染色手段来进行分析，结果如图26所示。通过对三天的两组显微镜图像分别进行比对，能够很清楚地看到加入5mg/mL浓度的PC3共聚物与空白对照组的结果没有显著差异，成纤维细胞的生长趋势相同，表明共聚物的加入没有显著影响细胞存活率。
进一步通过Cell Counting Kit-8(CCK-8)技术定量评估了材料的细胞毒性，结果如图27所示。以每天空白对照组的结果作为100％，能够很清楚地看到5mg/mL浓度的共聚物在24小时共培养后，其细胞存活率超过80％，随着共聚物浓度下降，存活率进一步提高。在随后的两天，共聚物的加入没有显著影响细胞的正常生长。这些结果表明，此类水凝胶具有良好的细胞相容性，在组织工程领域具有潜在的应用价值。
综上所述，本申请提供了一种温敏性水凝胶材料的改性方法、改性温敏性水凝胶材料和生物3D打印墨水，发现结晶区域的存在能够显著提高交联网络的稳定性及水凝胶的力学强度，并且水凝胶依旧保持具备剪切变稀和快速固化的性质。并且本申请通过开环聚合制备了PCL-PEG-PCL的ABA型三嵌段共聚物，PCL-PEG-PCL所形成的水凝胶因PCL嵌段具有较强的结晶性能，使得水凝胶的交联网络存在结晶区域。并且通过对比发现，相较于无定型的交联网络，结晶区域的存在显著提高了交联网络的稳定性及水凝胶的力学强度。同时通过3D打印证实了结晶性的水凝胶具有较高的力学强度足以构建并维持稳定的3D打印图案。充分验证了通过引入结晶性质在保留水凝胶原有的优异性能下，来提高其力学强度从而有效应用于3D打印等快速成型技术的改性方法。
以上所述仅为本申请的具体实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种温敏性水凝胶材料的改性方法，其特征在于，所述温敏性水凝胶材料的改性方法包括使温敏性水凝胶材料的交联网络部分结晶化；
使所述温敏性水凝胶材料的交联网络部分结晶化的方法包括：将亲水性聚合物聚乙二醇与具有结晶性的可生物降解的聚酯的单体形成嵌段共聚物，所述共聚物在水凝胶状态下具有结晶性的交联网络结构；
所述嵌段共聚物包括聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯；
所述嵌段共聚物通过以下方法获得：将聚乙二醇与ε-己内酯混合在催化剂存在下于130~150℃反应6~10 h；
所述聚乙二醇的分子量为4000~10000 Da；
所述聚乙二醇与所述ε-己内酯的摩尔比为1：（35~50）；
所述聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯中聚己内酯与聚乙二醇的分子量的比为0.55~0.75；
改性温敏性水凝胶材料在水凝胶状态下的结晶度≥15%。
2.根据权利要求1所述的温敏性水凝胶材料的改性方法，其特征在于，所述催化剂包括异辛酸亚锡。
3.一种改性温敏性水凝胶材料，其特征在于，所述改性温敏性水凝胶材料根据权利要求1或2所述的温敏性水凝胶材料的改性方法改性得到。
4.根据权利要求3所述的改性温敏性水凝胶材料，其特征在于，所述聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯中聚己内酯与聚乙二醇的分子量的比为0.55。
5.一种生物3D打印墨水，其特征在于，所述生物3D打印墨水包括权利要求3或4所述的改性温敏性水凝胶材料。
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