CN111471600A - 用于制备绿僵菌孢子粉的培养基及绿僵菌高孢粉的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一组用于制备绿僵菌孢子粉的培养基及绿僵菌高孢粉的制备方法，该培养基包括培养绿僵菌的液体种子培养基和固体培养基，液体种子培养基按重量百分比由如下组分组成：山药粉末6％、蟑螂粉末4％、葡萄糖3％、K₂HPO₄ 0.1％、MgSO₄ 0.05％，余量为水，pH值6；固体培养基按照重量百分比由如下组分组成：山药草质藤本粉末10‑12％、蟑螂粉末30‑40％、山药粉末20‑30％、葡萄糖2‑3％，余量为水，pH值6。该制备方法为：复壮绿僵菌；液体种子培养培养得绿僵菌母液；固体培养基二次培养，收集孢子。本发明提供的制备方法，不使用粮食、产孢率高、发酵过程不易污染、分生孢子与基质易分离。

Description

用于制备绿僵菌孢子粉的培养基及绿僵菌高孢粉的制备方法

技术领域

本发明属于生物发酵领域，涉及一种用于真菌发酵生产孢子粉的培养基及培养方法，具体涉及一组用于制备绿僵菌孢子粉的培养基及绿僵菌高孢粉的制备方法。

背景技术

绿僵菌(Metarhizium spp.)是一类重要的昆虫病原真菌，以其为主要生物活性成分的制剂具有无残留、易生产、持效期长、致病力强、应用效果好、对非靶标生物安全等优点，对多种农林害虫具有寄生致死作用。作为一类生防微生物，绿僵菌越来越受到人们关注。自20世纪60年代以来，已有50多种制剂产品被研制并获得注册登记。

高产孢子绿僵菌的培养是生产的基础。固态培养常因污染率高、产孢量低和活孢率低等缺点影响产品质量。此外，大型固体发酵设备因价格昂贵、占地面积大、能耗大、生产成本高等而使用率不高。

关于绿僵菌发酵液体和固体培养基涉及到的文献主要有：粘米、葡萄糖、K₂HPO₄、MgSO₄、蛋白胨和大米(CN 107446829 A)；麦麸汁(玉米面)、米粉、葡萄糖(CN 106244466A)，许天委，张世清，黄俊生.金龟子绿僵菌的液固双相发酵研究，河南农业科学，DOI：10.3969/j.issn.1004-3268.2013.02.022(其培养基中含玉米面和米粉)；甘蔗渣、玉米粉、硫酸铜、硫酸镁、磷酸二氢钾(CN100381557C)；麦麸、谷壳、米粉、玉米粉(CN 104911111B)；黄芪、丹参、女贞子、刺五加、甘草、青蒿、杜仲、槲寄生、百部、苦参、印楝(CN108200922A)；麦麸、玉米粉、豆粕(CN106367356A)；葡萄糖、蛋白胨、硫酸镁、菜籽油饼、青刺果粉、棉籽粉(CN102168025A)；甘蔗渣(CN101845397A)。

从上述培养基配方中可以看出，多数培养基中含有粮食作物，如玉米，大米等成分，使得培养基的成分会与人争粮，或者使用大量中药或者蛋白胨等成本较高的原料，造成培养基的成本居高不下。

发明内容

为解决上述问题，本发明旨在提供一种用于制备绿僵菌高孢粉的培养基，该培养基适合绿僵菌的生长。

本发明还提供一种绿僵菌高孢粉的制备方法，该方法可用于大量制备绿僵菌孢子粉。

为了实现上述目的，本发明提供一种制备绿僵菌高孢粉的培养基，由液体种子培养基和固体培养基组成；其中，液体种子培养基按重量百分比由如下组分组成：山药粉末6％、蟑螂粉末4％、葡萄糖3％、K₂HPO₄ 0.1％、MgSO₄ 0.05％，余量为水，pH值6；固体培养基按照重量百分比由如下组分组成：山药草质藤本粉末10-12％、蟑螂粉末30-40％、山药粉末20-30％、葡萄糖2-3％，余量为水，pH值6。

优选地，所述的液体种子培养基和固体培养基中，蟑螂粉末过20目筛，山药粉末过20目筛，山药草质藤本粉末过20目筛。

本发明还提供一种绿僵菌高孢粉的制备方法，包括以下步骤：

1)将PDA培养基121℃下灭菌20-30min，冷却至室温，然后接种绿僵菌27℃培养5天，得到复壮的绿僵菌菌落；

2)将权利要求1或2所述的液体种子培养基121℃下灭菌20-30min，冷却至室温，接种复壮的绿僵菌菌落边缘直径8mm的菌块，24-29℃摇床220rpm培养1-2周，黑暗培养，得到绿僵菌发酵种子液，调整绿僵菌发酵种子液的孢子浓度至10⁶孢子/mL，4℃保存，得到绿僵菌母液；

3)将绿僵菌母液按体积比1：4-7的比例接种于如灭菌后的如权利要求1或2所述的固体培养基，装入培养袋，24-29℃，湿度70％-90％，黑暗培养，培养3-7天至菌丝生长密实；将固体培养基打散，24-29℃再培养5-14天，使绿僵菌均匀生长，打开培养袋使之干燥，收集孢子。

优选地，步骤2)所述固体培养基的灭菌方法为：将固体培养基各成分混匀，在121℃温度灭菌30min，冷却备用。

优选地，步骤2)所述培养袋为4层无纺布制成，用3％双氧水溶液浸泡30-60min，取出备用。

优选地，所述绿僵菌为金龟子绿僵菌。

本发明提供的绿僵菌孢子可用于防治作物虫害和病害。

美洲大蠊(Periplaneta Americana)为昆虫纲有翅亚纲蜚蠊，俗称“蟑螂”，生命力极强，繁殖快，虫体含丰富的蛋白质、氨基酸、神经肽50余种、油酸、亚油酸、亚麻酸、卵磷脂、蟑螂油、糖胺聚糖、多巴胺、蛋白酶、酯酶、淀粉酶、消化酶、性信息素、聚集信息素、维生素(B₁、B₂、C)、细胞色素(a、b、c)、辅酶A、甲壳素、巩膜素、几丁质及钙、镁、铁、锌等，可为绿僵菌提供丰富营养。

山药始载于《神农本草经》，滋阴、补脾。山药含大分子及小分子两类化学成分，大分子成分以淀粉、多糖为主，小分子成分以尿囊素等为主。

本发明提供的培养基中包含山药粉和蟑螂粉的组合，其中，液体种子培养基使用山药粉、蟑螂粉末、葡萄糖、K₂HPO₄和MgSO₄，固体培养基使用山药草质藤本粉末、蟑螂粉末、山药、葡萄糖，使用组合培养基生产绿僵菌，孢子可达2.2×10¹⁰孢子/g培养基，明显高于普通培养5.7×10⁷到2.4×10⁸孢子/g培养基。

本发明的优点在于：

本发明提供一组用于制备绿僵菌高孢粉的培养基，以及使用该组培养基培养绿僵菌高孢粉的方法。该方法利用绿僵菌对昆虫的趋向性，采用虫体大、生长迅速、蛋白含量高的蟑螂作为培养基主要成分，并筛选到适于绿僵菌生长的山药粉做碳源，同时使用山药草质藤本做碳源，增加培养基的透气性，固体发酵。用该方法制备的绿僵菌孢子含量高，降低粮食用量，生产成本低。

附图说明

图1为使用本发明液体培养基配方采用不同pH对于绿僵菌生长影响统计图。

图2为使用本发明固体培养基配方成分在不同含量时对于绿僵菌生长影响照片图。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明做进一步说明：

1.金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)可湿性粉剂购自重庆聚立信生物工程有限公司，产品名称：金龟子绿僵菌CQMa421。

2.蟑螂购自宜宾市绿贡治生物科技有限公司，使用前研磨成粉末，过20目筛。

3.99％多巴胺购自郑州海壹化工产品有限公司。

4.PDA固体培养基：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL，自然pH值；121℃灭菌20min，取出，冷却后贮存备用。

绿僵菌复壮：将金龟子绿僵菌CQMa421可湿性粉剂采用常规操作接种到PDA培养基中27℃培养5天得到复壮的绿僵菌菌落。

实施例1pH对绿僵菌菌丝生长影响

用打孔器取上述复壮后绿僵菌菌落边缘直径5mm菌块，接种到不同pH值(pH值3、4、5、6、7、8、9、10、自然(pH))的PDA培养基中，27±1℃，培养培养5天后，然后测量菌落直径，计算菌丝生长量，结果如图1所示。从图1可以看出，菌丝在pH为5.0到9.0之间的范围内可以正常生长，虽过酸和过碱影响绿僵菌孢子萌发，但是菌丝生长并未受到明显胁迫。在培养基pH＝6时，菌丝生长最佳。因此选择pH6作为培养基的最优pH。

实施例2液体培养条件筛选

以液体马铃薯葡萄糖培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL)添加K₂HPO₄ 1g，MgSO₄ 0.5g为对照组(CK)，配制不同浓度的液体种子培养基，如表1所示，调pH6，灭菌。取1×10⁶孢子/mL的绿僵菌孢子悬浮液150μL分别加到不同编号培养基中，每个编号设3个重复。27±1℃，220rpm摇床培养，96h后用血细胞计数板在显微镜下测定孢子数量，取平均值。

表1液体培养中不同比例蟑螂粉、山药粉对绿僵菌产孢量的影响

从表1看出，蟑螂粉和山药的添加量明显影响绿僵菌的产孢量，添加蟑螂粉的培养基的产孢量比对照组(CK)培养基提高2-3个数量级；蟑螂粉和山药的比例影响产孢量，编号4，即：山药粉6％、蟑螂粉末4％、葡萄糖3％、K₂HPO₄0.1％、MgSO₄ 0.05％，产孢数量最高，可达7.72×10⁹个/mL。因此选择山药粉6％、蟑螂粉末4％、葡萄糖3％、K₂HPO₄ 0.1％、MgSO₄0.05％作为培养绿僵菌的液体种子培养基的最佳组合。

实施例3固体培养基筛选

分别配制不同比例的山药草质藤本粉末、蟑螂粉末、山药、葡萄糖和水的培养基，如表2所示，调pH6，灭菌，每15g铺一个70mm平板。取10000孢子/mL的孢悬液1μL，接种于培养基平板中央，每浓度重复3次，以PDA培养基为对照组(CK)。27℃，湿度80％，培养7d，用内径5mm的打孔器在培养好的固体平板中打孔，分别打孔5处得到5菌饼，且5菌饼的位置在不同平板中基本一致，用0.1％的吐温80分散剂打散，28℃180r/min振荡30min(加入玻璃珠)，用血球计数板计数产孢数，统计结果如表2。

表2固体培养中山药草质藤本粉末、蟑螂粉和山药粉对绿僵菌产孢量的影响

从图2所示的山药草质藤本粉末、蟑螂粉末、山药对绿僵菌生长影响菌落图可以直观看出第1-6组绿僵菌的生长情况，结合表2中产孢量可以看出，以产孢量计，第5组，山药草质藤本粉末：蟑螂粉末：山药最佳；以菌丝生长量，图2中第5组和第6组生长最快。结合菌丝生长和产孢量，山药草质藤本粉末：蟑螂粉末：山药的最佳配比为第5组。

实施例4

1)液体种子发酵液的制备：将山药粉12g，蟑螂粉末8g，葡萄糖6g，K₂HPO₄ 0.2g，MgSO₄ 0.1g，加到200mL水中，调整pH 6，加入500mL的三角瓶，搅拌均匀，覆盖八层纱布；121℃蒸汽灭菌30min；冷却至室温，在超净工作台上接入复壮的绿僵菌菌落边缘直径8mm菌块4个，于27℃，黑暗条件培养5天，得到金龟子绿僵菌发酵种子液，浓度为1.8×10¹⁰个孢子/ml，调整孢子浓度至10⁶孢子/mL得到绿僵菌母液。

2)配制固态发酵培养基：称量山药草质藤本粉末50g、蟑螂粉末200g、山药100g、葡萄糖10g，混匀，加水至总重量500g，放置100min至培养基吸干表面水分，装入培养袋，在121℃温度灭菌30min，冷却备用。

3)固体发酵

绿僵菌母液与固体培养基按体积比1:7接种，在27℃，80％湿度条件下培养3天至菌丝密实，打散固体培养基；在26℃继续培养6天，开袋，干燥，过筛，收集孢子，产孢量为2.1×10¹⁰孢子/g培养基。

实施例5

1)液体种子发酵液的制备：山药粉18g，蟑螂粉末12g，葡萄糖9g，K₂HPO₄ 0.3g，MgSO₄ 0.15g，加入300ml水，调节pH值为6，放入500mL三角瓶中，用玻璃棒搅拌均匀，覆盖八层纱布；121℃蒸汽灭菌30min；冷却至室温，在超净工作台上接入直径8mm菌块4个，于27℃，黑暗条件培养6天，得到金龟子绿僵菌发酵种子液(2.1×10¹⁰个孢子/ml)，调整孢子浓度至10⁶孢子/mL得到绿僵菌母液。

2)配制固态发酵培养基：称量山药草质藤本粉末60g、蟑螂粉末180g、山药120g、葡萄糖12g，混合均匀，加水至总重量500g，放置120min至培养基吸干表面水分，装入培养袋，在121℃温度灭菌30min，冷却备用。

3)固体发酵

绿僵菌母液与固体培养基按1∶6接种，在26℃、85％湿度条件下培养4天至菌丝密实，打散培养基；在27℃、85％湿度条件下继续培养7天，开袋，干燥，过筛，收集孢子，产孢量为2.2×10¹⁰孢子/g培养基。

实施例6

1)液体种子发酵液的制备：以山药粉30g，蟑螂粉末20g，葡萄糖15g，K₂HPO₄ 0.5g，MgSO₄ 0.25g，加500mL水，调节pH值为6.0，放入1000mL的三角瓶中，用玻璃棒搅拌均匀，覆盖8层纱布；121℃蒸汽灭菌30分钟；冷却，在超净工作台上接入直径8mm菌块4块；于26℃，黑暗培养8天，得到金龟子绿僵菌发酵种子液，浓度为1.7×10¹⁰个孢子/ml，调整孢子浓度至10⁶孢子/mL得到绿僵菌母液。

2)配制固态发醇培养基：称取山药草质藤本粉末55g、蟑螂粉末190g、山药130g、葡萄糖10g，混匀，加水至总重量500g放置120min至培养基吸干表面水分，装入培养袋，121℃温度灭菌30min，冷却备用。

3)固体发酵

绿僵菌母液与固体培养基按1∶5接种，在25℃培养7天至菌丝密实，打散培养基；在25℃继续培养7天，开袋，干燥，过筛，收集孢子，产孢量为1.4×10¹⁰孢子/g培养基。

实施例7

1)液体种子发酵液的制备：以山药粉15g，蟑螂粉末10g，葡萄糖7.5g，K₂HPO₄0.25g，MgSO₄ 0.125g，加水至总重量250g，调节pH值为6.0，放入500mL的三角瓶中，用玻璃棒搅拌均匀，覆盖八层纱布；121℃蒸汽灭菌30min；冷却，在超净工作台上接入直径8mm菌块4块；于27℃，黑暗培养9天，得到金龟子绿僵菌发酵种子液(1.8×10¹⁰个孢子/ml)，调整孢子浓度至10⁶孢子/mL得到绿僵菌母液。

3)配制固态发酵培养基：称量山药草质藤本粉末55g、蟑螂粉末170g、山药120g、葡萄糖12g，混合均匀，加水至总重量500g，放置120min至培养基吸干表面水分，装入培养袋，在121℃温度灭菌30min，冷却备用。

4)固体发酵

绿僵菌母液与固体培养基按1:7接种，在27.5℃、78％湿度条件下培养4天至菌丝密实，打散培养基；在26℃、78％湿度条件下继续培养9天，开袋，干燥，过筛，收集孢子，产孢量为1.9×10¹⁰孢子/g培养基。

实施例8以常用培养基大米(粮食)为对照

1)液体种子发酵液的制备：以大米粉35g，葡萄糖7.5g，K₂HPO₄ 0.25g，MgSO₄0.1225g，加水至总重量250g，调节pH值为6，放入250mL三角瓶中，用玻璃棒搅拌均匀，覆盖八层纱布；121℃蒸汽灭菌45min；冷却，在超净工作台上接入直径8mm菌块4块；于28℃，黑暗培养8天，得到金龟子绿僵菌发酵种子液(1.5×10⁹个孢子/ml)，调整孢子浓度至10⁶孢子/mL得到绿僵菌母液。

2)配制固态发酵培养基：称量碎米600g、大米300g、H₂O 50％、KH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲液0.05％、蔗糖0.5％，混合均匀，加入800ml水，放置，至培养基吸干表面水分，装入培养袋，在121℃温度灭菌30min，冷却备用。

4)固体发酵

绿僵菌母液与固体培养基按1∶5接种，在27℃、78％湿度条件下培养10天，打散培养基；在27℃、78％湿度条件下继续培养10天，开袋，干燥，过筛，收集孢子，产孢量为2.0×10⁸孢子/g培养基。

实施例9

在本实施例中培养基中加入蟑螂成分多巴胺和蟑螂油，蟑螂的主要有效成分为多巴胺和蟑螂油，多巴胺是一种神经传导物质，用来帮助细胞传送脉冲，这种分泌物能传递兴奋信息，本实施例主要验证多巴胺和蟑螂油的作用。

蟑螂油：称取蟑螂粉末，用95％乙醇浸泡3天，过滤，除醇得蟑螂油。

1)液体种子发酵液的制备：以山药粉35g，葡萄糖7.5g，多巴胺2μg，蟑螂油0.1g，K₂HPO₄ 0.25g，MgSO₄ 0.125g，加水至总重量250g，调节pH 6，放入250mL的三角瓶中，用玻璃棒搅拌均匀，覆盖八层纱布；121℃蒸汽灭菌45min；冷却后在超净工作台上接入直径8mm菌块4块；于26℃，黑暗培养5天，得到金龟子绿僵菌发酵种子液(1.2×10¹⁰个孢子/mL)，调整孢子浓度至10⁶孢子/mL得到绿僵菌母液。

3)配制固态发醇培养基：称量山药粉450g、葡萄糖10g，多巴胺4μg，蟑螂油0.3g，混合均匀，加入230mL水，放置120min至培养基吸干表面水分，装入培养袋，在121℃温度灭菌30min，冷却备用。

4)固体发酵

绿僵菌母液与固体培养基按1∶5接种，在27℃、82％湿度条件下，培养3天至菌丝长出，打散培养基；继续在24℃、82％湿度条件下，继续培养6天，开袋，干燥，过筛，收集孢子，产孢量为1.6×10¹⁰孢子/g培养基。

从上述实施例可知，本培养基和配方方法比现有技术可以提高产孢量达两到三个数量级，推测是蟑螂中的多巴胺、蟑螂油起主要作用，此配方培养基适合高产绿僵菌孢培养。

由于多巴胺、蟑螂油均含于蟑螂粉末中，而制备多巴胺、蟑螂油需要增加成本，同时提取多巴胺、蟑螂油使用试剂还会造成环境污染，因此，在证明多巴胺、蟑螂油为有效成分的基础上，使用蟑螂粉末更加节约成本。

实施例10

附加试验：试验条件均同实施例1，仅培养基种类有变化，液体培养基补水至总重量250g，固体培养基补水质总重量500g，产孢量见表1。

表1附加试验产孢子数量

为了提高绿僵菌的产孢率，本发明利用绿僵菌对昆虫的偏好性，试验用蟑螂、蚕、蝗虫、蝼蛄、为原料，培养绿僵菌。结果发现，以蟑螂作培养基的主要成分，绿僵菌产孢量大；用茯苓粉、葛根粉、蔗糖、天花粉为碳源，不适合绿僵菌产孢子；以山药草质藤本、山药为最佳碳源，起到增加培养基透气性作用，固体发酵，该方法制备的绿僵菌孢子含量高，可达1.4×10¹⁰-2.2×10¹⁰/g。

从上述实施例可以看出，本发明提供的一组用于制备绿僵菌高孢粉的培养基，以及使用该组培养基培养绿僵菌高孢粉的方法，利用绿僵菌对昆虫的趋向性，采用虫体大、生长迅速、蛋白含量高的蟑螂作为培养基主要成分，并筛选到适于绿僵菌生长的山药粉做碳源，同时使用山药草质藤本做碳源以便增加培养基的透气性，固体发酵。用该方法制备的绿僵菌孢子含量高，且因不使用粮食而降低生产成本。

Claims (6)

1.一组用于制备绿僵菌孢子粉的培养基，其特征在于，由液体种子培养基和固体培养基组成；其中，液体种子培养基按重量百分比由如下组分组成：山药粉末6％、蟑螂粉末4％、葡萄糖3％、K₂HPO₄ 0.1％、MgSO₄ 0.05％，余量为水，pH值6；固体培养基按照重量百分比由如下组分组成：山药草质藤本粉末10-12％、蟑螂粉末30-40％、山药粉末20-30％、葡萄糖2-3％，余量为水，pH值6。

2.如权利要求1所述的用于制备绿僵菌高孢粉的培养基，其特征在于，所述的液体种子培养基和固体培养基中，蟑螂粉末过20目筛，山药粉末过20目筛，山药草质藤本粉末过20目筛。

3.一种绿僵菌高孢粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将PDA培养基121℃下灭菌20-30min，冷却至室温，然后接种绿僵菌27℃培养5天，得到复壮的绿僵菌菌落；

2)将权利要求1或2所述的液体种子培养基121℃下灭菌20-30min，冷却至室温，接种复壮的绿僵菌菌落边缘直径8mm的菌块，24-29℃摇床220rpm培养1-2周，黑暗培养，得到绿僵菌发酵种子液，调整绿僵菌发酵种子液的孢子浓度至10⁶孢子/mL，4℃保存，得到绿僵菌母液；

3)将绿僵菌母液按体积比1：4-7的比例接种于如灭菌后的如权利要求1或2所述的固体培养基，装入培养袋，24-29℃，湿度70％-90％，黑暗培养，培养3-7天至菌丝生长密实；将固体培养基打散，24-29℃再培养5-14天，使绿僵菌均匀生长，打开培养袋使之干燥，收集孢子。

4.如权利要求3所述的绿僵菌高孢粉的制备方法，其特征在于，步骤2)所述固体培养基的灭菌方法为：将固体培养基各成分混匀，在121℃温度灭菌30min，冷却备用。

5.如权利要求3所述的绿僵菌高孢粉的制备方法，其特征在于，步骤2)所述培养袋为4层无纺布制成，用3％双氧水溶液浸泡30-60min，取出备用。

6.如权利要求3所述的绿僵菌高孢粉的制备方法，其特征在于，所述绿僵菌为金龟子绿僵菌。

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