CN111450306A - 外用纳米羟基磷灰石/聚多巴胺湿黏附型止血粉及其制备方法 - Google Patents

外用纳米羟基磷灰石/聚多巴胺湿黏附型止血粉及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种外用纳米羟基磷灰石/聚多巴胺湿黏附型止血粉及其制备方法，所述止血粉为负载聚多巴胺的纳米羟基磷灰石。制备方法为在弱碱性溶液中，加入纳米羟基磷灰石和多巴胺，室温反应；产物冷冻干燥，制得纳米羟基磷灰石/聚多巴胺针状复合止血粉。本材料具有多功能性的羟基磷灰石和聚多巴胺结构，能与许多基底进行进一步的改性。该材料可应用于不同剂型的不同形式的止血，与其它医用材料、医用器械进行综合，可制成紧急救生粉剂、止血水凝胶、自贴式敷料、止血抗菌海绵等，可通过抗菌、促伤口愈合、止痛药物与纳米羟基磷灰石进行掺杂或交联，或是这些药物与聚多巴胺进行反应，制备成为新型药物传输载体，实现止血材料的多功能一体化。

Description

外用纳米羟基磷灰石/聚多巴胺湿黏附型止血粉及其制备 方法
技术领域
本发明具体涉及一种外用纳米羟基磷灰石/聚多巴胺湿黏附型止血粉及其制备方法，属于生物医学止血材料领域。
背景技术
不可控出血被认为是手术、战争、交通事故等的首要致死原因，国内外针对止血材料的研究多局限于轻度出血，不可控出血的止血研究目前仍然处于研究空白。目前针对不可控出血的最常见解决方式依旧是采取纱布包扎压迫出血部位来实现止血，虽然可以起到一定的止血作用，但是压迫止血方法在解除压迫后往往又会导致二次出血。既能黏附在伤口上阻止出血，又能在伤口处形成稳定血凝块防止二次出血的止血材料，仍然是目前研究的重点和热点。
止血材料紧密黏附在伤口上能够有效帮助止血机体实现快速凝血，但是目前商用止血材料中，仅有水凝胶类止血材料可以实现在伤口处有较强的附着。但是当面对或是不可控大出血时，凝胶类止血材料并不能快速实现止血，从而将导致患者因失血过多而死亡。此外，止血材料如果不能紧密黏附在创伤处，将很容易导致一些致命病菌从伤口侵入人体(如HIV)，造成对伤者的二次伤害。
目前为止，国内市场应用于中、重度出血的紧急救生止血材料产品极少，常用的止血材料主要为云南白药、止血绷带以及纱布等，但其对于中、重度出血的快速控制是非常有限的。国外对于中、重度出血的相关止血材料有较多研究，但目前多以硅铝酸盐类和多聚糖类止血材料为主。虽然国外第二代硅铝酸盐类止血材料“Combat Gauze”可以有效缓解第一代材料发热和引起栓塞的问题，但是仍然不能有效控制重度出血。而以2007年问世的“Celox”为代表的壳聚糖类止血材料则会引发红细胞变形，材料的溶血率不能满足人们目前的要求。所以，将强湿黏附性与快速高效止血性能进行双结合，是打破目前止血材料瓶颈的方法之一。
羟基磷灰石是人体骨骼和牙齿的主要组成部分，生物相容性好，无毒、无刺激性、无人体排斥反应、不老化致敏致癌，并且可以和骨组织发生化学性结合，目前已经作为骨替代材料、整形和整容外科材料、齿科材料、层析纯化材料、补钙剂等被广泛应用，但目前暂无止血材料方面的相关报道。多巴胺具有很强的湿黏附特性，是贻贝分泌的足丝蛋白中的主要组成部分，具有促进组织修复和伤口愈合的能力，且具有很好的生物相容性。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一类基于新型羟基磷灰石/聚多巴胺(HAP/PDA)湿黏附型快速止血粉，并提供该类止血材料的制备方法。发明利用多巴胺在碱性环境下自聚的特点，并利用其易负载在纳米材料上的特点，采用一锅法制备得到HAP/PDA纳米针状复合材料。该材料具有很好的生物相容性，可以快速激活凝血系统、聚集血细胞，同时可以黏附在伤口上防止二次出血，有效避免出现因失血过多造成的死亡。
本发明为了实现上述目的，采用如下技术方案：
一种外用纳米羟基磷灰石/聚多巴胺湿黏附型止血粉，所述止血粉为负载聚多巴胺的纳米羟基磷灰石。
所述外用纳米羟基磷灰石/聚多巴胺湿黏附型止血粉，其特征在于：纳米羟基磷灰石与聚多巴胺的重量比为100:1-1:1。
本发明提供上述纳米HAP/PDA黏附型快速止血材料的制备方法，以纳米羟基磷灰石和多巴胺为原料，以不同反应比例(质量比为纳米羟基磷灰石：多巴胺＝100:1-1:1)在20-60℃下反应12-60h；产物冷冻干燥，制得HAP/PDA纳米针状复合材料。本发明提供上述制备方法得到的HAP/PDA纳米针状复合材料，具有很好的生物相容性和血细胞聚集能力，同时对血液具有较强的湿黏附性能。
进一步地，在上述技术方案中，缓冲溶液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲溶液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲溶液、巴比妥钠-盐酸缓冲溶液、三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲溶液、硼酸-硼砂缓冲溶液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液、碳酸钠- 碳酸氢钠缓冲溶液、PBS缓冲溶液，pH为7.0-10.0。
进一步地，在上述技术方案中，纳米羟基磷灰石与缓冲溶液用量比为 0.5g:100mL-5g:100mL。
进一步地，在上述技术方案中，冷冻干燥时间6-36h。
HAP/PDA纳米针状复合材料的特征是可以在伤口部位快速湿黏附，聚集血细胞，同时快速激活凝血系统，无毒无害无致敏性，实现止血材料的黏附和快速止血，此外材料本身在止血前后对机体无毒副作用。
HAP/PDA纳米针状结构由于引入了高生物相容性的纳米羟基磷灰石和多巴胺，体外细胞毒性实验表明该材料具有更优越的生物相容性。
本材料具有多功能性的羟基磷灰石和聚多巴胺结构，能与许多基底进行进一步的改性。因此，该材料可应用于不同剂型的不同形式的止血，与其它医用材料、医用器械进行综合，可制成紧急救生粉剂、止血水凝胶、自贴式敷料、止血抗菌海绵等，可通过抗菌、促伤口愈合、止痛药物与纳米羟基磷灰石进行掺杂或交联，或是这些药物与聚多巴胺进行反应，制备成为新型药物传输载体，实现止血材料的多功能一体化。
本发明与传统的止血材料相比，其特点是：
(1)使用简便，无需培训即可使用该止血粉。
(2)制备重复性高、批间差异小、生物安全性好，止血过程几乎不产生热量，不会对伤口造成灼伤等二次伤害。
(3)纳米羟基磷灰石与纳米聚多巴胺复合后，止血性能得到非常明显地提高。
(4)HAP/PDA纳米复合粉为针状结构，具有可多功能修饰的多巴胺官能团，可作为抗菌、促伤口愈合、止痛药物的载体，提高院前止血的效果，减少伤员因感染引起的伤残率。本纳米止血粉可与其它多种止血材料进行混合使用，也可与其他材料进一步改性完善其他止血材料。
附图说明
图1中(a)、(b)分别为HAP/PDA纳米止血粉的透射电镜图、XRD图，其中图1(b)中PM1～4 分别表示实施例1～4中生成的HAP/PDA纳米网状复合材料(下同)，且图1(b)中折线从上到下依次为PDA、HAP、PM1、PM2、PM3、PM4；
图2中(a)、(b)分别为HAP/PDA纳米止血粉的体外止血情况和所形成凝血块的情况；
图3中(a)、(b)分别为HAP/PDA纳米止血粉的细胞毒性和止血材料溶血率。
具体实施方法
下面结合实施例对本发明的方法做进一步说明，但并不是对本发明的限定。
(1)HAP/PDA纳米针状复合材料制备实施例
实施例1
在100mL pH＝7.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液或磷酸氢二钠-磷酸氢二钾缓冲溶液中，加入0.50g纳米羟基磷灰石和0.01g多巴胺，超声15min，室温反应12h；产物冷冻干燥 6h，制得HAP/PDA纳米网状复合材料。由图1(a)(50:1)HAP/PDA透射电镜图和图1(b)(50:1) HAP/PDA的XRD图可知，制得HAP/PDA纳米针状复合材料。
实施例2
在100mL pH＝8.5的三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲溶液或硼酸-硼砂缓冲溶液中，加入 1.00g纳米羟基磷灰石和0.05g多巴胺，超声15min，室温反应24h；产物冷冻干燥12h，制得 SiO2/PDA纳米针状复合材料。由图1(a)(20:1)HAP/PDA透射电镜图和图1(b)(20:1)HAP/PDA 的XRD图可知，制得HAP/PDA纳米针状复合材料。
实施例3
在100mL pH＝9.5的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液或巴比妥钠-盐酸缓冲溶液中，加入2.00g 纳米羟基磷灰石和0.20g多巴胺，超声15min，室温反应36h；产物冷冻干燥24h，制得HAP/PDA 纳米针状复合材料。由图1(a)(10:1)HAP/PDA透射电镜图和图1(b)(10:1)HAP/PDA的XRD 图可知，制得HAP/PDA纳米针状复合材料。
实施例4
在100mL pH＝10.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液或碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液中，加入 5.00g纳米羟基磷灰石，和1.00g多巴胺，超声15min，室温反应48h；产物冷冻干燥30h，制得HAP/PDA纳米针状复合材料。由图1(a)(5:1)HAP/PDA透射电镜图和图1(b)(5:1)HAP/PDA 的XRD图可知，制得HAP/PDA纳米针状复合材料。
(2)HAP/PDA纳米针状复合材料的性能实施例
实施例5(体外凝血)
采用抗凝采血袋采集猪血，取2mL猪血加入经过抗凝处理的5mL离心管中，加入上述实施例1-4制备的HAP/PDA纳米针状复合材料50mg，同时加入60μL 0.1M CaCl2溶液，用静音混合器进行震荡混合，记录血液完全凝固的时间，重复三次取平均值。将测试结果与商业化止血材料Surgicel和未进行多巴胺改性的纳米羟基磷灰石进行对比，可以得到图2(a)，可知实施例1-4的HAP/PDA纳米针状复合材料可以有效实现血液促凝。同时从图2(b)中可以发现，HAP/PDA纳米止血粉形成的血凝块较为坚固，不会出现血块下滑的情况。
实施例6(细胞毒性实验)
首先将HAP/PDA纳米止血粉进行紫外线照射杀菌2h，之后向一定量(40mg、80mg、120mg)的材料中加入2mL培养基(高糖：血清为9:1)，室温下浸泡24h。将处于对数生长期的Raw264.7巨噬细胞，接种在96孔板，细胞密度约为105细胞/mL，将96孔板置于37℃ 5％CO2的培养箱中培养24h，移除培养基，然后加入上述不同比例的100μL材料浸提液。置于培养箱孵育24h，移除培养基，并以PBS缓冲溶液洗涤两次，加入150μL MTT(0.5mg/mL，凯基生物科技)试剂，置于37℃5％CO2的培养箱继续培养4h，移除MTT试剂，加入150μL DMSO，将96孔板置于酶标仪中，振荡10mim后，测定其在492nm处吸光度值。根据公式 Asample/Acontrol，计算得到细胞存活率，如图3(a)所示，表明HAP/PDA纳米止血粉具有较低的细胞毒性。
实施例7(止血材料溶血率测试)
止血材料作为直接与血液进行作用的物质，其溶血率必须要达到一定标准才可能具有很好的应用前景。首先将采集到的血液用生理盐水稀释50-100倍，将稀释后的血液加入到 HAP/PDA纳米止血粉上，于37℃下培养2h。之后将样品在1000g下离心10-15min以除去红细胞，取上层清液200μL，测定其在540nm下的吸光度值。测试中以向稀释血液中加入2％100μL TX-100溶液培养2h作为阳性对照，以不向稀释血液中加入任何物质培养2h作为阴性对照，根据公式Abs样品/Abs阳性对照，计算得到HAP/PDA纳米止血粉的溶血率，如图3(b)所示，对比商品化材料Celox和Surgicel可知，HAP/PDA纳米止血粉具有相对较低的溶血率。

Claims (6)

1.一种外用纳米羟基磷灰石/聚多巴胺湿黏附型止血粉，所述止血粉为负载聚多巴胺的纳米羟基磷灰石。
2.如权利要求1所述外用纳米羟基磷灰石/聚多巴胺湿黏附型止血粉，其特征在于：纳米羟基磷灰石与聚多巴胺的重量比为100:1-1:1。
3.如权利要求1或2所述外用纳米羟基磷灰石/聚多巴胺湿黏附型止血粉的制备方法，其特征在于：在弱碱性溶液中，加入纳米羟基磷灰石和多巴胺，室温反应12-60h；产物冷冻干燥，制得纳米羟基磷灰石/聚多巴胺针状复合止血粉，纳米羟基磷灰石与聚多巴胺的重量比为100:1-1:1。
4.如权利要求3所述外用纳米羟基磷灰石/聚多巴胺湿黏附型止血粉的制备方法，其特征在于：冷冻干燥时间6-36h。
5.如权利要求3所述外用纳米羟基磷灰石/聚多巴胺湿黏附型止血粉的制备方法，其特征在于：纳米羟基磷灰石与弱碱性溶液用量比为0.5g:100mL-5g:100mL。
6.如权利要求3所述外用纳米羟基磷灰石/聚多巴胺湿黏附型止血粉的制备方法，其特征在于：缓冲溶液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲溶液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲溶液、巴比妥钠-盐酸缓冲溶液、三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲溶液、硼酸-硼砂缓冲溶液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液、PBS缓冲溶液，pH为7.0-10.0。
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