CN111426647A - 用于葡萄糖比色法检测的钒酸锌微球的水热合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可用于葡萄糖比色法检测的Zn3V3O8微球的水热合成方法,其是分别以Zn(CH3COO)2·2H2O和Na3VO4·12H2O为锌源、钒源,通过添加CTAB、甘氨酸、硫酸钠作为表面活性剂,利用碳酸铵调节pH值,经高温水热反应得到微球状Zn3V3O8。本发明所得微球状Zn3V3O8具有分散性好、催化性高、稳定性佳等优点,并具有过氧化物酶活性,可用于葡萄糖的可视化比色法检测,对葡萄糖的检出限高达9.33×10‑7 M,且具有较宽的线性范围。
Description
技术领域
本发明属于纳米功能材料制备领域,具体涉及一种用于比色法检测葡萄糖模拟酶的Zn3V3O8微球的水热合成方法。
背景技术
天然酶催化的高效性和专一性使其广泛应用于生物传感与疾病治疗,然而天然酶大多数为超分子结构的蛋白质,导致天然酶自身的成本高、稳定性低、难以保存,极大程度上限制了天然酶的应用与发展。模拟酶是一种由人工合成的催化剂,不仅弥补了天然酶的劣势,而且在保持天然酶专一性的同时,还具有高效的催化活性。因此,通过研究天然酶的结构及活性中心,设计具有相似活性的人工模拟酶,成为了研究人员的努力方向。近年来,纳米材料已受到了研究者们广泛关注,其自身由于尺寸小、比表面积大、表面活化中心多,而成为了天然酶的候选者。
目前,已经发现的模拟酶种类达上百种,如碳基、铁基化合物、贵金属基等纳米材料。这些纳米材料克服了天然酶价格高、不易保存等缺点,已经被成功应用在了医疗诊断、食品检测、免疫分析等方面。其中,钒基化合物因其独特的结构和性质,得到研究者们广泛的重视,然而其应用大多局限于光电领域,在生化分析领域的应用较少。Zn3V3O8作为众多钒酸盐中的一种,迄今主要的合成手段为,先合成前驱体,再经过高温煅烧得到Zn3V3O8纳米颗粒,其存在工艺流程复杂、反应温度过高、毒性大等问题。因此寻找新的、便捷的方法来合成Zn3V3O8,有助于开拓其新的应用领域。
糖尿病是当前威胁人类健康的四大疾病之一,根据IDF(The InternationalDiabetes Federation国际糖尿病联盟)统计,全世界糖尿病患者已达4.2亿左右。糖尿病会伴随着患者终身,目前尚无法彻底根治,且在治疗过程中,需要对患者血糖定期检测,以方便医生对患者的起居、饮食及医药提供指导。然而,目前商业化的血糖检测仪操作复杂,且具有一定误差。比色法具有操作简便、时效短等优点,受到研究者们的高度关注,尤其是近年来模拟酶已经应用于各种生化物质的比色检测。因此,发展方便、高灵敏度的比色法葡萄糖检测方法具有实际意义。
发明内容
本发明针对现有技术制备Zn3V3O8微球存在的合成方法复杂、需要经高温煅烧等缺点,提供一种水热合成Zn3V3O8微球的方法。该方法制得的Zn3V3O8微球具有较高的比表面积,并具有过氧化物酶活性,能够实现葡萄糖的可视化比色法检测。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种水热法合成Zn3V3O8微球的方法,其包括以下步骤:
1)分别称取0.4g Zn(CH3COO)2·2H2O、0.4g无水Na2SO4、0.4g甘氨酸、1g十六烷基三甲基溴化铵,混合加入到60mL去离子水中,室温下搅拌30min,使其形成溶液A;再称取0.42gNa3VO4·12H2O和0.42g碳酸铵,将两者混合加入到6mL去离子水中,室温下搅拌30min,使其形成溶液B;
2)将步骤1)得到的溶液B缓慢滴加到溶液A中,搅拌30min,得到的混合溶液放置在反应釜中,180℃高温反应24h;
3)反应结束后冷却至室温,离心,去除上层清液,沉淀物用去离子水和乙醇分别洗涤3~5次,经再次离心后,收集粉末,置于干燥箱中,在一定温度下干燥,制得所述Zn3V3O8微球。
步骤1)、2)中所述搅拌的转速为600 r/min。
步骤3)中所述离心的转速为8000 r/min,时间为10min。
步骤3)中所述干燥的温度为60℃,时间为12 h。
上述方法制得的Zn3V3O8微球具有过氧化物酶活性,可应用于葡萄糖的可视化检测。
本发明的有益效果在于:
(1)本发明提供了一种Zn3V3O8微球的水热合成方法,其是分别以Zn(CH3COO)2·2H2O和Na3VO4·12H2O为锌源和钒源,通过添加十六烷基三甲基溴化铵、甘氨酸、硫酸钠作为表面活性剂,利用碳酸铵调节pH值,在水热条件下合成了微球状的Zn3V3O8;该合成方法简单、反应条件温和、原料易得、价格低廉,具有较高的实用价值;
(2)本发明采用水热合成方法,通过控制反应温度和时间,可以制备微球状的Zn3V3O8,其具有更多的活性位点,能更好地与反应底物接触,并可利用表面多价态锌、钒离子的协同催化作用,更高效地催化过氧化氢氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB),而显蓝色;
(3)通过催化氧化实验表明,本发明制备的Zn3V3O8微球能够催化过氧化氢氧化TMB,通过测量米氏常数,评价Zn3V3O8与反应底物的亲和性,并推测其反应机理。
(4)本发明所得Zn3V3O8微球具有过氧化物酶活性,将其应用于葡萄糖的可视化比色检测,具有较低的检出限和较宽的检测范围。
附图说明
图1为实施例所制备Zn3V3O8微球的XRD谱图,其中(a)为Zn3V3O8微球,(b)为尖晶石Zn3V3O8的XRD标准卡片(JCPDS-31-1477);
图2为实施例所制备Zn3V3O8微球的扫描电镜图;
图3为Zn3V3O8微球可视化检测葡萄糖试验中各处理组的紫外可见吸收光谱图;
图4为Zn3V3O8微球可视化检测葡萄糖各样品的颜色变化情况图;
图5为Zn3V3O8微球催化H2O2氧化TMB的条件优化,其中(a)为温度;(b)为H2O2浓度;(c)为反应时间;
图6为Zn3V3O8微球与底物H2O2和TMB的米氏常数的测量图,其中(a)为固定H2O2浓度而改变TMB浓度。(b)为固定TMB浓度而改变H2O2浓度。
图7为Zn3V3O8微球催化H2O2氧化TMB的紫外可见吸收光谱图(a)和吸光度值与葡萄糖浓度的线性关系(b);
图8为Zn3V3O8微球与葡萄糖浓度的颜色变化情况图。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解,下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明,但是本发明不仅限于此。
实施例
一种可用于葡萄糖比色法检测的Zn3V3O8微球的水热合成方法,其包括以下步骤:
1)分别称取0.4g Zn(CH3COO)2·2H2O、0.4g无水Na2SO4、0.4g甘氨酸、1g十六烷基三甲基溴化铵,混合加入到60mL去离子水中,室温下600 r/min搅拌30min,形成溶液A;再称取0.42g Na3VO4·12H2O和0.42g碳酸铵,将两者混合加入到6mL去离子水中,室温下600 r/min搅拌30min,形成溶液B;
2)将步骤1)得到的溶液B缓慢滴加到溶液A中,600 r/min搅拌30min,使其充分混合,将得到的混合溶液放置在反应釜中,在180℃条件下反应24h;
3)反应结束后冷却至室温,8000 r/min离心10min,去除上层清液,沉淀物用去离子水和乙醇分别洗涤3~5次,经再次8000 r/min离心10min后,收集粉末,置于干燥箱中,在60℃条件下干燥12 h,制得所述Zn3V3O8微球。
一、Zn3V3O8微球的表征
(1)采用XRD和扫描电子显微镜对合成的Zn3V3O8进行表征
图1为所制备Zn3V3O8微球的XRD谱图。由XRD谱图可以看出,其35.5°、37.1°、56.9°和62.5°处衍射峰,分别对应于Zn3V3O8尖晶石结构(JCPDS-31-1477标准卡片)中的(220)、(311)、(511)和(440)晶面,未出现其他的峰,表明所合成的产物为纯的Zn3V3O8微粒。图2为水热合成Zn3V3O8微球的扫描电镜图。
图2为所制备Zn3V3O8微球的扫描电镜图。由图中可以看出,制备出的Zn3V3O8十分均匀,为球状结构,其直径约为2μm,表面较为粗糙。
二、Zn3V3O8微球可视化检测葡萄糖
称取1.5mg制备的Zn3V3O8微球,分散于1ml蒸馏水中,超声10min得到充分分散的Zn3V3O8溶液。取3个干净的比色瓶,分别加入不同的溶液构成对比试验:(1)50μl TMB(4mM)、50μlH2O2(5mM)和50μl 1.5mg/ml的Zn3V3O8分散溶液。(2)50μl TMB(4mM)和50μl H2O2(5mM)(3)50μl TMB(4mM)和50μl 1.5mg/ml的Zn3V3O8分散溶液。最后向三个比色瓶中加入pH=4的NaAc-HAc至1ml,在30℃的环境下反应15min。最后用紫外分光光度计记录波长652nm处的吸光度。
图3、图4分别为各处理组的紫外可见吸收光谱图及样品颜色变化情况图。由图3和图4可见,Zn3V3O8+TMB或是H2O2+TMB反应无明显现象,而Zn3V3O8+H2O2+TMB时,溶液在652nm处有吸收,且溶液呈蓝色,证明Zn3V3O8可催化H2O2产生·OH进而氧化TMB。
为了进一步提高反应的灵敏度,进行了反应条件的优化,结果如图5,其中(a)为温度;(b)为H2O2浓度;(c)为反应时间。由图5可见,反应温度为30℃、H2O2浓度为5mM时反应效果最好,反应在15min后吸光度值增加缓慢,故选用15min为最佳反应时间。
图6的(a)、(b)分别为固定的TMB(H2O2)和H2O2(TMB)的双倒数图,通过图中参数导出了TMB的米氏常数(Km)和酶促反应速度最大值(Vmax)分别为0.2894mM和9.225×10-8Ms-1,而H2O2的Km和Vmax分别为5.132mM和11.16×10-8Ms-1。而图中平行线展现出了乒乓机制的特点,表明Zn3V3O8先和第一底物H2O2反应释放反应物,然后再和第二底物TMB反应。
进一步利用上述机理实现葡萄糖的检测:取5mg/ml的葡萄糖氧化酶10μl与100μl梯度浓度(10~500μM)的葡萄糖溶液混合,并在37℃孕育1h,随后将50μl TMB(4mM)和50μl1.5mg/ml的Zn3V3O8分散溶液加入孕育后的溶液,并加入pH=4的NaAc-HAc缓冲溶液至1ml,将混合溶液置于30℃的环境下反应15min,最后用紫外分光光度计记录波长652nm处的吸光度。
图7为Zn3V3O8微球催化H2O2氧化TMB的紫外可见吸收光谱图(a)和吸光度值与葡萄糖浓度的线性关系(b)。图8为Zn3V3O8微球与葡萄糖浓度的颜色变化情况图。如图7和图8所示,随着葡萄糖浓度的增加,波长为652nm处的吸光度值在持续增加,颜色也在加深。检测结果表明,葡萄糖浓度在10-500 μM范围内可与652nm处的吸光度值呈现良好的线性关系,其相关系数R2=0.993,响应方程为A=1.318C +0.02938(mM),检出限达9.33×10-7 M(S/N=3)。由结果可知,Zn3V3O8微球能够有效的应用于葡萄糖的可视化比色检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰,皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (5)
1.一种用于葡萄糖比色法检测的Zn3V3O8微球的水热合成方法,其特征在于:包括以下步骤:
1)分别称取Zn(CH3COO)2·2H2O、无水Na2SO4、甘氨酸、十六烷基三甲基溴化铵,混合加入到去离子水中,室温下搅拌30min,使其形成溶液A;再称取Na3VO4·12H2O和碳酸铵,将两者混合加入到去离子水中,室温下搅拌30min,使其形成溶液B;
2)将步骤1)得到的溶液B按体积比1:10缓慢滴加到溶液A中,搅拌30min,得到的混合溶液放置在反应釜中进行高温反应;
3)反应结束后冷却至室温,离心去除上层清液,沉淀物用去离子水和乙醇分别洗涤3~5次,经再次离心后,在一定温度下干燥,制得所述Zn3V3O8微球。
2.根据权利要求1所述的Zn3V3O8微球的水热合成方法,其特征在于:步骤1)所述溶液A中Zn(CH3COO)2·2H2O、无水Na2SO4、甘氨酸、十六烷基三甲基溴化铵的浓度分别为0.4g/60mL、0.4g/60mL、0.4g/60mL、1g/60mL;所述溶液B中Na3VO4·12H2O和碳酸铵的浓度均为0.07g/mL。
3.根据权利要求1所述的Zn3V3O8微球的水热合成方法,其特征在于:步骤2)中所述高温反应的温度为180℃,时间为24h。
4.一种如权利要求1~3中任一项所述方法制得的Zn3V3O8微球。
5.一种如权利要求4所述Zn3V3O8微球在葡萄糖比色法可视化检测中的应用。
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