CN111411138A - 一种重组蛋白的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明适用于生物技术领域，提供了一种重组蛋白的制备方法，其包括以下步骤：将重组蛋白的表达工程菌株进行活化培养，得到活化菌落；将所述活化菌落依次进行一级培养和二级培养，得到二级种子；将所述二级种子置于发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵液；将所述发酵液进行离心处理，收集菌体；将所述菌体进行冻存后，再置于裂解液中进行裂解，然后经离心处理，得到以包涵体形式存在的重组蛋白；所述裂解液包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、聚乙二醇辛基苯基醚。该制备方法能够使菌体在自然条件下自行破碎，其不仅可以使得到的包涵体的蛋白完全不受外力的破坏，而且还可以使菌体的破碎率达到95%。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种重组蛋白的制备方法。
背景技术
目前，重组蛋白一般是通过对大肠杆菌等表达工程菌株进行发酵培养和诱 导表达而获得的。其中，传统重组蛋白的制备方法，往往需要通过超声破碎机 或高压匀浆机等菌体破碎设备对发酵诱导后的菌体进行破碎，才能获得以包涵 体形式存在的重组蛋白。
然而，传统重组蛋白的制备方法得到的包涵体存在破碎率较低的问题，而 且由于受外力影响，其还存在蛋白容易被损坏的问题，因此，目前亟待寻找一 种新的重组蛋白的制备方法。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种重组蛋白的制备方法，旨在解决背景技 术中提出的问题。
本发明实施例是这样实现的，一种重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：
将重组蛋白的表达工程菌株进行活化培养，得到活化菌落；
将所述活化菌落依次进行一级培养和二级培养，得到二级种子；
将所述二级种子置于发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵液；
将所述发酵液进行离心处理，收集菌体；
将所述菌体进行冻存后，再置于裂解液中进行裂解，然后经离心处理，得 到以包涵体形式存在的重组蛋白；每升所述裂解液包括以下组分：三羟甲基氨 基甲烷10～50mmol、乙二胺四乙酸2～10mmol、聚乙二醇辛基苯基醚0.005～0.02 L。
作为本发明实施例的一种优选方案，所述将重组蛋白的表达工程菌株进行 活化培养，得到活化菌落的步骤，具体包括：
将重组蛋白的表达工程菌株的浓度稀释至(103～104)个/mL后，再涂布于LB 固体琼脂培养皿上，并置于35～38℃的恒温条件下进行活化培养，得到活化菌落。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述一级培养的方法包括以下步骤：
挑取所述活化菌落接种到LB液体培养基中，并置于35～38℃的温度下进行 震荡培养，得到一级种子；
所述二级培养的方法包括以下步骤：
挑取所述一级种子接种到LB液体培养基中，并置于35～38℃的温度下进行 震荡培养，得到二级种子。
作为本发明实施例的另一种优选方案，每升所述发酵培养基包括以下组分： 甘油5～10g、NaCl 5～15g、蛋白胨10～20g、酵母粉10～20g。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述将所述二级种子置于发酵培养 基中进行发酵培养，得到发酵液的步骤，具体包括：
在35～38℃温度下，将所述二级种子置于发酵培养基中进行发酵培养至OD 600为2～10后，再添加诱导剂进行诱导培养，然后降温至4～10℃进行维持培养， 得到发酵液。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述步骤中，发酵培养的溶氧量控 制在40％以上。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述步骤中，冻存的温度为-80～-2 0℃。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述步骤中，裂解的温度为15～30℃。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳 糖苷。
本发明实施例提供的一种重组蛋白的制备方法，无需外用超声破碎机或高 压匀浆机等菌体破碎设备，能够使菌体在自然条件下自行破碎，其不仅可以使 得到的包涵体的蛋白完全不受外力的破坏，而且还可以使菌体的破碎率达到9 5％。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例， 对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以 解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
该实施例提供了一种人类胰岛素生长因子1的重组蛋白的制备方法，其包 括以下步骤：
S1、将重组蛋白的表达工程菌株的浓度稀释至103个/mL后，再涂布于LB 固体琼脂培养皿上，并置于37℃的恒温培养箱中进行活化培养16h，得到活化 菌落；其中，表达工程菌株是通过将含有人类胰岛素生长因子1的表达基因的 质粒-pET28a(+)-IGF1转入到大肠杆菌BL21(DE3)plysS中得到的。
S2、挑取生长良好的单个活化菌落接种到50mL的LB液体培养基中，并置 于37℃的温度下进行震荡培养7h至OD600约为2，得到一级种子；接着，挑 取上述一级种子接种到1L的LB液体培养基中，并置于35℃的温度下进行震荡 培养4h至OD600约为2，得到二级种子。
S3、在37℃温度下，将二级种子置于发酵培养基中进行发酵培养至OD600 为2.8后，再添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷并使其浓度达到1mmol/L进行诱导 培养4h至OD600为15左右，然后降温至4℃进行维持培养过夜，得到发酵液。 其中，发酵培养的溶氧量控制在45％，其pH需通过添加氨水控制在7；每升的 发酵培养基包括5g的甘油、5g的NaCl、10g的蛋白胨、20g的酵母粉，发酵培 养基的pH为7，其在使用前需要在115℃的温度下进行灭菌20min。
S4、将发酵液置于离心机中以6000rpm的转速进行离心处理，收集菌体。
S5、将上述菌体置于-80℃的冰箱中进行冻存后，再破碎成1～3cm的小块碎 片，并置于15℃的裂解液中进行裂解1h，然后经离心处理，取沉淀，即可得到 以包涵体形式存在的重组蛋白。其中，每升所述裂解液包括10mmol的三羟甲基 氨基甲烷、2mmol的乙二胺四乙酸和0.02L的聚乙二醇辛基苯基醚，裂解液的p H为7。
实施例2
该实施例提供了一种表皮生长因子的重组蛋白的制备方法，其包括以下步 骤：
S1、将重组蛋白的表达工程菌株的浓度稀释至104个/mL后，再涂布于LB 固体琼脂培养皿上，并置于37℃的恒温培养箱中进行活化培养20h，得到活化 菌落；其中，表达工程菌株是通过将含有表皮生长因子的表达基因的质粒-pET2 8a(+)-EGF转入到大肠杆菌BL21(DE3)plysS中得到的。
S2、挑取生长良好的单个活化菌落接种到50mL的LB液体培养基中，并置 于37℃的温度下进行震荡培养7h至OD600约为2，得到一级种子；接着，挑 取上述一级种子接种到1L的LB液体培养基中，并置于37℃的温度下进行震荡 培养4h至OD600约为2，得到二级种子。
S3、在37℃温度下，将二级种子置于发酵培养基中进行发酵培养至OD600 为10后，再添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷并使其浓度达到1.2mmol/L进行诱导 培养5h至OD600为15左右，然后降温至10℃进行维持培养过夜，得到发酵液。 其中，发酵培养的溶氧量控制在50％，其pH需通过添加氨水控制在7；每升的 发酵培养基包括10g的甘油、15g的NaCl、20g的蛋白胨、10g的酵母粉，发酵 培养基的pH为7，其在使用前需要在121℃的温度下进行灭菌30min。
S4、将发酵液置于离心机中以6000rpm的转速进行离心处理，收集菌体。
S5、将上述菌体置于-20℃的冰箱中进行冻存后，再破碎成1～3cm的小块碎 片，并置于30℃的裂解液中进行裂解1h，然后经离心处理，取沉淀，即可得到 以包涵体形式存在的重组蛋白。其中，每升所述裂解液包括50mmol的三羟甲基 氨基甲烷、10mmol的乙二胺四乙酸和0.005L的聚乙二醇辛基苯基醚，裂解液 的pH为9。
实施例3
该实施例提供了一种酸性成纤维细胞生长因子的重组蛋白的制备方法，其 包括以下步骤：
S1、将重组蛋白的表达工程菌株的浓度稀释至103个/mL后，再涂布于LB 固体琼脂培养皿上，并置于37℃的恒温培养箱中进行活化培养18h，得到活化 菌落；其中，表达工程菌株是通过将含有酸性成纤维细胞生长因子的表达基因 的质粒-pET28a(+)-aFGF转入到大肠杆菌BL21(DE3)plysS中得到的。
S2、挑取生长良好的单个活化菌落接种到50mL的LB液体培养基中，并置 于37℃的温度下进行震荡培养7h至OD600约为2，得到一级种子；接着，挑 取上述一级种子接种到1L的LB液体培养基中，并置于37℃的温度下进行震荡 培养4h至OD600约为2，得到二级种子。
S3、在37℃温度下，将二级种子置于发酵培养基中进行发酵培养至OD600 为2后，再添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷并使其浓度达到1.5mmol/L进行诱导 培养4.5h至OD600为15左右，然后降温至5℃进行维持培养过夜，得到发酵 液。其中，发酵培养的溶氧量控制在60％，其pH需通过添加氨水控制在7；每 升的发酵培养基包括6g的甘油、10g的NaCl、15g的蛋白胨、15g的酵母粉， 发酵培养基的pH为7，其在使用前需要在118℃的温度下进行灭菌25min。
S4、将发酵液置于离心机中以6000rpm的转速进行离心处理，收集菌体。
S5、将上述菌体置于-80℃的冰箱中进行冻存后，再破碎成1～3cm的小块碎 片，并置于20℃的裂解液中进行裂解1h，然后经离心处理，取沉淀，即可得到 以包涵体形式存在的重组蛋白。其中，每升所述裂解液包括20mmol的三羟甲基 氨基甲烷、2mmol的乙二胺四乙酸和0.01L的聚乙二醇辛基苯基醚，裂解液的p H为8。
对上述实施例1～3得到的菌体重量、包涵体湿重(以包涵体形式存在的重 组蛋白的湿重)以及菌体的破碎率(破碎率＝1-包涵体湿重/菌体重量)进行统计， 其统计结果如下表1所示。
表1
| 组别 | 菌体重量 | 包涵体湿重 | 破碎率 |
| 实施例1 | 1.2kg | 60g | 95％ |
| 实施例2 | 2kg | 80g | 96％ |
| 实施例3 | 1kg | 48g | 95.2％ |
从上表1可以看出，本发明实施例提供的重组蛋白的制备方法，在使蛋白 不被外力破坏情况下，还能使菌体拥有较高的破碎率。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细， 但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域 的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和 改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附 权利要求为准。
Claims (9)
1.一种重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将重组蛋白的表达工程菌株进行活化培养，得到活化菌落；
将所述活化菌落依次进行一级培养和二级培养，得到二级种子；
将所述二级种子置于发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵液；
将所述发酵液进行离心处理，收集菌体；
将所述菌体进行冻存后，再置于裂解液中进行裂解，然后经离心处理，得到以包涵体形式存在的重组蛋白；每升所述裂解液包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷10~50mmol、乙二胺四乙酸2~10mmol、聚乙二醇辛基苯基醚0.005~0.02L。
2.根据权利要求1所述的一种重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述将重组蛋白的表达工程菌株进行活化培养，得到活化菌落的步骤，具体包括：
将重组蛋白的表达工程菌株的浓度稀释至(103~104)个/mL后，再涂布于LB固体琼脂培养皿上，并置于35~38℃的恒温条件下进行活化培养，得到活化菌落。
3.根据权利要求1所述的一种重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述一级培养的方法包括以下步骤：
挑取所述活化菌落接种到LB液体培养基中，并置于35~38℃的温度下进行震荡培养，得到一级种子；
所述二级培养的方法包括以下步骤：
挑取所述一级种子接种到LB液体培养基中，并置于35~38℃的温度下进行震荡培养，得到二级种子。
4.根据权利要求1所述的一种重组蛋白的制备方法，其特征在于，每升所述发酵培养基包括以下组分：甘油5~10g、NaCl 5~15g、蛋白胨10~20g、酵母粉10~20g。
5.根据权利要求1所述的一种重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述将所述二级种子置于发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵液的步骤，具体包括：
在35~38℃温度下，将所述二级种子置于发酵培养基中进行发酵培养至OD600为2~10后，再添加诱导剂进行诱导培养，然后降温至4~10℃进行维持培养，得到发酵液。
6.根据权利要求5所述的一种重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤中，发酵培养的溶氧量控制在40%以上。
7.根据权利要求1所述的一种重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤中，冻存的温度为-80~-20℃。
8.根据权利要求1所述的一种重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤中，裂解的温度为15~30℃。
9.根据权利要求1所述的一种重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。
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Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| EP2019117A1 (en) * | 2007-07-27 | 2009-01-28 | BIOPHARM GESELLSCHAFT ZUR BIOTECHNOLOGISCHEN ENTWICKLUNG VON PHARMAKA mbH | Optimized purification process of recombinant growth factor protein |
| CN105420263A (zh) * | 2015-12-16 | 2016-03-23 | 温州医科大学 | 重组人成纤维细胞生长因子-17的生产方法 |
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