CN111394512A - 用于检测犬细小病毒的引物组及其应用 - Google Patents

用于检测犬细小病毒的引物组及其应用 Download PDF

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王召阳
刘雪婷
鑫婷
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Abstract

本发明实施例公开了一种用于检测犬细小病毒的引物组，所述引物组包括外引物对、内引物对以及环形引物对，其中，所述外引物对中一条引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，另一条引物的核苷酸序序列如SEQ ID NO：2所示；所述内引物对中一条引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，另一条引物的核苷酸序序列如SEQ ID NO：4所示；所述环形引物对中一条引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，另一条引物的核苷酸序序列如SEQ ID NO：6所示。本发明实施例根据犬细小病毒基因组中的VP2基因序列特征，设计特异性的实时荧光环介导等温扩增引物组，实用性强，可凭借实时荧光信号及溶解曲线直接判定结果，特异性强，灵敏度高。

Description

用于检测犬细小病毒的引物组及其应用
技术领域
本发明实施例涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测犬细小病毒的引物组及其应用。
背景技术
犬细小病毒(Canine parvovirus，犬细小病毒)是Eugster于1977年通过电镜观察腹泻犬只粪便发现的新型病毒，1979年由M.J.Appel等首先从患肠炎的病犬中分离获得，自发现以来一直在世界范围内传播。犬细小病毒可引起犬患上以剧烈呕吐、出血性肠炎、严重脱水、白细胞减少和心肌炎等为特征的急性接触性传染病。犬细小病毒病是危害犬群生命安全的最主要流行病之一，发病率高，死亡率高，尤其易致幼犬患病甚至死亡，给当前养犬业带来巨大的危害。犬细小病毒是细小病毒科、细小病毒属的单股负链线状DNA病毒。犬细小病毒基因组含有两个开放阅读框(ORF)，分别编码非结构蛋白NS1、NS2和结构蛋白VP1、VP2。该病毒自1978年发现以来，基因和抗原不断发生变异，1979年，原始犬细小病毒-2型毒株进化为2a亚型(犬细小病毒-2a)，1984年又发现了变异株犬细小病毒-2b。2001年，在意大利发现新的变异株犬细小病毒-2c[5]。随着犬细小病毒-2对宿主的适应和变异，新抗原变异型犬细小病毒-2a、犬细小病毒-2b和犬细小病毒-2c逐步替代了犬细小病毒-2的流行。犬细小病毒-2抗原变异的同时，其对宿主(犬、猫)嗜性、毒力等生物学特性也随之改变。犬细小病毒感染的实验室诊断方法主要有病毒分离鉴定、血凝试验(HA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、聚合酶链反应(PCR)，这些方法存在操作繁琐、技术和试验条件要求高、试验周期长等缺点，难以满足临床上快速、大量检测的需要。
发明内容
为此，本发明实施例提供一种用于检测犬细小病毒的引物组及其应用，以解决现有技术中检测犬细小病毒特异性、敏感性差的问题。
为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
一种用于检测犬细小病毒的引物组，所述引物组包括外引物对、内引物对以及环形引物对，其中，
所述外引物对中一条引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，另一条引物的核苷酸序序列如SEQ ID NO：2所示；
所述内引物对中一条引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，另一条引物的核苷酸序序列如SEQ ID NO：4所示；
所述环形引物对中一条引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，另一条引物的核苷酸序序列如SEQ ID NO：6所示。
本发明的一个实施例中，所述引物组是针对犬细小病毒VP2基因保守区设计。
一种用于环介导等温扩增检测犬细小病毒的试剂盒，其包括上述所述的引物组，也属于本发明实施例保护的范围。
本发明的一个实施例中，所述试剂盒还包括：Isothermal Master Mix试剂，购自北京晟泰勃科技有限公司；
阳性标准品，其以犬细小病毒病毒cDNA设计引物对扩增得到的DNA片段，插入Blunt-zero载体连接，转化DH5α感受态细胞，得到重组表达载体，以所述重组表达载体提取的质粒为所述阳性标准品。
本发明的一个实施例中，所述引物对的一条核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，另一条核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。
上述所述的引物组、所述的试剂盒在制备检测犬细小病毒产品中的应用，也属于本发明实施例保护的范围。
本发明实施例中，环介导等温扩增技术(loop-meditated isothermalamplification，LAMP)是Notomi等发明的一种等温核酸扩增技术。它依靠针对靶基因设计的4条特异性内外引物，在恒定的温度(61～65℃)下，利用BstDNA聚合酶，以脱氧核糖核苷三磷酸为原料进行DNA合成反应，最终生成由一系列反向重复的目的基因构成的茎环样结构和多环花椰菜样结构组成的DNA片段混合物。为了提高反应速度，还可以通过引入两条环引物加快反应，环引物与合成过程中形成的环状区域互补，增加了在LAMP反应中DNA合成的起点数量，可大大缩短检测时间，提高检测效率。
LAMP作为一种新型分子生物学检测技术，LAMP体系中的4条引物须分别与靶基因的6个或8个特异区完全匹配后才能反应；而PCR体系仅需上下游各1条引物与靶基因匹配即可，因此，LAMP具有更高的特异性。并且此方法灵敏度高，比传统的PCR方法高2～5个数量级。此外,LAMP反应时间短，检测效率较高。在LAMP反应起始阶段无须DNA模板的热变性过程，从而缩短了反应起始时间；由于LAMP扩增模板呈哑铃状结构，含多个扩增起始点，可同时进行扩增，因此提高了扩增效率。PCR需要至少90分钟才能完成的扩增反应，LAMP只需15～45分钟，大大节约了检测时间。LAMP临床使用不需要特殊的仪器，仅需一个能保持恒定温度的水浴锅或加热块或快速等温扩增仪即可进行反应，因此降低了对仪器的要求。检测结果可直接通过肉眼观察，在DNA合成时，从脱氧核糖核酸三磷酸底物(dNTPs)中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子反应，产生大量焦磷酸镁沉淀，呈现白色。因此，只用肉眼观察白色浑浊沉淀，就能鉴定扩增与否，或者通过快速等温扩增仪快速扩增，扩增过程实时监控，在15～45分钟内完成户外检测，无须再进行繁琐的电泳实验来验证，降低了对仪器的要求。
本发明实施例具有如下优点：
本发明实施例根据犬细小病毒基因组中的VP2基因序列特征，设计特异性的LAMP引物组，实用性强，可凭借实时荧光信号及溶解曲线直接判定结果，特异性强，灵敏度高。
本发明实施例所建立的LAMP检测方法能在45min内检测3.8拷贝数/微升的病毒核酸，比常规PCR方法敏感100倍。
本发明实施例应用带有荧光染料的IMM(Isothermal Master Mix)及相应仪器GenieⅡIAP(Isothermal Amplification Platform)，反应结束后，无需开盖，反应结果判定通多荧光值来判定以及反应结束后的退火温度的特异性来判断，降低了污染的可能性，更加适用于现地使用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1为本发明实施例的犬细小病毒标准品PCR鉴定，其中，well1：所构建重组质粒；well2：阴性对照。
图2为本发明实施例的犬细小病毒LAMP特异性实验荧光信号曲线，其中，well1：犬细小病毒阳性DNA；well2：脑心肌炎病毒cDNA；well3:犬冠状病毒阳性cDNA；well4:犬腺病毒阳性DNA；well5：犬瘟热病毒阳性cDNA；well6：阴性对照；
图3为本发明实施例的犬细小病毒LAMP特异性实验溶解曲线，其中，well1：犬细小病毒阳性DNA；well2：脑心肌炎病毒cDNA；well3:犬冠状病毒阳性cDNA；well4:犬腺病毒阳性DNA；well5：犬瘟热病毒阳性cDNA；well6：阴性对照；
图4为本发明实施例的犬细小病毒LAMP敏感性实验荧光信号曲线，其中，well1:3.4×106copies/μl；well2:3.4×105copies/μl；well3:3.4×104copies/μl；well4:3.4×103copies/μl；well5:3.4×102copies/μl；well6:3.4×101copies/μl；well7：3.4×100copies/μl；well8：阴性对照；
图5为本发明实施例的犬细小病毒LAMP敏感性实验溶解曲线，其中，well1:3.4×106copies/μl；well2:3.4×105copies/μl；well3:3.4×104copies/μl；well4:3.4×103copies/μl；well5:3.4×102copies/μl；well6:3.4×101copies/μl；well7：3.4×100copies/μl；well8：阴性对照；
图6为本发明实施例的临床样品检测荧光信号曲线，Well1-10：临床样品DNA；well11：阴性对照；
图7为本发明实施例的临床样品检测溶解曲线，Well1-10：临床样品DNA；well11：阴性对照；
图8为本发明实施例的临床样本PCR普通检测核酸电泳图，其中，M：2K Maker；1-10:临床样品PCR产物。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1、用于检测犬细小病毒的引物组的设计
针对犬细小病毒基因组中的VP2基因序列，下载GenBank中登录的犬细小病毒基因序列，利用DNASTAR的MegAlign软件进行分析比较，选择VP2基因前段保守区域片段(GenBankMN561321.1)，利用LAMP引物设计的在线网站(http://primerexplorer.jp/e/)设计引物，设计特异性的LAMP引物组，该引物组包括对外引物、内引物对和环形引物对。其中，外引物对由F3和B3组成，内引物对由FIP和BIP组成，环形引物对由loopB和loopF组成。如表1所示。
表1
Figure BDA0002409443660000061
实施例2、检测犬细小病毒特异性
1.毒株：犬细小病毒、犬腺病毒为中国农业科学院北京畜牧兽医研究所分离，将临床收集的犬细小疑似病料接种猫肾细胞(CRFK细胞)，经3次传代后分离出犬细小病毒。将犬传染性肝炎病料接种犬肾细胞(MDCK细胞)，经3次传代后分离出犬腺病毒。犬冠状病毒为卫佳8犬用八联疫苗株，购自美国硕腾公司。脑心肌炎病毒为中国农业大学兽医学院保存，犬瘟热病毒为疫苗株CDV-11，购自齐鲁动物保健品有限公司。
2.病毒核酸的提取：用AxyPrepTM Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit250-prep(该提取试剂盒购自北京强欣博瑞生物技术有限公司)按照说明书方法提取犬细小病毒、脑心肌炎病毒，犬腺病毒的DNA，放置-80冰箱保存备用，提取犬冠状病毒、犬瘟热病毒的RNA，并用HiScript Q RT SuperMix for qPCR(Vazyme)试剂盒按照说明书反转录cDN，放置-80冰箱保存备用。
3.阳性标准品的制备：以提取的犬细小病毒病毒为模板，用所设计的VP2基因(MK306290.1)特异性引物
SEQ ID NO：7，F：5’-AGAGACAATCTTGCACCAATGAGTGA-3’
SEQ ID NO：8，R：5’-TTAATATAATTTTCTAGGTGCTAGTTGA-3’
扩增片段长度为1773bp，扩增体系为25μl，12.5μl，
Figure BDA0002409443660000062
Max Master Mix(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)，上下游引物(10μM)各1μl，cDNA 2μl，ddH2O 8.5μl。
PCR程序为预变性95℃3min，95℃变性15sec,56℃退火15sec，72℃延伸2min，共35个循环，72℃彻底延伸5min)。反应结束后加入5.5μl核酸10×Loading Buffer，吹吸混匀后，进行琼脂糖凝胶电泳，经胶回收试剂盒切胶回收后，与参考Blunt-zero载体说明书进行连接(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)，转化DH5α感受态细胞，应用PCR鉴定重组质粒，并将质粒进行测序鉴定，如图1所示。鉴定结果正确后，利用质粒提取试剂盒提取质粒，并在使用微量核酸蛋白测定仪测定浓度后计算拷贝数，放置-80冰箱保存备用，使用时进行10倍浓度连续稀释。
4.LAMP实验条件：25μl反应体系，包括15μl IMM(Isothermal Master Mix)试剂，购自北京晟泰勃科技有限公司。六条引物各1μl，模板4μl。实验不同的温度(61℃、63℃、65℃、67℃)、不同时间(30min、45min、60min)检测引物反应性能。
5.特异性实验
取犬细小病毒、脑心肌炎病毒，犬冠状病毒、犬腺病毒、犬瘟热病毒提取的DNA(或反转录的cDNA)同时进行LAMP试验，并重复实验操作一次。
LAMP方法的特异性试验结果，犬瘟热病毒、脑心肌炎病毒，犬冠状病毒、犬腺病毒均为阴性，而对犬细小病毒阳性DNA有很好的扩增，本发明实施例的引物组检测时具有很好的特异性。此外，本结果出现明显的荧光信号，并且退火温度在83℃±0.5℃，判断为阳性，如图2和图3所示。
实施例3、检测犬细小病毒敏感性
将实施例2制备的阳性质粒标准品进行10倍连续稀释，取拷贝数为3.4×101拷贝数/μl至3.4×105拷贝数/μl五个梯度的样品进行LAMP反应，确定检测敏感度，并重复实验操作一次。
LAMP方法敏感性结果，将制备的阳性标准质粒标准品进行10倍连续稀释，确定犬细小病毒环介导等温扩增方法检测敏感度为3.4×101拷贝数/μl，其敏感性为普通PCR的100倍。如图4所示，为本发明实施例敏感性式样荧光信号图，如图5所示，为本发明实施例的犬细小病毒LAMP敏感性实验溶解曲线。
实施例4、临床试验检测
对本实验室收集的20份临床样品按实施例2中的方法提取DNA后，进行LAMP和PCR检测。
临床样品检测，对本实验室收集的20份临床样品同时进行犬细小LAMP检测及普通PCR反应，检测结果显示LAMP检测方法以及PCR都检测出了其中10份阳性样品，符合率达到100％。如图6所示，为本发明实施例的临床样品检测荧光信号曲线；如图7所示，为本发明实施例的本发明实施例的临床样品检测溶解曲线；如图7所示，为本发明实施例的临床样本PCR普通检测核酸电泳图。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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Figure BDA0002409443660000101
Figure BDA0002409443660000111
Figure BDA0002409443660000121
序列表
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120> 用于检测犬细小病毒的引物组及其应用
<130> GG19691752A
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
tccaggagat tggcaacta 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gtaagtgtac tggcacagaa t 21
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
tcagatctca tagctgctgg agttgctact cagccaccaa 40
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
aaccaaccat accaactcca tgacatcatc tggatctgta cca 43
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
gcaaccatca atgatgcagt ta 22
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
ggaactagtg gcacaccaa 19
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
agagacaatc ttgcaccaat gagtga 26
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
tataattttc taggtgctag ttagattt 28

Claims (6)

1.一种用于检测犬细小病毒的引物组，其特征在于，所述引物组包括外引物对、内引物对以及环形引物对，其中，
所述外引物对中一条引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，另一条引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
所述内引物对中一条引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，另一条引物的核苷酸序序列如SEQ ID NO：4所示；
所述环形引物对中一条引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，另一条引物的核苷酸序序列如SEQ ID NO：6所示。
2.如权利要求1所述的用于检测犬细小病毒的引物组，其特征在于，
所述引物组是针对犬细小病毒VP2基因保守区设计。
3.一种用于环介导等温扩增检测犬细小病毒的试剂盒，其特征在于包括权利要求1或2所示的引物组。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：
Isothermal Master Mix试剂，购自北京晟泰勃科技有限公司；
阳性标准品，其以犬细小病毒病毒cDNA设计引物对扩增得到的DNA片段，插入Blunt-zero载体连接，转化DH5α感受态细胞，得到重组表达载体，以所述重组表达载体提取的质粒为所述阳性标准品。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，
所述引物对的一条核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，另一条核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。
6.权利要求3所述的试剂盒在制备检测犬细小病毒产品中的应用。
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