CN111387135B - 一种系统性监测并净化孵化过程中绿脓杆菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种系统性监测并净化孵化过程中绿脓杆菌的方法，属于家禽育种的技术领域，方法包括以下步骤：S1对入孵前的种蛋、孵化器等用消毒剂A消毒后，分别检测种蛋、孵化器和孵化厅内空气以及用水中的绿脓杆菌量，合格即可；S2孵化中，检测孵化厅内空气绿脓杆菌含量，合格即可；S3出雏后，对鸡绒毛、出雏厅内空气和出雏器表面检测绿脓杆菌含量，合格后进入下一流程；当绿脓杆菌检测不合格时，对样品或环境再次消毒；所述消毒剂A由以下质量百分比的原料混合而成：戊二醛0.97~1.21%，环氧沙星0.5~0.9%，烯肟菌胺5~9%，余量为75%乙醇溶液。本发明的方法具有有效、快速消毒孵化过程中的绿脓杆菌、保证无菌孵化环境的优点。
Description
技术领域
本发明涉及家禽育种的技术领域，更具体地说，它涉及一种系统性监测并净化孵化过程中绿脓杆菌的方法。
背景技术
绿脓杆菌又称铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)，属于假单胞菌属的一种革兰氏阴性杆菌，绿脓杆菌在自然界中分布广泛，土壤、水、肠内容物、动物体表等处都有本菌存在。鸡、火鸡是最常见禽类宿主，浸蛋溶液中可能也会污染此菌。而腐败鸡蛋在孵化器内破裂，可能是雏鸡爆发绿脓杆菌感染的一个来源。雏鸡对绿脓杆菌的易感性最高，随着日龄的增加，易感性越来越低；若孵化器被绿脓杆菌污染，在孵化过程中会出现爆破蛋，同时出现孵化率降低，死胚增多，严重影响企业的效益。
因此在家禽养殖业，需要在种蛋孵化至雏鸡的过程中进行细菌的监测，尤其是绿脓杆菌的监测。但是目前大多仅对消毒后的孵化器以及入孵前的种蛋进行表面拭子监测，监测流程成线性，监测范围不完整，从而造成监测效果不佳，虽然监测的结果显示绿脓杆菌的含量合格，但是依然有不少雏鸡因感染绿脓杆菌而死亡的情况出现。
因此，构建一种立体监测种蛋孵化至雏鸡过程中的绿脓杆菌的监测体系以及消毒方法是十分必要的。
目前对于孵化过程中有害细菌的消毒主要采用的消毒剂是质量分数为2％的戊二醛。其具体的使用方法是将入孵前的种蛋和孵化器用浓戊二醛喷洒10min，随后用浓戊二醛熏蒸10min即可。但是采用这样的方法进行消毒时，进行第一批的消毒-种蛋孵化流程后，监测到孵化厅中或者种蛋中仍出现绿脓杆菌检测结果不合格的情况；在进行多批的种蛋孵化之后，孵化厅中的绿脓杆菌的检测结果才会在一次性消毒之后，实现全过程合格，达到无菌孵化过程的要求。
目前较多的研究在于对消毒剂的选择，申请号为201811146426.2的发明专利公开了一种家禽养殖杀菌消毒剂，消毒剂包括以下组分：大黄25～35份，大青叶10～20份，连翘20～30份，艾叶10～20份、生姜15～25份、野菊花5～8份、防风7～12份、生姜20～30份、艾草10～20份、二氧化硅3～6份，乙二胺四乙酸5～10份，高锰酸钾1.5～3.5份，脂肪醇聚氧乙烯醚0.5～1.5份，二氯醋酸3～6份，过氧化钙1～2份，聚合氯化铝1.5～2.5份。上述的消毒剂在制备的过程中原料过多，制备复杂。
这样的消毒过程无疑为种蛋的孵化工作带来了很大的工作量，使得操作繁多的情况下还会因为雏鸡的细菌感染带来经济损失。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种系统性监测并净化孵化过程中绿脓杆菌的方法，其具有通过采用多时间点、多采样点的全方面的检测方法结合高效消毒的消毒剂实现有效、快速实现孵化过程中绿脓杆菌的零检出率。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种系统性监测并净化孵化过程中绿脓杆菌的方法，所述方法包括以下步骤：
S1对入孵前的种蛋、孵化器、孵化厅、出雏器以及出雏厅使用消毒剂A进行消毒，随后分别检测种蛋表面、孵化器表面、孵化器内喷雾用水中以及孵化厅内的空气中的绿脓杆菌含量，绿脓杆菌零检出即为合格，检测合格后进入种蛋库，准备进入孵化过程；
S2种蛋孵化，并检测孵化过程中孵化厅内空气中的绿脓杆菌含量，绿脓杆菌零检出即为合格；
S3将种蛋转入出雏大厅，出雏后，对鸡绒毛、出雏厅内的空气、出雏器表面和出雏器内喷雾用水进行绿脓杆菌含量的检测，绿脓杆菌零检出即为合格，检测合格后进入下一培育流程即可；
上述绿脓杆菌的监测过程中采集的样品出现不合格时，对检测不合格的种蛋、孵化器、孵化厅内的空气、出雏器和出雏厅内的空气采用消毒剂B进行消毒，对检测不合格的孵化器内喷雾用水和出雏器内喷雾用水采用消毒剂C进行消毒；所述消毒剂A是将戊二醛、环丙沙星和烯肟菌胺加入75％乙醇溶液后形成的混合溶液，其中戊二醛的质量分数为0.97～1.21％，环氧沙星的质量分数为0.5～0.9％，烯肟菌胺的质量分数为5～9％，余量为75％乙醇溶液；将消毒剂A喷洒至待消毒的物品上10～15min后再熏蒸10～15min即可。
通过采用上述技术方案，首先在对家禽孵化过程监测时，采用多时间点、同一时间点多取样点的绿脓杆菌的监测方式，实现了对孵化过程中的绿脓杆菌含量的全面检测以及对检出的不合格样品的及时消毒，保证了家禽孵化过程的洁净。通过筛选得到每个时间节点中必要检测的样品，保证以所选样品的检测情况作为整体评判孵化过程是否洁净的依据，建立一种立体的、系统性的监测体系。
与此同时，在对系统进行前期消毒时，采用消毒剂A进行消毒。首先，戊二醛对微生物的杀灭作用主要依靠醛基，醛基作用于菌体蛋白的巯基、羟基、羧基和氨基，使得菌体蛋白烷基化，引起蛋白质凝固造成细菌死亡；环丙沙星为氟喹诺酮类，主要作用于细菌细胞DNA螺旋酶的A亚单位，抑制DNA的合成和复制而导致细菌死亡；烯肟菌胺作用于真菌的线粒体呼吸，药剂通过与线粒体电子传递链中复合物Ⅲ(Cyt bc1复合物)的结合，破坏ATP的合成，从而起到抑制或杀死细菌的作用。而在使用消毒剂A的过程中，以戊二醛的消毒作用为主，辅助以环丙沙星和烯肟菌胺的杀菌作用进行彻底全面的消毒，而75％乙醇在本方案中既是一种消毒剂，也作为溶解烯肟菌胺的溶剂。由于戊二醛在熏蒸的时候易挥发，且戊二醛具有一定的毒性，在熏蒸后将挥发的戊二醛排出，那对于残留的绿脓杆菌无法一次性杀灭，只能是大面积消毒；而此时溶剂75％乙醇中的乙醇也大范围的挥发，剩下环丙沙星和烯肟菌胺留在待消毒的环境中，而环丙沙星和烯肟菌胺低毒性却也具有较高的杀菌和灭菌的能力，在后期起到一定的杀菌消毒的作用，使得消毒效果更加明显，显著缩短了实现无菌孵化过程的时间。而较好的消毒效果下，使用更加低毒的环丙沙星和烯肟菌胺替代部分戊二醛，使得消毒剂的使用更加环保、安全。
进一步地，所述消毒剂A的制备包含以下步骤：
(1)配置得到体积分数为75％的乙醇溶液，备用；准备环丙沙星、烯肟菌胺备用；准备戊二醛溶液备用；
(2)将烯肟菌胺加入75％的乙醇溶液中后搅拌，得到均一的溶液a；
(3)分别将环丙沙星和戊二醛溶液加入溶液a中，搅拌均匀得到消毒剂A。
通过采用上述技术方案，通过上述的步骤，首先将不易溶解的烯肟菌胺溶解后再将环丙沙星、戊二醛加入，获得消毒剂A的溶液。
进一步地，对所述种蛋表面、孵化器表面以及出雏器表面进行取样的具体操作为：在装有灭菌生理盐水的试管中浸湿灭菌的棉签头，在试管内壁上挤压多余的盐水，在规板范围(5×5cm)内滚动棉签头涂抹取样，去掉棉棒的手持端且将棉签头落入生理盐水试管内，塞进试管后送检。
通过采用上述技术方案，保证取样过程中没有杂菌进入的可能，进而影响监测结果，保证检测出的所有细菌仅来自于种蛋表面。
进一步地，对所述孵化厅内空气和出雏厅内空气进行取样的具体操作为：将灭菌后的平皿打开，置于采样点，暴露13～17min后盖好平皿，标注采样部位后；同时取一组未开启的平皿作为阴性对照组，随后进行培养和检测。
通过采用上述技术方案，保证取样过程中没有杂菌进入的可能，保证检测出的所有细菌仅来自于孵化厅内的空气中，并以阴性对照组排除平皿中杂菌对检测结果的影响；同时一定的平皿暴露时间保证取样的有效性。
进一步地，对孵化厅内空气进行取样的过程中，所述采样点远离墙壁1m以上且不在空气流通处进行采样，所述空气流通处包括开启的加湿器、空调、暖风机、排风扇的所在处。
通过采用上述技术方案，避免在对空气中的细菌检测中，靠近墙壁、加湿器等之后，由于墙壁等上有杂菌的存在，可能影响对孵化厅空气中绿脓杆菌的检测。
进一步地，所述鸡绒毛取样量不少于20g。
通过采用上述技术方案，充足的取样避免出现在对鸡绒毛进行取样检测时因为取样过少，使得检测的样品不具有检测的可靠性，进而保证鸡绒毛检测结果更加准确。
进一步地，所述孵化器内喷雾用水和出雏器内喷雾用水取样的具体操作为：打开水阀门放水3～5min，随后采集水样80～100ml于密闭容器内，关闭阀门即可，随后水样送去检测。
通过采用上述技术方案，准确地选取待检测的水样，使得水样的检测结果准确可信。
进一步地，所述消毒剂B为洗洁宝。
通过采用上述技术方案，对于孵化过程中的非全范围的消毒中，采用市售的洗洁宝进行消毒，操作简单高效。
进一步地，所述消毒剂C为二氯异氰尿酸钠，所述二氯异氰尿酸钠在水中的添加量为5000mg/L。
通过采用上述技术方案，能够有效地杀灭水中的绿脓杆菌。
进一步地，所述绿脓杆菌培养基为十六烷三甲基溴化铵培养基。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
第一、本发明对家禽孵化过程监测时，采用多时间点、同一时间点多取样点的绿脓杆菌的监测方法，实现了对孵化过程中绿脓杆菌含量的全面、系统、多方位的监测以及及时的消毒工作，保证了家禽孵化过程的洁净；同时，在对系统进行前期消毒时，采用消毒剂A进行消毒：消毒剂A以戊二醛的消毒作用为主，辅助以环丙沙星和烯肟菌胺的杀菌作用进行彻底全面的消毒，且75％乙醇既是一种杀菌剂，也作为溶解烯肟菌胺的溶剂；戊二醛的大面积消毒结合环丙沙星以及烯肟菌胺对环境低毒性却具有较高的杀菌和灭菌的能力，使得消毒效果更加明显，显著缩短了实现无菌孵化过程的时间周期。
第二、本发明对孵化过程中的绿脓杆菌的规范化采样操作，使得采样的结果更加准确，有利于对孵化过程的及时消毒，使得对绿脓杆菌的监测消毒方法更加高效。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。
本发明的实施例中的原料均为市售，其中，乙醇购自连云港乐通化工贸易有限公司；烯肟菌胺购自阿尔塔科技有限公司；环丙沙星购自天津希恩思生化科技有限公司，品牌为希恩思，产品编号为41019，产品纯度为98％；浓戊二醛购自正大预混料(广汉)有限公司，戊二醛的质量分数为50～52％；洗洁宝购自正大预混料(广汉)有限公司，其杀菌的有效成分含量10％；十六烷三甲基溴化铵培养基购自北京陆桥技术股份有限公司，商品型号为CM704；二氯异氰尿酸钠购自广东温氏大华农生物科技有限公司，有效氯的质量分数为55％。
实施例1
本发明提供了一种系统性监测并净化孵化过程中绿脓杆菌的方法，所述方法包括以下步骤：
S1对入孵前的种蛋、孵化器、孵化厅、出雏器以及出雏厅使用消毒剂A进行消毒。其中，消毒剂A是戊二醛溶液、环丙沙星和烯肟菌胺加入75％乙醇溶液后形成的混合溶液，其中戊二醛溶液的质量分数为1.09％，环氧沙星的质量分数为0.7％，烯肟菌胺的质量分数为7％，作为溶剂的75％乙醇溶液的质量分数为91.21％，其中75％乙醇溶液的配置方法是将纯乙醇和水以体积比为1：3的比例混合后搅拌均匀即可。随后进行种蛋的孵化流程。
消毒剂A的配置方法为：(1)配置得到体积分数为75％的乙醇溶液，备用；准备粉末状的环丙沙星、烯肟菌胺备用；准备戊二醛溶液备用；
(2)将上述比例的烯肟菌胺加入75％的乙醇溶液中后常温搅拌，使得烯肟菌胺完全溶解在75％乙醇溶液中，得到均一的溶液a；
(3)分别将环丙沙星和戊二醛溶液加入溶液a中，搅拌均匀得到消毒剂A。
消毒剂A的使用方法为：将消毒剂A喷洒至孵化厅内以及孵化器上，喷洒13min后，再熏蒸13min即可完成对孵化厅的消毒；随后将消毒剂A喷洒至种蛋和蛋托表面，喷洒13min后，再熏蒸13min即可完成对种蛋和蛋托的消毒。消毒之后，将种蛋置于种蛋库，准备孵化。
在孵化之前，分别检测种蛋表面、孵化器表面和孵化厅内空气以及孵化器内喷雾用水中的绿脓杆菌含量，其结果如表1所示。
表1步骤S1中各个样本的绿脓杆菌含量的检测结果
对于在上述的步骤中检测不合格的种蛋样本，如表1所示，需要对种蛋进行二次消毒，具体操作为：采用消毒剂B(即洗洁宝)对种蛋表面进行喷雾消毒，消毒时间为10min，平均消毒量为1mL/枚。对孵化器表面进行二次消毒，其具体的操作为：对孵化器采用洗洁宝擦拭消毒。对孵化厅内的空气进行二次消毒，其具体的操作为：将洗洁宝加入弥雾消毒机内，以弥雾消毒机喷洒弥雾进行消毒。对孵化器内喷雾用水采用消毒剂C进行消毒，具体操作为在用水中添加5000mg/L的二氯异氰尿酸钠进行消毒。
随后再选取新的种蛋表面拭子样本、孵化器表面拭子样本、孵化器内喷雾用水样本以及孵化厅内空气样本，重新检测样品中的绿脓杆菌的含量，结果表明绿脓杆菌的检出率为零。
S2种蛋孵化，孵化过程全程21天，孵化18日照蛋、落盘，随后将种蛋转入出雏器，出雏器的温度37.8℃，湿度50％～60％。
孵化过程中对孵化厅内的空气进行绿脓杆菌含量的检测，其结果为：孵化厅内的空气中绿脓杆菌的含量为23cfu/g。随后对其进行再次消毒，具体消毒操作同步骤S1中所述。
随后再选取新的孵化厅内的空气样本，重新检测样本中的绿脓杆菌的含量，结果表明绿脓杆菌在各个样品中的检出率为零。
S3出雏后，对鸡绒毛、孵化厅内的空气和孵化器表面进行绿脓杆菌含量的检测，其结果如表2所示。
表2步骤S3中各个样本的绿脓杆菌含量的检测结果
如表2所示，鸡绒毛中绿脓杆菌的检出量为30cfu/g，出雏厅内空气中绿脓杆菌的检出量为15cfu/g，出雏器表面的绿脓杆菌的检出量为12cfu/g，出雏器内喷雾用水的绿脓杆菌检出量为8cfu/g，因此需要对出雏器、出雏厅和出雏器内喷雾用水消毒。对出雏厅内的空气的消毒同步骤S1中孵化厅内的空气的消毒操作；出雏器的消毒方式同步骤S1中孵化器的消毒方式；出雏器内喷雾用水的消毒同步骤S1中孵化器内喷雾用水的消毒操作。对于鸡绒毛检测不合格的时候，在后期的雏鸡培育的过程中，采用现有的药物投放方式预防雏鸡的大量感染绿脓杆菌的情况，因为雏鸡培育不属于本发明的研究内容，在此处不再赘述。
随后再选取新的出雏厅内的空气、出雏器表面拭子检测样本和出雏器内喷雾用水样本，重新检测相应样品中的绿脓杆菌的含量，结果表明绿脓杆菌在各个样品中的检出率为零。随后进入下一培育流程即可。
实施例2-7
实施例2-7与实施例1的区别在于消毒剂A的配方配比不同，具体见表3，其它同实施例1。实施例2-7中出现检测不合格的样本之后，对相应样本的消毒操作同实施例1。
表3实施例1-7的消毒剂A的配方配比
实施例8
本实施例与实施例1的区别在于：
步骤S1中消毒剂A的使用方法为：将消毒剂A喷洒至孵化厅内以及孵化器上，喷洒10min后，再熏蒸10min即可完成对孵化厅的消毒；随后将消毒剂A喷洒至种蛋和蛋托表面，喷洒10min后，再熏蒸10min即可完成对种蛋和蛋托的消毒。其它同实施例1。
实施例9
本实施例与实施例1的区别在于：
步骤S1中消毒剂A的使用方法为：将消毒剂A喷洒至孵化厅内以及孵化器上，喷洒15min后，再熏蒸15min即可完成对孵化厅的消毒；随后将消毒剂A喷洒至种蛋和蛋托表面，喷洒15min后，再熏蒸15min即可完成对种蛋和蛋托的消毒。其它同实施例1。
对比例1-8
对比例1-8与实施例1的区别在于消毒剂A的配方配比不同，具体见表4，其它同实施例1。对比例1-8中出现检测不合格的样本之后，对相应样本的消毒操作同实施例1。
表4对比例1-8的消毒剂A的配方配比
对比例9
本对比例与实施例1的区别在于，步骤S1中在消毒后只对种蛋表面进行绿脓杆菌的检测；步骤S2中不对任何样本进行绿脓杆菌的检测；步骤S3中仅对孵化器表面进行绿脓杆菌的检测。
性能检测试验
分别对实施例1-7和对比例1-8进行相关样品的绿脓杆菌的检测。
(1)表面拭子的采样和检测
对于种蛋以及孵化器表面进行取样时，均取表面拭子样品，其采样的具体操作为：在装有1mL灭菌生理盐水的试管中浸湿灭菌的棉签头，在试管内壁上挤压多余的盐水，在规板范围(5×5cm)范围内滚动棉签头涂抹取样，减去或折去棉棒的手持端且将棉签头落入生理盐水试管内，塞进试管后送于实验室检验。
表面拭子样品的检测步骤为：对每个表面拭子样品进行编号，随后向装有棉拭子的试管中加入4mL的生理盐水，反复混匀后于十六烷三甲基溴化铵培养基中加入1mL，同时设置只有棉拭子(即并未取样)的样品作为空白对照。注意：十六烷三甲基溴化铵培养基在使用前高压灭菌后置于水浴锅中冷却至45～55℃即可。
(2)孵化厅内空气的采样和检测
将灭菌后的十六烷三甲基溴化铵培养基平皿打开，置于采样点，暴露15min后盖好平皿，用纸包裹严密，标注采样部位；同时取一组未开启的平皿作为阴性对照组，随后进行培养和检测。对孵化厅内空气进行取样的过程中，采样点远离墙壁1m以上且不在空气流通处进行采样，空气流通处包括开启的加湿器、空调、暖风机、排风扇的所在处。注意在采样前，暂时关闭所有的暖风机、排风扇以及加湿器等会造成空气流动的设备，关闭5min之后再开始采集样品；十六烷三甲基溴化铵培养基平皿暴露在空气中采样的时候，尽量减少人员走动。
(3)鸡绒毛的采样和检测
采样前清洗并消毒双手并佩戴口罩，于出雏前取不少于20g的鸡绒毛样品，并编号后送检。其具体的检测过程为：称取绒毛0.2g于三角瓶中，加入生理盐水20ml，反复吹吸混匀，吸取1ml加入空平皿中。另吸取1ml样液加入9ml水中，混匀，吸取1ml加入空平皿中。随后倒入灭菌后的十六烷基三甲基溴化铵琼脂。静置冷却后倒置37℃培养24小时。
(4)用水的采样和检测
对孵化器(室)末端/出雏器(室)末端水采样：打开水阀门放水4min，随后采集水样90mL于采样瓶内，塞好采样瓶的瓶塞后，关闭水阀门即可，随后标记水样后送去检测。
水样的检测步骤为：将采样瓶内的水成分摇匀后，打开瓶塞，从每一个水瓶内取出1mL的水样分别加入十六烷三甲基溴化铵培养基平皿内，同时使用无菌水作为对照组。
实施例1-9和对比例1-8的各样品的绿脓杆菌的检测结果如表5所示。
表5实施例1-9和对比例1-8的各个检测样本的绿脓杆菌的检出量
从表5中看出，采用本发明的实施例中列举方案对孵化过程中各个样本进行检测，实施例1-9中的结果显示，各个样本中绿脓杆菌的检出量显著少于对比例中各个样本中绿脓杆菌的检出量。通过对比实施例1、实施例4-5和对比例3-4的结果看出，在消毒剂A中，当环丙沙星的质量分数为0.7％的时候，检测体系中绿脓杆菌的检出量最少；通过对比实施例1、实施例6-7和对比例5-6的结果看出，在消毒剂A中，当烯肟菌胺的质量分数为7％的时候，检测体系中绿脓杆菌的检出量最少，说明在实施例1的方案中，该方法对孵化过程的监测、净化作用最佳。
通过对比对比例7和对比例8(或者对比例4和对比例5)的结果表明：烯肟菌胺的用量变化对本发明的绿脓杆菌的检出量的影响比环丙沙星的大很多，说明在消毒剂A中，烯肟菌胺的消毒能力最佳。而结合对比例2、对比例7和对比例8的结果可以看出，消毒剂A中的成分中戊二醛、环丙沙星以及烯肟菌胺都是不可缺少的，三者共同的作用下达到一个最佳的监测、净化效果。
对比例1-2和实施例1的结果表明，虽然在对比例1中消毒剂A中的戊二醛的质量百分比增加，但是其消毒净化效果却没有显著增大，反而有消毒效果不佳的情况出现，说明消毒剂A中的各个原料之间有一定的协同作用，仅仅一直增加戊二醛的用量并不会对净化效果有较大的贡献。而对比例6中，当烯肟菌胺的含量叫高的时候，其净化效果和实施例1类似，从原料节约的角度考虑，选择实施例1中的方案为最优的方案。
通过对比例1-8和实施例1-9的步骤S2和步骤S3中的各个样品中的绿脓杆菌的检测结果看出，实施例中各个方案中所采用的消毒剂，主要是较好的抑制了孵化中以及出雏后绿脓杆菌的生长。
在对家禽进行孵化的时候，采用实施例1的方案进行孵化过程中绿脓杆菌的监测和净化，第一批的种蛋孵化结束后，对于第二批的种蛋进行孵化过程中绿脓杆菌的监测和净化时，依然采用实施例1所述的方法进行孵化过程中绿脓杆菌的监测和净化；对接下来的第三批种蛋的孵化也采用实施例1所述的方法。其结果显示，第三批的种蛋培育中，只有鸡绒毛中绿脓杆菌的检出量为15cfu/g，而其它样本的中绿脓杆菌的检出量均为零，且第三批种蛋中各个样本中，除了鸡绒毛，其它样本中的大肠杆菌、葡萄球菌、沙门氏菌和霉菌均为零检出。这说明操作本发明的监测系统3个循环次数即可实现无菌孵化过程。
分别采用上述的方式分别采用对比例2、对比例7-9的方法进行多批次的种蛋孵化，并监测孵化过程中绿脓杆菌的含量，记录首次实现无菌孵化过程的批次数，其结果如表6所示。
表6实施例1、对比例2、对比例7-9中首次实现无菌孵化的批次数
| 项目 | 实施例1 | 对比例2 | 对比例7 | 对比例8 | 对比例9 |
| 首次无菌孵化批次数 | 3 | 5 | 7 | 8 | 10 |
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (9)
1.一种系统性监测并净化孵化过程中绿脓杆菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1对入孵前的种蛋、孵化器、孵化厅、出雏器以及出雏厅使用消毒剂A进行消毒，随后分别检测种蛋表面、孵化器表面、孵化器内喷雾用水中以及孵化厅内的空气中的绿脓杆菌含量，绿脓杆菌零检出即为合格，检测合格后进入种蛋库，准备进入孵化过程；
S2种蛋孵化，并检测孵化过程中孵化厅内空气中的绿脓杆菌含量，绿脓杆菌零检出即为合格；
S3将种蛋转入出雏厅，出雏后，对鸡绒毛、出雏厅内的空气、出雏器表面和出雏器内喷雾用水进行绿脓杆菌含量的检测，绿脓杆菌零检出即为合格，检测合格后进入下一培育流程即可；
上述绿脓杆菌的监测过程中采集的样品出现不合格时，对检测不合格的种蛋、孵化器、孵化厅内的空气、出雏器和出雏厅内的空气采用消毒剂B进行消毒，对检测不合格的孵化器内喷雾用水和出雏器内喷雾用水采用消毒剂C进行消毒；
所述消毒剂A是将戊二醛、环丙沙星和烯肟菌胺加入75%乙醇溶液后形成的混合溶液，其中戊二醛的质量分数为0.97~1.21%，环氧沙星的质量分数为0.5~0.9%，烯肟菌胺的质量分数为5~9%，余量为75%乙醇溶液；将消毒剂A喷洒至待消毒的物品上10~15 min后再熏蒸10~15 min即可。
2.根据权利要求1所述的一种系统性监测并净化孵化过程中绿脓杆菌的方法，其特征在于，所述消毒剂A的制备包含以下步骤：
（1）配置得到体积分数为75%的乙醇溶液，备用；准备环丙沙星、烯肟菌胺备用；准备戊二醛溶液备用；
（2）将烯肟菌胺加入75%的乙醇溶液中后搅拌，得到均一的溶液a；
（3）分别将环丙沙星和戊二醛溶液加入溶液a中，搅拌均匀得到消毒剂A。
3.根据权利要求1所述的一种系统性监测并净化孵化过程中绿脓杆菌的方法，其特征在于，对所述种蛋表面、孵化器表面以及出雏器表面进行取样的具体操作为：在装有灭菌生理盐水的试管中浸湿灭菌的棉签头，在试管内壁上挤压多余的盐水，在5×5 cm的规板范围内滚动棉签头涂抹取样，去掉棉棒的手持端且将棉签头落入生理盐水试管内，塞进试管后送检。
4.根据权利要求1所述的一种系统性监测并净化孵化过程中绿脓杆菌的方法，其特征在于，对所述孵化厅内空气和出雏厅内空气进行取样的具体操作为：将灭菌后的平皿打开，置于采样点，暴露13~17 min后盖好平皿，标注采样部位后；同时取一组未开启的平皿作为阴性对照组，随后进行培养和检测。
5.根据权利要求4所述的一种系统性监测并净化孵化过程中绿脓杆菌的方法，其特征在于，所述采样点远离墙壁1 m以上且不在空气流通处进行采样，所述空气流通处包括开启的加湿器、空调、暖风机、排风扇的所在处。
6.根据权利要求1所述的一种系统性监测并净化孵化过程中绿脓杆菌的方法，其特征在于，所述鸡绒毛取样量不少于20 g。
7.根据权利要求1所述的一种系统性监测并净化孵化过程中绿脓杆菌的方法，其特征在于，所述孵化器内喷雾用水和出雏器内喷雾用水取样的具体操作为：打开水阀门放水3~5min，随后采集水样80~100 ml于密闭容器内，关闭阀门即可，随后水样送去检测。
8.根据权利要求1所述的一种系统性监测并净化孵化过程中绿脓杆菌的方法，其特征在于，所述消毒剂B为洗洁宝。
9.根据权利要求1所述的一种系统性监测并净化孵化过程中绿脓杆菌的方法，其特征在于，所述消毒剂C为二氯异氰尿酸钠，所述二氯异氰尿酸钠在水中的添加量为5000 mg/L。
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