CN111213786A

CN111213786A - 一种防控非洲猪瘟的水质酸化剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN111213786A
Application number: CN202010038190.1A
Authority: CN
Inventors: 李静静; 乔彦良; 张思雨; 马广斌; 李广森; 刘志亮
Original assignee: Shandong Sinder Animal Vaccine Co ltd; Shandong Xinda Gene Technology Co Ltd; Shandong Sinder Technology Co ltd
Current assignee: Shandong Sinder Animal Vaccine Co ltd; Shandong Xinda Gene Technology Co Ltd; Shandong Sinder Technology Co ltd
Priority date: 2020-01-14
Filing date: 2020-01-14
Publication date: 2020-06-02
Anticipated expiration: 2040-01-14
Also published as: CN111213786B

Abstract

本发明公开一种防控非洲猪瘟的水质酸化剂及其制备方法和应用，按质量分数计，由大分子有机酸10‑15％、小分子有机酸30‑35％、小分子有机酸盐10‑14％，螯合铜1‑3％，乳酸链球菌素4‑5％，食用菌提取物3‑5％，纯化水组成。大分子有机酸包括柠檬酸以及富马酸、乳酸、苹果酸中任一种，所述的小分子有机酸包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸中两种，小分子有机酸盐包括甲酸铵、乙酸铵、丙酸铵、丁酸钠中一种，螯合铜包括柠檬酸螯合铜、谷氨酸螯合铜中一种，食用菌提取物为香菇或木耳提取物。本发明的酸化剂具有强大的酸化能力、缓冲能力和酸化持久力，具备杀菌力强、杀菌谱广、可提升机体免疫力且用途广泛等特点，防控非洲猪瘟效果高效、快速、持久，且消毒效果不受有机物的任何影响。

Description

一种防控非洲猪瘟的水质酸化剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及酸化剂领域，尤其涉及一种防控非洲猪瘟的水质酸化剂及其制备方法和应用。

背景技术

非洲猪瘟(ASF)是一种毁灭性的疾病，是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染引起的家猪和野猪的一种急性、热性、高度接触性传染病，可导致几乎所有受感染的猪死亡。非洲猪瘟从非洲持续蔓延到欧洲，最近又蔓延到中国等生猪生产大国和东南亚国家，威胁着全球猪肉生产和粮食安全。控制传染源、切断传播途径和保护易感动物是制定传染病防控措施的基本准则，而注射疫苗又是保护易感动物最常见也是最有效的措施，然而非洲猪瘟疫苗尚未面世，其防控难度可想而知。

从生物安全手段、饲料营养及饮水安全等方面防控非洲猪瘟仍是比较关键的措施。但很多猪场在防控非瘟上投入大量人力物力，但往往忽略了水质安全，可能导致防控非瘟失败！研究显示，饮水传播非瘟的效率是饲料传播的10000倍。

《猪病学》(第10版)指出：“ASFV在pH值4.0-10的溶液中比较稳定，但在pH<4.0或pH>11.5、不含血清的培养基中会立刻失活(EFSA，2010)”。柠檬酸是全球非洲猪瘟联盟GARA-Gap推荐使用的消毒剂，也是美国农业部(USDA)认可的消毒剂，可用于联邦、州及个人的房屋内外消毒，农业运输、隔离、实验室隔离设备设施的消毒、用于靴子及个人防护设施的消毒。因此酸化剂可用于环境消毒和非洲猪瘟防控。

以上研究及应用提示，非洲猪瘟病毒在酸性条件pH值小于4的环境下立即失活。很多猪场也已经意识到酸化水质的重要性，选择柠檬酸等单一有机酸酸化水质，但是柠檬酸酸度持久性差，水质影响其酸度，进而使用柠檬酸酸化水质酸化效果差，同时投入成本高。

近年来，酸化剂作为高效、无污染、无残留的饲料添加剂，与益生素、酶制剂等并列为新型的绿色饲料添加剂，尤其是复合有机酸的应用日益普遍，但主要是在饲料和饮水中应用，在生产用水上的应用还很少，其对非洲猪瘟防控效果方面还未有人做过系统研究和应用。

因此，现有技术有待于进一步发展和进步。

发明内容

针对上述技术问题，本发明实施例提供了一种防控非洲猪瘟的水质酸化剂及其制备方法和应用，解决了防控非洲猪瘟难、不够高效、不够全方位等问题，可用于猪场环境消毒、饮用水的酸化及肠道保健、带猪消毒及其他生活用水的消毒。

本发明技术方案如下：

一种防控非洲猪瘟的水质酸化剂，其中，按质量分数计，由以下组分组成：

进一步的，所述大分子有机酸为柠檬酸、富马酸、乳酸、苹果酸中的一种。

进一步的，所述小分子有机酸由甲酸、乙酸、丙酸、丁酸中的任意两种组成。

进一步的，所述小分子有机酸盐为甲酸铵、乙酸铵、丙酸铵、丁酸钠中的一种。

进一步的，所述螯合铜为柠檬酸螯合铜或谷氨酸螯合铜。

进一步的，所述食用菌提取物为香菇或木耳提取物，所述的香菇提取物中所含的主要有效成分为香菇多糖，香菇多糖质量含量为40％，所述的木耳提取物中所含的主要有效成分为木耳多糖，木耳多糖质量含量为30％。

一种防控非洲猪瘟的水质酸化剂的制备方法，其中，包括以下步骤：

步骤1.取20％的纯化水，加热至50-55℃，然后加入食用菌提取物，搅拌溶解，制得溶液A；

步骤2.保温并向溶液A中分别加入小分子有机酸盐和螯合铜，搅拌溶解，制得溶液B；

步骤3.将溶液B冷却至室温，并依次加入小分子有机酸和大分子有机酸，搅拌溶解，制得溶液C；

步骤4.向溶液C中加入乳酸链球菌素，搅拌溶解，制得溶液D；

步骤5.将溶液D用纯化水定容至规定体积。

进一步的，防控非洲猪瘟的水质酸化剂的制备方法，其中，酸化剂原液pH范围为3.0-3.5。

进一步的，所述的防控非洲猪瘟的水质酸化剂的应用，其中，水质酸化剂在养殖环境消毒、清洁养殖饮水中的应用。

进一步的，防控非洲猪瘟的水质酸化剂的制备方法，其中，水质酸化剂按0.05％浓度喷雾消毒杀灭非洲猪瘟病毒，或者水质酸化剂按0.1％浓度直接酸化畜禽饮用水。

有益效果

本发明提供一种防控非洲猪瘟的水质酸化剂及其制备方法和应用，其有益效果如下：

(1)用途广泛，全方位防控非洲猪瘟。与其他单一用途的消毒剂或者单一用途的饲料添加剂或者单一用途的饮水型酸化剂相比，本项发明的水质酸化剂是一种复合型液体酸化剂，经试验验证，用途广泛，可用于猪场以下方面：可自由饮水、可进行猪舍表面的清洗与消毒、可进行运猪通道以及装猪台等处的快速消毒、可带猪消毒、可拌饲料、可浸泡物料、可洗澡、可洗菜、可洗衣服等，能通过生物安全、饲料营养、饮水等多个环节进行非洲猪瘟的全方位防控。

(2)防控非洲猪瘟效果高效、快速、持久。实验室研究显示：非洲猪瘟病毒在pH4-10的溶液中比较稳定，但是在pH<4或者pH>11.5，不含血清的培养基中会立刻失活。本项发明的液体酸化剂通过多种有机酸及有机酸盐的复配，制成的强缓冲能力的水质酸化剂，能够使各种生活用水或饮用水的pH值很快下降到4以下，从而可以对包括非洲猪瘟病毒在内的多数病原微生物起到直接杀灭作用，数据显示在1分钟内非洲猪瘟等囊膜病毒即可被完全灭活，同时此酸化作用能维持36h以上，可谓高效、快速、持久。另外产品中所含有的香菇或木耳提取物中富含植物多糖类物质，可以提升机体的细胞免疫功能和体液免疫功能，从而发挥抵抗非洲猪瘟病毒的效果。

(3)各成分协同作用，杀菌谱广。本产品中各成分作用机理不同，抗菌效果存在明显的差异，他们协同作用，不仅能酸化水质，杀灭非洲猪瘟病毒、伪狂犬病毒等含囊膜病毒，还能有效杀灭各种细菌、霉菌和有害酵母菌等病原微生物。研究发现，产品中的挥发性小分子有机酸具有较好的杀菌作用，直接扩散进入细胞内，通过降低胞内pH值，抑制某些大分子，如DNA、RNA、蛋白质或脂类等细胞膜的组成成分的代谢，破坏细菌细胞膜的完整性，从而达杀菌的目的。产品中的非挥发性大分子有机酸具有明显的抑菌作用，这些酸化剂可以通过降低细菌间质的pH值，破坏其渗透压体系，阻止细胞正常繁殖，从而抑制细菌的生长和繁殖。此外，产品中的挥发性有机酸盐也具有抗菌作用，这类酸盐不能降低细菌细胞间质pH值，也不能以酸的形式渗透入细菌细胞内发挥作用，其作用强弱依赖酸盐的溶解性，有机酸钠盐的溶解度大于钙盐。产品中所含的乳酸链球菌素，可抑制大多数革兰氏阳性细菌，并对芽孢杆菌的孢子有强烈的抑制作用，能够有效增强酸化剂的抑菌能力。乳酸链球菌素的抗菌作用是通过干扰细胞v膜的正常功能，造成细胞膜的渗透，养分流失和膜电位下降，从而导致致病菌和腐败菌细胞的死亡。产品所含的螯合铜成分，还能将饮水管道中顽固的霉菌除去，降低霉菌对仔猪生长的影响。而很多酸化剂中没有螯合铜成分，因为水中的有害酵母菌、霉菌在pH值3.6-4.1的区间生长繁殖不受影响，甚至生长更快，在水箱、水线管壁会形成厚厚的生物膜，影响饮水品质，因此必须添加含螯合铜成分的酸化剂才能有效抑制水中霉菌、有害酵母菌的繁殖。

(4)杀灭非洲猪瘟等囊膜病毒效果高效，不受有机物的影响。传统的戊二醛、苯扎溴铵、过硫酸氢钾等消毒剂在含有蛋白及油脂等有机物存在的情况下，对非洲猪瘟病毒、伪狂犬等囊膜病毒杀灭效果有限，而经试验验证，此酸化剂的消毒效果不受这些有机物的影响，即使在清洗不彻底的猪场，也可有效杀灭病原菌，从而起到高效防控作用。

(5)产品稳定，缓冲能力强。本产品为酸盐型复合酸化剂，具有较强的缓冲能力，即使稀释几千倍，其pH值变化也不大，可避免动物胃肠道pH值产生较大的波动。通过盐类的形式，有机酸转存为有机酸盐，避免破坏饲料中酸敏感成分，还有避免酸化剂刚进入胃肠时因浓度过高而导致pH值下降幅度过大，从而导致胃酸分泌受到抵制；另一方面，当动物经过一段时间消化后，胃肠酸化剂浓度相对降低时，有机酸盐可以通过水解方式转化成有机酸，使胃肠道内能够长时间保持一个稳定的酸性环境。如果酸化剂中没有缓冲体系，主要造成以下两个后果：一是如果错误使用添加量加多了或混合不均匀，在管线的前端终端浓度不一致，非常影响水质的适口性，引起饮水量降低，从而导致畜禽采食量不足；二是由于水的硬度不同或饲料里碱性物质的影响，如果添加量不足，pH值会迅速升高，不能抑制病原微生物的生长和繁殖，反而为其提供培养基，达不到酸化饮水的效果，为病原菌提供滋生的环境。因此，必须使用稳定缓冲体系的复合有机酸，才能在不影响畜禽适口性的条件下达到抑制病原菌繁殖的效果。

(6)无论外用还是内服，都使用安全，且不存在耐药性问题。产品中所包含的有机酸成分及其他植物提取物，作用温和，使用安全，对粘膜和皮肤等无刺激，外用接触人或猪群皮肤以及设备都没有腐蚀作用；另外内服不会改变肠道正常菌群，不会引起药性，更不会产生与其他抗生素交叉的抗性。

(7)作用全面。本产品不仅能防控非洲猪瘟，还能从内在提升猪群抗病力和抗应激能力，促进营养物质的消化和吸收，提升日粮适口性及猪群采食量，从而提升猪只收益。本产品中的香菇或木耳多糖与柠檬酸等大分子有机酸协同作用，提升机体的非特异性免疫与特异性免疫功能。本产品中多种有机酸及其酸盐以及乳酸链球菌素协同作用，一方面通过酸化水质，抑制饮水或生活用水中致病菌的生长，另一方面可降低肠道pH值，促进营养成分消化吸收，增加饲料转化率，提高日增重；还能调节胃肠道菌群平衡，促进有益菌的增殖；而且还能抑制有害类物质生物胺的生成，从而减少有毒物质对机体的损伤。

附图说明

图1是本发明具体实施例中香菇提取物提取工艺流程图；

图2是本发明具体实施例中木耳提取物提取工艺流程图；

图3是本发明具体实施例8中1#样品对大肠杆菌最低抑菌浓度图；

图4是本发明具体实施例8中2#样品对大肠杆菌最低抑菌浓度图；

图5是本发明具体实施例8中3#样品对大肠杆菌最低抑菌浓度图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是用于限制本发明。本说明书所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。

进一步的，所述螯合铜为柠檬酸螯合铜或谷氨酸螯合铜。

优选的，所述食用菌提取物为香菇或木耳提取物，所述的香菇提取物中所含的主要有效成分为香菇多糖，香菇多糖质量含量为40％，所述的木耳提取物中所含的主要有效成分为木耳多糖，木耳多糖质量含量为30％。

进一步的，所述香菇提取物提取工艺流程图如图1所示，香菇经挑选后用粉碎机粉碎(过20目筛)，提取罐加入粉碎的香菇，提取罐加入香菇投料量15倍的水，开启搅拌，加热至95℃±1℃提取1小时，离心除去香菇渣；提取罐加入香菇投料量15倍的水，开启搅拌，加入离心出的香菇渣，加热至95℃±1℃提取1小时，离心除去香菇渣；共提取2遍，香菇渣弃掉。合并提取液，进行第二次离心除去细小杂质，离心清液浓缩，剩余浓缩液转入配料罐，开启搅拌，加入甘露醇搅拌溶解。溶解后经管道转入烘干缓冲罐，经真空低温液体连续干燥机系统烘干和粉碎得香菇提取物。将烘干粉碎的的香菇提取物分装，检查封口是否密封，装桶，进入待检工序，检验合格后入库。其中，香菇提取物的烘干、分装、封口工序在十万级净化车间内完成。所述香菇提取物中除含有40％香菇多糖外，还富含甾体类、多酚类、脂肪酸类及多种维生素及矿物质等营养物质，其中甾体类含量为0.35％、多酚类含量为0.54％、亚油酸含量为0.42％、棕榈酸含量为0.14％、维生素B1含量为0.25％、维生素B2含量为0.17％。

进一步的，所述木耳提取物提取工艺流程图如图2所示，所述木耳经挑选后用粉碎机粉碎(过20目筛)，提取罐加入粉碎的木耳，提取罐加入木耳投料量15倍的水，开启搅拌，加热至95℃±1℃提取1.5小时，离心除去木耳渣；提取罐加入木耳投料量15倍的水，开启搅拌，加入离心出的木耳渣，加热至95℃±1℃提取1.5小时，离心除去木耳渣；共提取2遍，木耳渣弃掉。合并提取液，进行第二次离心除去细小杂质，离心清液浓缩，剩余浓缩液转入配料罐，开启搅拌，加入甘露醇搅拌溶解。溶解后经管道转入烘干缓冲罐，经真空低温液体连续干燥机系统烘干和粉碎得木耳提取物。将烘干粉碎的的木耳提取物分装，检查封口是否密封，装桶，进入待检工序，检验合格后入库。其中，木耳提取物的烘干、分装、封口工序在十万级净化车间内完成。所述木耳提取物中除含有30％木耳多糖外，还富含碳水化合物、胶质、脑磷脂、纤维素、葡萄糖、木糖、卵磷脂、胡萝卜素、维生素B1、维生素B2、维生素C、蛋白质、铁、钙、磷等多种营养成分。其中胡萝卜素含量为0.55％、维生素C含量为0.64％、卵磷脂含量为0.32％、脑磷脂含量为0.44％、维生素B1含量为0.32％、维生素B2含量为0.23％。

步骤4.向溶液C中加入乳酸链球菌素，搅拌溶解，制得溶液D；

步骤5.将溶液D用纯化水定容至规定体积。

进一步的，所述水质酸化剂有强大的酸化能力、缓冲能力及酸化持久力，酸化剂原液pH范围为3.0--3.5，将原液进行0.04％-0.5％浓度稀释后，pH值仍在4.0以下。另外其酸化持久力较强，0.05％-0.1％浓度酸化生产用水后36h，pH值仍维持在4以下。进一步的，水质酸化剂在养殖环境消毒、清洁养殖饮水中的应用。

进一步的，本发明提出的水质酸化剂应用范围广泛，既可酸化水质进行喷雾消毒，其中水质酸化剂按0.05％浓度杀灭非洲猪瘟病毒，也可直接酸化饮用水直接饮用，其中水质酸化剂按0.1％浓度直接酸化畜禽饮用水，饮水使用不仅可预防非洲猪瘟病毒，还能提升猪群整体免疫力及消化功能，从而提升生产收益。

本发明提出的水质酸化剂是以大分子有机酸、小分子有机酸、小分子有机酸盐、螯合铜、乳酸链球菌素、食用菌提取物等为主要成分，所述食用菌为香菇或者木耳，经过科学组方复配及特殊的缓冲工艺制备而成的一种稳定、高效、安全、缓冲能力强、适口性好、用途广泛的酸化剂。

实施例1

一种防治非洲猪瘟的水质酸化剂及其制备方法和应用，含有的组分及各自的质量分数分别为：

其制备方法，包括以下步骤：

(1)取20％的纯化水，加热至50℃，然后加入香菇提取物，搅拌溶解，制得溶液A；

(2)保温并向溶液A中分别加入甲酸铵和柠檬酸螯合铜，搅拌溶解，制得溶液B；

(3)将溶液B冷却至室温，并依次加入柠檬酸、乳酸、甲酸、乙酸，搅拌溶解，制得溶液C；

(4)向溶液C中加入乳酸链球菌素，搅拌溶解，制得溶液D；

(5)最后，用纯化水定容至规定体积。

实施例2

其制备方法，包括以下步骤：

(1)取20％的纯化水，加热至55℃，然后加入木耳提取物，搅拌溶解，制得溶液A；

(2)保温并向溶液A中分别加入乙酸铵和谷氨酸螯合铜，搅拌溶解，制得溶液B；

(3)将溶液B冷却至室温，并依次加入柠檬酸、苹果酸、甲酸、乙酸，搅拌溶解，制得溶液C；

(4)向溶液C中加入乳酸链球菌素，搅拌溶解，制得溶液D；

(5)最后，用纯化水定容至规定体积。

实施例3

其制备方法，包括以下步骤：

(2)保温并向溶液A中分别加入丙酸铵和柠檬酸螯合铜，搅拌溶解，制得溶液B；

(3)将溶液B冷却至室温，并依次加入柠檬酸、富马酸、乙酸、丙酸，搅拌溶解，制得溶液C；

(4)向溶液C中加入乳酸链球菌素，搅拌溶解，制得溶液D；

(5)最后，用纯化水定容至规定体积。

实施例4

其制备方法，包括以下步骤：

(2)保温并向溶液A中分别加入丁酸钠和柠檬酸螯合铜，搅拌溶解，制得溶液B；

(3)将溶液B冷却至室温，并依次加入柠檬酸、富马酸、乙酸、丁酸，搅拌溶解，制得溶液C；

(4)向溶液C中加入乳酸链球菌素，搅拌溶解，制得溶液D；

(5)最后，用纯化水定容至规定体积。

实施例5：酸化力测定试验

1)试验试剂和材料：

稀释用水采用某猪场地下水；上述实施例配方1-4的液体酸化剂，由山东信得科技股份有限公司配制；竞品A为国内竞品、竞品B为国外竞品，竞品A与竞品B均购自市场。

2)试验方法：

将各实施例的酸化剂按不同浓度(0.02％-0.5％)稀释后，用pH计测定pH值，并与国内外市场竞品进行比较不同配方酸化剂在不同稀释比例下pH值。

3)试验结果：

不同实施例配方酸化剂稀释不同比例对饮水pH值的影响如表1所示。

结果表明，当按照0.04％浓度稀释酸化剂时，实施例1-4的酸化剂pH值已低于4，且按照0.04和0.5％浓度稀释酸化剂时，实施例1-4中同一酸化剂pH值差异仅为0.5-0.6，优于国内同类竞品A及国外同类竞品B的酸化能力和缓冲能力，表明本发明设计实施的酸化剂具有强大的酸化和缓冲能力。

表1.不同实施例配方酸化剂稀释不同比例对饮水pH值的影响

4)试验结论：

基于上述实验数据和实际生产中水质差异，水质酸化剂的优选浓度为0.05％-0.1％。

实施例6：酸化持久力的测定试验

1)试验试剂和材料：

以实施例1为例测试酸化持久力。采用的试验试剂及材料为稀释用水采用某猪场地下水、实施例1配方的酸化剂，由山东信得科技股份有限公司配制。

2)试验方法：

将实施例1配方的酸化剂按不同浓度(0.05％、0.1％、0.3％)稀释后，用pH计测定pH值。

3)试验结果：

不同浓度的实施例1酸化试剂在不同浓度及不同放置时间下的pH值变化情况如下表2所示。

表2.实施例1配方的酸化剂不同浓度放置不同时间pH值变化情况

	初始时间	6小时	18小时	24小时	36小时
						0.05％	3.71	3.74	3.82	3.84	3.84
0.1％	3.40	3.46	3.50	3.55	3.58
						0.3％	3.25	3.28	3.28	3.32	3.35
实施例1原液	3.18	3.21	3.20	3.24	3.25

结果表明，将实施例1配方分别按照0.05％、0.1％、0.3％浓度稀释，放置36小时，pH值均在4以下，且放置相同时间时不同浓度稀释后酸化剂pH值波动小，表明本发明设计实施的酸化剂具有较强的缓冲力和持久力。

4)试验结论：

上述数据显示，此酸化剂按照0.05％-0.1％浓度稀释酸化生产用水后放置36小时，pH值仍维持在4以下，说明此酸化剂持久力较强。

实施例7：液体酸化剂杀灭病原最短时间的验证试验

试验背景：在《猪病学》第十版中有如下介绍“ASFV在pH4～10的溶液中比较稳定，但是在pH<4或者pH>11.5，不含血清的培养基中会立刻失活(EFSA，2010)”，为探究酸制剂杀灭病原的最短时间，设计了如下实验。因ASFV还没有标准毒株，而伪狂犬病毒与ASFV都属于有囊膜病毒，所以实验室研究用伪狂犬病毒来替代ASFV。

试验一：液体酸化剂杀灭伪狂犬病毒最短时间的验证试验

1)试验试剂和材料：

(1)病毒：伪狂犬病毒毒株(PRV-JL株)，其微生物保藏编号是：CGMCC No.9903。

(2)实施例1配方的酸化剂，由山东信得科技股份有限公司配制；对照品为复方戊二醛溶液和过硫酸氢钾复合物粉，均由山东信得科技股份有限公司制备。

2)试验方法：

将病毒与固定比例的消毒剂感作→分别感作1min、5min、15min、25min→加入针对消毒剂的中和剂终止消毒反应→按测定毒价的方法倍比稀释，将上述反应混合物接种细胞→观察细胞病变，与阳性对照比较毒价的变化。

结果判定：以消杀后的混合物TCID₅₀为0时(表明没有具有感染性的病毒)，判定为消毒剂可完全有效灭活病原。

3)试验结果：

各消毒剂对伪狂犬病毒杀灭效果验证试验结果如表3所示。

表3.各消毒剂对伪狂犬病毒杀灭效果验证试验结果

注：TCID₅₀为半数组织培养感染剂量。

试验二：液体酸化剂杀灭细菌最短时间的验证试验

上述实验证明有机酸可以快速杀灭囊膜，下面设计试验验证杀灭细菌的能力。

1)试验试剂和材料：

(1)细菌：耐药大肠杆菌、副猪嗜血杆菌、多杀性沙门氏菌均为从三个不同猪场临床分离所获得的菌株。

(2)实施例1配方的酸化剂，由山东信得科技股份有限公司配制；对照品(复方戊二醛溶液和过硫酸氢钾复合物粉)均由山东信得科技股份有限公司制备。

2)试验方法：

将菌液加入到不同稀释比例的酸化剂中→使菌液与酸化剂分别作用5min、1h、6h→加入中和剂(pH＝10.0，NaOH)→调节pH至7.0→取混合液涂板→24h后观察结果。

3)试验结果：

不同浓度酸化剂及酸化剂对菌液不同作用时间条件下对细菌的杀灭效果试验结果如表4-6所示。

4)试验结果：

见表4-6，结果显示浓度为0.2％的酸化剂在5min内即可完全杀灭耐药大肠杆菌；浓度为0.3％的酸化剂在5min内即可杀灭副猪嗜血杆菌和多杀性巴氏杆菌，证明此实施例酸化剂不仅对病毒有很好的灭活效果，对细菌也可以快速杀灭。

表4.酸化剂不同浓度和不同作用时间对耐药大肠杆菌的杀灭效果验证试验

	5min	1h	6h
				0.1％	-	+	+
0.2％	+	+	+
				0.3％	+	+	+

注：完全杀灭用“+”表示，不完全杀灭或无杀灭效果用“-”表示。

表5.酸化剂不同浓度和不同作用时间对副猪嗜血杆菌的杀灭效果验证试验

	5min	1h	6h
				0.1％	-	+	+
0.2％	-	+	+
				0.3％	+	+	+

表6.酸化剂不同浓度和不同作用时间对多杀性沙门氏菌的杀灭效果验证试验

	5min	1h	6h
				0.1％	-	+	+
0.2％	-	+	+
				0.3％	+	+	+

实施例8：液体酸化剂最小抑菌浓度的验证试验

1)试验目的：

测定三个酸化剂样品的最低抑菌浓度(MIC)，其中编号1样品为实施例1配方的酸化剂，编号2样品为实施例2配方的酸化剂，编号样品3为实施例3配方的酸化剂。

2)试验试剂和材料：

实验仪器、用具：灭菌锅，超净工作台，恒温培养箱，移液器及吸头，三角烧瓶，4ml离心管，玻璃试管，试管架

实验用试剂：试验样品4种、牛肉粉、蛋白胨、氯化钠、葡萄糖、0.048mol/L的氯化钡溶液、0.18mol/L硫酸溶液、大肠杆菌，生理盐水。

3)试验方法：

(1)营养肉汤的制备：蛋白胨10g、牛肉粉3g、氯化钠5g、葡萄糖1g混合，用纯化水加至1000ml。121℃15分钟灭菌备用。

(2)无菌试管：具塞试管(10*100mm)121℃15分钟灭菌备用。

(3)0.5麦氏比浊标准液制备：0.048mol/L的氯化钡溶液0.5ml加入到99.5ml0.18mol/L的硫酸溶液中不断搅拌使成混悬液。

(4)样品原液制备：直接使用提供样品溶液。

(5)接种物的制备：用大肠杆菌直接取培养的菌落调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。用营养肉汤将上述菌悬液进行1∶100稀释后备用。注意应在15分钟内接种完配制好的接种物，并取一份接种物在非选择性琼脂平板上传代培养，以检查接种物纯度。

(6)样品的稀释和菌种的接种：取无菌试管(10×100mm)，分成3组(每个菌作为一组进行标注)，每组15支试管分别编号1-15。将样品分别再用营养肉汤进行2倍系列稀释，稀释完毕，最终使各组1-15号管中分别剩余1ml样品稀释液。另取2ml营养肉汤加入另两根试管中作为不含药物的生长对照。

1#-3#样品7-15号管的药物浓度分别是：2⁶、2⁷、2⁸、2⁹、2¹⁰、2¹¹、2¹²、2¹³、2¹⁴。

三组样品的7-15号管分别加入1ml菌液后各样品管最终药物浓度为：2⁷、2⁸、2⁹、2¹⁰、2¹¹、2¹²、2¹³、2¹⁴、2¹⁵。

(7)孵育：将上述试管置于37℃恒温箱中培养过夜。

(8)观察结果：各样品大肠杆菌抑菌浓度图片如图3-5所示，肉眼观察三组样品试管内菌液状态，结果显示7-15号试管内菌液由清晰逐渐模糊，表明随着试管内药物浓度的增加，各样品大肠杆菌抑菌浓度逐渐增加，1#-3#样品内试管颜色分别与对照管比较均为7-10号管清晰。

(9)结论：1#-3#样品的最小抑菌浓度均为2¹⁰。

实施例9：有机物对液体酸化剂消毒效果的干扰验证试验

试验背景：《猪病学》第十版中表述“非洲猪瘟病毒能在5℃(41℉)的血清中存活6年，在pH13.4(强碱)含25％的血清培养基中能存活一周”，为验证有机物对囊膜病毒的消毒效果的是否有干扰，特设计了如下实验。因ASFV还没有标准毒株，而伪狂犬病毒与ASFV都属于有囊膜病毒，所以实验室研究用伪狂犬病毒来替代ASFV。

试验一：细胞模型试验

1)试验试剂和材料：

(2)干扰物选择：植物油(终浓度占比20％)；牛奶(终浓度占比20％)。

(3)实施例1配方的酸化剂，由山东信得科技股份有限公司配制；复方戊二醛溶液和过硫酸氢钾复合物粉均由山东信得科技股份有限公司制备。

2)细胞模型的试验方法：

病毒先与干扰物混合(让干扰物包裹病毒)→以适当浓度稀释的消毒剂与病毒液感作30min→按测定毒价的方法倍比稀释，接种细胞→观察细胞病变，与阳性对照比较毒价的差异→通过PCR确认结果。不同有机物对多种消毒剂消毒效果影响的细胞试验结果如表7所示。

3)试验结果：

(1)牛奶对5％戊二醛+5％癸甲溴铵(1:500)和10％戊二醛+10％苯扎溴铵(1:1000)的杀灭伪狂犬病毒的能力有严重的干扰，导致绝大多数的伪狂犬病毒没有被灭活。

(2)油脂对复方戊二醛有一定的干扰，部分病毒没有被灭活，但比受到牛奶等蛋白质的影响小。

(3)牛奶对过硫酸氢钾复合物粉(1：800)的消毒效果有一定的影响，但过硫酸氢钾复合物粉不受植物油的干扰，表明过硫酸氢钾复合物粉的使用效果会受到一定条件的制约。

表7.不同有机物对多种消毒剂消毒效果影响的细胞试验结果

此液体酸化剂实施例1在牛奶和植物油存在下对伪狂犬病毒的杀灭能力都没有影响，说明在有机物存在下液体酸化剂的消毒效果不受影响，使用可靠性最佳。

试验二：小鼠模型试验

1)试验试剂和材料：

(2)小鼠：选用无特定病原体(SPF)级别的Bable/c小鼠。

(3)干扰物选择：植物油(终浓度占比20％)，牛奶(终浓度占比20％)，血清(终浓度占比20％)。

实施例1配方的酸化剂，由山东信得科技股份有限公司配制；复方戊二醛溶液和过硫酸氢钾复合物粉均由山东信得科技股份有限公司制备。

2)试验方法：

100LD₅₀的PRV病毒先与干扰物混合(让干扰物包裹病毒)→以适当浓度稀释的消毒剂与病毒液感作30min→接种小鼠→饲养七天后观察死亡率，每组10只小鼠。

3)试验结果：

不同有机物不同有机物对多种消毒剂消毒效果影响的动物试验结果见表8.

4)结果显示：

(1)此液体酸化剂实施例1不受牛奶、血清和植物油(油脂)的干扰，可以完全杀灭病毒，小鼠均没有死亡。

(2)复方戊二醛受牛奶和血清干扰很大，大部分小鼠接种后死亡，表明未有效灭活病毒。油脂对复方戊二醛在小鼠上显示没有影响(在细胞模型上病毒的杀灭率尽管有一定效果，但未完全杀灭，有可能是杀灭后的病毒没有达到小鼠的最小致死剂量)；

(3)过硫酸氢钾复合物粉也受到牛奶和血清的严重干扰，导致接种后小鼠死亡。

5)试验总结及讨论：

(1)液体酸化剂在实验中表现出的不受有机物干扰的特性，表明其有更广阔的应用潜力，特别是在未能进行充分清洗的环境中，应用有机酸进行消毒将更为可靠。

(2)液体酸化剂可更有效快速接触病原作用机理是溶液中有大量的有机酸是不完全解离的，这些酸具有羧基端，具有亲脂性，羟基与生物膜相似相溶，渗透能力强，突破病原体的生物膜后这些有机酸能释放H+并水解核酸或蛋白质，快速杀灭病原。

表8.不同有机物对多种消毒剂消毒效果影响的动物试验结果

实施例10：液体酸化剂对感染过非洲猪瘟猪场的临床消毒效果测定试验

1)试验背景：

河北某种猪场存栏500头母猪，于2018年12月陆续发病，主要表现为高热、不食、身体出现紫色斑块，并伴有便血症状，死后口鼻流血。经确诊后，进行全场扑杀，至今已空舍4-6月，计划洗消后复养。

2)试验试剂和材料：

(1)非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒：由信得科技提供，已经中国动物疫病预防控制中心批准使用【疫控(诊)(2019)74号】。判定标准：Ct值≤35且扩增曲线为典型的S型曲线，则判定为ASFV核酸阳性；35＜Ct≤40，断定可疑。应复检一次，如复检无Ct值，报告为ASFV核酸阴性，反之为阳性；无Ct值或无典型的S型扩增曲线，同时HEX通道Ct值≤35，判定为阴性。

(2)实施例1配方的酸化剂，由山东信得科技股份有限公司配制。

3)试验方法：

(1)试验分组与清洗方法

试验分两组：酸化剂组，毛刷洗刷，清水冲洗后，将酸化剂1:1000稀释，终浓度为0.1％，采用背负式喷雾器均匀喷洒，每平米约喷洒200-300mL，作用2h。空白对照组，毛刷洗刷，清水冲洗后不使用消毒剂。

(2)采样与检测方法

固定采样地点，分别于清洗前和冲洗后，用四根棉签蘸取无菌生理盐水，随机擦抹栏杆、食槽、地面和粪道，采集样品，用于非洲猪瘟病毒的实时荧光PCR检测。

4)试验结果：

(1)酸化剂组

采用非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒评估酸化剂效果，酸化剂对不同消毒地点的消毒效果影响如表9所示，0.1％的酸化剂喷洒作用2h后，栏杆、地面、粪道、食槽3个采样点均未检测到非洲猪瘟病毒核酸，初步证明了0.1％实施例1配方的酸化剂可有效降低非洲猪瘟病毒核酸载量。

(2)空白对照组

根据非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒的判定标准，5个采样点的待检样品Ct值均≤35，且扩增曲线为典型的S型曲线，提示该猪场空栏4-6个月，认为阳性场，同时也证明，仅用清水洗刷，不能去除圈舍内非洲猪瘟病毒。对照组对照组对不同消毒地点的消毒效果影响结果见表10。

5)试验结论

此酸化剂作为环境消毒来用可有效防控非洲猪瘟的再次发生，即使在未冲洗含大量粪便等有机物的情况下，依然表现出强大的杀灭非洲猪瘟病毒的作用。

表9.酸化剂对不同消毒地点的消毒效果影响

注：Ct值为每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。

表10.对照组对不同消毒地点的消毒效果影响

实施例11：液体酸化剂的腐蚀性测试试验

1)试验目的：

将金属试片(45号钢、Z30铸铁、H62黄铜、LY12硬铝)浸入规定温度的酸化剂水溶液中，经规定的时间后，以金属试片的外观变化和腐蚀量来评定实施例1～实施例4各酸化剂配方以及其他三种消毒剂(5％戊二醛+5％癸甲溴铵、10％戊二醛+10％癸甲溴铵、过硫酸氢钾溶液10％)对金属的腐蚀性。

2)试验试剂：

丙酮(GB 686，化学纯)、无水乙醇(GB 678，化学纯)。

3)试验仪器：

分析天平(感量0.1mg)、恒温水浴槽(能控温于80±2℃)、恒温干燥箱，搪瓷药物缸(D90mm×90mm，带盖)、缸口横梁(用D2mm不锈钢条弯成——)、S形挂钩(用细的不锈钢弯成S形)、温度计(0～100℃，分度1℃)、秒表、试片架。

4)试验方法：

(1)试验程序

将实施例1～实施例4的酸化剂原液及其他三种消毒剂原液用蒸馏水或去离子水(新煮沸冷却过的)按3％(m/m)浓度配制，并将盛有400ml此试液的药物缸放入恒温水浴锅里，使试液恒温在80±2℃。将按规定准备好的试片(连试片架)置于40±2℃烘箱中干燥30min，冷却，称量。然后吊挂于横放在药物缸口的横梁上，并让试片全浸在试液中(下不触底上不露面)。在每个药物缸中，只放2片相同材质的试片，经2h后，取出试片。用新煮沸后冷却的蒸馏水漂洗(摆洗10次)，在丙酮或无水乙醇中脱水和热风吹干，检查外观。

再将试片(连试片架)置于40±2℃烘箱中干燥30min，于干燥器中冷却，称量。

试片腐蚀量X2以其质量变化的毫克数表示，按式(1)计算。

X2＝〔(m₁－m₂)×1000……………………(1)

式中：m_1------试片腐蚀试验前的质量，g；

m₂------试片腐蚀试验后的质量，g。

(2)试验评定结果(金属腐蚀外观的评级标准)

腐蚀试验后的试片表面，按以下标准评定等级。

a.钢和铸铁：

0级表面无锈，无明显变化；

1级表面无锈，轻微变色或失光；

2级表面轻锈或不均匀变色；

3级表面大面积锈蚀。

b.铜和铝：

0级表面无明显变化；

1级表面轻微变色或失光；

2级表面不均匀变色、失光，局部有斑点；

3级表面严重变色或腐蚀。

表11.不同实施例配方的腐蚀性测试后各金属外观变化和腐蚀量

5)试验结果：

不同实施例配方的腐蚀性测试后各金属外观变化和腐蚀量见表11。

由表11可见，实施例1～实施例4对45号钢、Z30铸铁、H62黄铜、LY12硬铝的腐蚀外观变化均为0级，腐蚀量也均为0，说明此酸化剂无任何腐蚀性；而戊二醛、癸甲溴铵、过硫酸氢钾等几种消毒剂对45号钢、Z30铸铁、H62黄铜、LY12硬铝等都有不同程度的腐蚀。

实施例12：液体酸化剂饮水使用或带猪消毒对非洲猪瘟防控效果的临床验证试验

1)试验背景：

山东某育肥猪场存栏300头育肥猪，还有两个月就要出栏了，然而周围附近几个猪场纷纷检测出非洲猪瘟病毒阳性，为避免此猪场发生疫情，现计划对此猪场全场使用此酸化剂饮水，同时进行带猪消毒，以验证其防控非洲猪瘟的效果。

2)试验试剂和材料：

实施例1配方的酸化剂，由山东信得科技股份有限公司配制。

3)试验方法：

猪场所有猪群饮水添加上述酸化剂，按照0.1％添加，饮用两个月直至出栏，同时每周带猪消毒一次(酸化剂按照0.05％浓度)。

4)试验结果：

(1)通过为期两个月的酸化剂饮水和带猪消毒两个途径的防控，此猪场未发生疫情，安全出栏。

(2)除了以上对非洲猪瘟的防控效果，此酸化剂还能提升猪群采食量，经过与以往几批猪群相比，料肉比和日增重两个指标也有显著提升，具体见表12。

5)试验结论：

对于防控非洲猪瘟来说，此酸化剂用途广泛且效果全面，既可对猪场消毒，也可带猪消毒和饮水使用，都能起到理想的防控效果，另外还能提升猪群的生产指标，提升猪只收益。

表12.使用酸化剂的育肥猪群对其生产指标的影响

	猪群头数	日增重(kg/头)	料肉比
				使用酸化剂的猪群	314	1.07	2.63
未使用酸化剂的猪群1	358	1.02	2.75
				未使用酸化剂的猪群2	287	1.03	2.84
未使用酸化剂的猪群3	256	1.00	2.73

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims

1.一种防控非洲猪瘟的水质酸化剂，其特征在于，按质量分数计，由以下组分组成：

其余为纯化水。

2.根据权利要求1所述的防控非洲猪瘟的水质酸化剂，其特征在于，所述大分子有机酸为柠檬酸、富马酸、乳酸、苹果酸中的一种。

3.根据权利要求1所述的防控非洲猪瘟的水质酸化剂，其特征在于，所述小分子有机酸由甲酸、乙酸、丙酸、丁酸中的任意两种组成。

4.根据权利要求1所述的防控非洲猪瘟的水质酸化剂，其特征在于，所述小分子有机酸盐为甲酸铵、乙酸铵、丙酸铵、丁酸钠中的一种。

5.根据权利要求1所述的防控非洲猪瘟的水质酸化剂，其特征在于，所述螯合铜为柠檬酸螯合铜或谷氨酸螯合铜。

6.根据权利要求1所述的防控非洲猪瘟的水质酸化剂，其特征在于，所述食用菌提取物为香菇或木耳提取物，所述的香菇提取物中所含的主要有效成分为香菇多糖，香菇多糖质量含量为40％，所述的木耳提取物中所含的主要有效成分为木耳多糖，木耳多糖质量含量为30％。

7.一种如权利要求1-6任一项所述的防控非洲猪瘟的水质酸化剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤4.向溶液C中加入乳酸链球菌素，搅拌溶解，制得溶液D；

步骤5.将溶液D用纯化水定容至规定体积。

8.根据权利要求7所述的防控非洲猪瘟的水质酸化剂的制备方法，其特征在于，酸化剂原液pH范围为3.0-3.5。

9.一种如权利要求1-6任一项所述的防控非洲猪瘟的水质酸化剂的应用，其特征在于，水质酸化剂在养殖环境消毒、清洁养殖饮水中的应用。

10.根据权利要求9所述的防控非洲猪瘟的水质酸化剂的制备方法，其特征在于，水质酸化剂按0.05％浓度喷雾消毒杀灭非洲猪瘟病毒，或者水质酸化剂按0.1％浓度直接酸化畜禽饮用水。