CN111386127A - 核酸结合光探针和其用途 - Google Patents

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珍妮弗·C·彼得
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多诺万·诺埃尔·金
超·方
赫舍尔·幕克吉
尼尔·库比查
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Abstract

本发明涉及用于确定结合位点以及关于RNA转录物的其它结构信息的光激活化合物和其使用方法。本发明还提供识别结合化合物并且因此可药化的RNA转录物的方法、筛选药物候选物的方法和确定靶RNA上的药物结合位点和/或可接近或反应性位点的方法。

Description

核酸结合光探针和其用途
技术领域
本发明是关于光激活化合物和使用其来识别结合此类化合物并且因此可药化的RNA转录物的方法、筛选药物候选物的方法和确定靶RNA上的药物结合位点和/或一或多个反应性位点的方法。本发明还提供调节RNA转录物的生物学以治疗各种疾病和病状的方法。
相关申请案的交叉参考
本申请案根据35U.S.C.§119(e)要求2017年11月30日提交的美国临时专利申请第62/593,175号的权益，所述申请案的全部内容特此以引用的方式并入。
序列表
本申请案含有序列表，所述序列表以ASCII格式以电子方式提交，并且特此以全文引用的方式并入。2018年11月30日创建的所述ASCII复本命名为394457_003WO_163991_SL_ST25.TXT并且大小为46,324个字节。
背景技术
核糖核酸(RNA)常规地被视为仅基因与蛋白质之间的瞬态媒介，由此脱氧核糖核酸(DNA)的蛋白质编码部分转录成RNA，所述RNA随后被翻译成蛋白质。RNA被认为缺乏限定的三级结构，并且即使在三级结构存在时，其也被认为基本上与RNA的作为瞬态信使的功能无关。这种理解受到如下认知的挑战：RNA(包含非编码RNA(ncRNA))在细胞中起着众多关键调节作用，并且RNA可以具有复杂的、限定的并且功能化必需的三级结构。
所有内源性哺乳动物疾病最终都由转录物组介导。就信使mRNA(mRNA)是转录物组的一部分并且所有蛋白质表达都源自mRNA而言，有可能通过调节相关蛋白质的表达和通过转而调节相应上游mRNA的翻译来干预蛋白质介导的疾病。但mRNA仅是转录物组的一小部分：其它转录的RNA也直接通过RNA结构(例如，核糖核蛋白)的结构和功能以及通过蛋白质表达和作用来调节细胞生物学，包含但不限于：miRNA、lncRNA、lincRNA、snoRNA、snRNA、scaRNA、piRNA、ceRNA和假基因。在此水平下进行干预的药物具有调节任何和所有的细胞过程的潜力。在大多数情况下，如反义RNA或siRNA的现有治疗模态尚未克服如药物递送、吸收、到靶器官的分布、药代动力学和细胞渗透的重大挑战。相比之下，小分子长期以来成功地越过这些屏障，并且使其适用作药物的这些品质易于通过一系列类似物优化以克服此类挑战。鲜明对比之下，一般不存在针对结合到在细胞内部少得多的RNA靶点筛选小分子的经验证的通用方法。应用小分子作为产生治疗效益的RNA配体几乎没有得到药物发现团体的关注。
用小分子调节剂靶向RNA转录物组代表治疗多种RNA介导的疾病的未被开发的治疗方法。因此，仍需要开发可以用作治疗剂的小分子RNA调节剂。
附图说明
图1展示了具有系链基团的连接点的茶碱配体的结构。
图2展示了具有系链基团的连接点的四环素配体的结构。
图3展示了具有系链基团的连接点的三蝶烯配体的结构。
图4展示了具有系链基团的连接点的三蝶烯配体的结构。X＝CH、N或C-OH；Y＝CH或N；R1、R2、R3＝各自独立地选自卤基、-OH、-OMe、-NH2、-NH-(任选地经取代的C1-10脂族基)、任选地经取代的C1-10脂族基或其它所描述的系链基团。修饰部分可一连接到R1、R2或R3上的任何位置处或以上结构上的其它官能团处。
图5展示了具有系链基团的连接点的蒽-马来酰亚胺狄尔斯-阿尔德(Diels-Alder)加合物配体的结构。注意：还可以制备具有相反立体化学定向的丁二酰亚胺基的对应结构。每个R独立地选自卤基、-OH、-OMe、-NH2、-NH-(任选地经取代的C1-10脂族基)、任选地经取代的C1-10脂族基或其它所描述的系链基团。修饰部分可以连接到R上的任何位置处或以上结构上的其它官能团处。
图6展示了具有系链基团的连接点的瑞博希(ribocil)配体的结构。
图7展示了具有系链基团的连接点的SMN2配体的结构。
图8展示了具有系链基团的连接点的利奈唑胺(linezolid)和特地唑胺(tedizolid)配体的结构。
图9展示示例性点击就绪基团的结构。
图10展示了用于键联RNA配体与修饰部分的示例性系链基团。
图11展示了系链基团的其它实例。
图12展示了系链基团的其它实例。
图13展示了系链基团的其它实例。
图14展示了系链基团的其它实例。
图15展示了系链基团的其它实例。
图16展示了系链基团的其它实例。
图17展示了系链基团的其它实例。
图18展示了获取包含系链基团的连接点的数种茶碱小分子配体的反应流程。
图19展示了用于获取包含系链基团的连接点的数种茶碱小分子配体的反应流程。
图20展示了用于获取包含系链基团的连接点的数种茶碱小分子配体的反应流程。
图21展示了用于获取包含系链基团的连接点的数种茶碱小分子配体的反应流程。
图22展示了用于获取包含系链基团的连接点的数种四环素小分子配体的反应流程。
图23展示了用于获取包含系链基团的连接点的数种四环素小分子配体的反应流程。
图24展示了用于获取包含系链基团的连接点的数种四环素小分子配体的反应流程。
图25展示了用于获取包含系链基团的连接点的数种四环素小分子配体的反应流程。
图26展示了用于获取包含系链基团的连接点的数种三蝶烯小分子配体的反应流程。
图27展示了用于获取包含系链基团的连接点的数种三蝶烯小分子配体的反应流程。
图28展示了用于获取包含系链基团的连接点的数种三蝶烯小分子配体的反应流程。
图29展示了用于获取包含系链基团的连接点的数种三蝶烯小分子配体的反应流程。
图30展示了用于获取包含系链基团的连接点的数种三蝶烯小分子配体的反应流程。
图31展示了用于获取包含系链基团的连接点的数种三蝶烯小分子配体的反应流程。
图32展示了用于获取包含系链基团的连接点的数种三蝶烯小分子配体的反应流程。
图33展示了用于获取包含系链基团的连接点的数种三蝶烯小分子配体的反应流程。
图34展示了用于获取包含系链基团和修饰部分的数种四环素小分子配体的反应流程。
图35展示了用于获取包含系链基团和修饰部分的数种三蝶烯小分子配体的反应流程。
图36展示了化合物ARK-132的合成途径。
图37展示了化合物ARK-134的合成途径。
图38展示了化合物ARK-135和ARK-136的合成途径。
图39展示了化合物ARK-188的合成途径。
图40展示了化合物ARK-190的合成途径。
图41展示了化合物ARK-191的合成途径。
图42展示了化合物ARK-195的合成途径。
图43展示了化合物ARK-197的合成途径。
图44展示了基于瑞博希骨架的化合物的合成途径。
图45展示了含有(杂)芳酰基叠氮化物的NAz光探针的光化学反应，以及氮烯中间体与鸟苷(guanosine)的C8修饰反应。
图46展示了可以用作根据本发明的用于分析开发的阳性对照模型系统的数种核糖开关(riboswitch)/适体配体对。前Q1配体和序列公开于自然结构分子生物学(NatStruct Mol Biol)16,343-344(2009)中，其特此以引用的方式并入。TPP配体和序列公开于自然(Nature)441,1167-1171(2006)和结构(Structure)14,1459-1468(2006)中，其各自特此以引用的方式并入。
图47展示了核糖开关/适体配体对的表面等离子体共振(surface plasmonresonance，SPR)结果。尽管化合物1b(化合物I-1，ARK-139)结合适体21，但已知不结合突变序列适体21-E(数据未示出)。
图48展示了通过SPR结合到适体21的ARK-139；通过SPR计算KD＝568nM。还通过SEC-MS确认结合(数据未示出)。
图49展示了由在适体21上使用SHAPE-MaP产生的SHAPE反应性结果。更高峰值表示在存在和不存在配体I-1(ARK-139)的情况下，适体的个别核苷酸的溶剂暴露量和反应性增加。
图50展示了由在适体21-E(底部)上使用SHAPE-MaP产生的结果。更高峰值表示在存在和不存在配体I-1(ARK-139)的情况下，适体的个别核苷酸的溶剂暴露量和反应性增加。如可以发现，I-1的存在几乎不引起SHAPE反应性的改变，表明I-1与适体21-E的结合较弱。
图51了展示光探针ARK-547与适体21的预测结合模式。如模型展示，预测结合模式容纳连接子和光激活基团。
图52展示了PEARL-seq逆转录酶暂停分析的凝胶结果。转录酶在经共价修饰的核苷酸处暂停，导致缩短序列的累积。ARK-547处理导致产生此类特定长度的缩短序列，表明某些核苷酸比其它核苷酸更有可能经共价修饰。NAI导致在更多的可接近/反应性核苷酸处的修饰，导致更少的选择性并且产生大量缩短序列。
图53展示了适体21和前Q1 RNA的逆转录酶(RT)暂停结果。适体21双吖丙啶探针ARK-547展示与Apt21 RNA的特异性和UV依赖性交联；前Q1探针未展示与Apt21或前Q1 RNA的交联。条件：1μM RNA、10μM针、9μM前Q1探针、20mM TrisHCl pH 8、100mM KCl、3mM MgCl2、37℃持续30分钟、避光、在室温下UV照射(约360nm)持续3段指示时间。
图54展示了用于交联适体21的额外化合物的筛选结果。条件：1μM再折叠RNA、10μM化合物、20mM TrisHCl pH 8、100mM KCl、3mM MgCl2、2.5％DMSO。使反应在避光的37℃下培育30分钟，随后在室温下在飞世尔光交联剂(Fisher photo-crosslinker)中用360nm光照射5分钟。
图55展示了适体21对与I-1结合的适体21-E的模型。
图56展示了与适体21结合的I-1(ARK-139)的SPR数据。ARK-139并未与适体21-E结合(数据未示出)。计算的Kd为420nM。
图57展示了凝胶分析，其中适体21和适体21-E与生物素-光亲和力双官能探针ARK-670一起培育、交联并且随后捕获在链霉亲和素珠粒上。仅适体21RNA展示显著拉下。
展示在用ARK-547测量在位置43和60处的MaP信号和在位置60处的选择性下降处理之后交联适体21的测序结果。与链霉亲和素捕获的组合将从RNA的混合物识别结合位点。
图58A和58B展示了具有适体21的LC-MS结果。ARK-547和ARK-581分别展示了RNA的5％和10％共价修饰。
图59展示了使用双官能光激活化合物的逆转录酶(RT)暂停分析结果。
图60展示了生物素拉下实验结果。步骤：将生物素-双吖丙啶探针(ARK-579)与RNA交联；捕获在链霉亲和素磁珠上；在珠粒上进行RT；碱性水解RNA以洗脱cDNA；在凝胶上进行Ran。
图61A和61B展示了RT暂停和突变率结果。适体21和光探针ARK-547的光交联揭露ARK-547并不与阴性对照适体21-E结合并且不产生光加合物。逆转录酶(RT)暂停在nt 59处最大，符合预测结合模式。归一化突变率的位点也符合ARK-547结合模式。
图62展示了I-14(ARK-729)和I-15(ARK-816)的结构，以及通过使用这些化合物的无Cu点击反应来标记RNA-光探针加合物。用变性剂与无Cu点击反应条件的不同组合操作通道1-5。通道1：无变性剂/10mM Tris、1mM EDTA、pH 8.0、37℃点击条件；通道2：无变性剂/10mM Tris、10mM EDTA、pH 8.0、65℃点击条件；通道3：6M尿素变性剂/10mM Tris、10mMEDTA、pH 8.0、65℃点击条件；通道4：90％甲酰胺变性剂/10mM Tris、10mM EDTA、pH 8.0、65℃点击条件；通道5：1倍TBE-尿素缓冲液，65℃。用ARK-729或ARK-816处理适体21，随后进行UV光交联。随后在指定条件下用Cy7-DBCO偶联物处理所得光加合物。在无任何添加剂的情况下，在65℃下进行无Cu点击反应使得能够通过Cy7荧光检测适体21-探测光加合物。
图63展示了在适体21光探针与RNA结合配体之间竞争实验的结果。适体21单独与探针(ARK-581)或探针加10倍过量的RNA结合配体一起培育。仅SPR活性化合物ARK-139和ARK-852有效地抑制ARK-581与适体21的光交联。
图64展示了结构不同的适体21配体与适体21的光交联的RT暂停结果。
图65展示了竞争分析的RT暂停结果。ARK-852和ARK-139两者都抑制探针与适体21的光交联。
图66展示了与化学探针与适体21的光交联相关的RT暂停结果。
图67A和图67B展示了ARK-670与适体21、适体21-E或适体21和四个其它RNA的混合物的光交联。来自探针加合物的RT暂停信号对适体21具有特异性并且在交联RNA的珠粒富集之后强度增加。
图68展示了在其它RNA序列存在下，通过ARK-670选择性地富集适体21。将ARK-670与适体21和四种其它RNA的混合物交联之后，进行交联RNA的亲和素珠粒富集和测序。测序分析展示，仅适体21被ARK-670富集，其表明ARK-670与适体21结合并以邻近驱动方式选择性地交联。
图69展示在富集之后来自点击生物素化探针的RT暂停数据。在适体21或适体21-E与ARK-729(苯基叠氮化物探针)、ARK-2058(仅苯基叠氮化物弹头对照)、ARK-816(双吖丙啶探针)、ARK-2059(仅双吖丙啶弹头对照)或DMSO交联之后，在亲和素珠粒上富集和测序。探针ARK-729和ARK-816展示了对适体21具有特异性的RT暂停峰。
图70展示了映射适体21序列上的RT暂停峰的位置的草图。
图71展示了加标到PolyA+RNA提取物中的适体21上的RT暂停。通过测序测量ARK-816(双吖丙啶探针)或ARK-2059(仅双吖丙啶弹头)与加标到polyA+RNA提取物中的适体21的交联和RT暂停率。在与分离的适体21相同的位置处观察到对ARK-816探针具有特异性的峰。
图72展示了来自PolyA+RNA提取物的适体21的富集分析。将适体21加标到polyA+RNA提取物中，并且随后使混合物与ARK-816(双吖丙啶探针)和ARK-2059(仅弹头对照)交联，并且通过亲和素捕获使交联RNA富集。通过探针的序列与通过下一代测序确定的仅弹头对照的序列相比进行特定富集。观测到在适体21上的探测特异性RT暂停位点的富集。
具体实施方式
1.本发明的某些实施例的一般描述；定义
RNA靶点以及与疾病和病症的关联
绝大多数分子靶点在治疗上阐述为蛋白质。然而，现在应理解，多种RNA分子在健康细胞和病变细胞两者中都起重要调节作用。虽然仅1-2％的人类基因组编码蛋白质，但现在已知大部分基因组被转录(卡宁希(Carninci)等人,科学(Science)309:1559-1563；2005)。因此，非编码转录物(非编码转录物组)表示一大组新的治疗靶点。如微RNA(miRNA)和长非编码RNA(lncRNA)的非编码RNA调节转录、剪接、mRNA稳定性/衰变和翻译。此外，mRNA的非编码区，如5′非翻译区(5′UTR)、3′UTR和内含子，可以在影响mRNA表达水平、选择性剪接、翻译效率以及mRNA和蛋白质亚细胞定位方面起调节作用。RNA二级和三级结构对于这些调节活性来说很关键。
值得注意地，GWAS研究表明，相对于编码转录物，在非编码转录物组中存在多得多的与人类疾病相关的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)(毛拉诺(Maurano)等人,科学337:1190-1195；2012)。因此，治疗靶向非编码RNA和mRNA的非编码区可以产生治疗先前难治的人类疾病的新颖药剂。
当前阻断mRNA的治疗方法需要如以下的方法：基因疗法(纳尔迪尼(Naldini),自然2015,526,351-360)、基因组编辑(考克斯(Cox)等人,自然·医学(Nature Medicine)2015,21,121-131)或广泛范围的寡核苷酸技术(反义、RNAi等)(班尼特(Bennett)与斯韦兹(Swayze),药理学和毒理学年鉴(Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.)2010,50,259-293)。寡核苷酸通过典型碱基/碱基杂交调节RNA的作用。这种方法的魅力在于，寡核苷酸的碱性药效团可以由经受阻断的序列以简单明了的方式定义。这些治疗模态各自遭遇相当大的技术、临床和法规挑战。寡核苷酸作为治疗剂(例如反义、RNAi)的一些限制包含不利药代动力学、缺乏口服生物可用性和缺乏血脑屏障渗透，其中后者阻止肠胃外药物投与以治疗神经疾病之后递送到脑或脊髓。此外，在没有如脂质纳米粒子的复杂递送系统的情况下，寡核苷酸无法有效地吸收到实体肿瘤中。最后，吸收到细胞和组织中的绝大多数寡核苷酸保持在如内体的非功能性区室中，并且仅一小部分物质离开以进入靶点所在的细胞溶质和/或细胞核。
“传统”小分子可以被优化以展现极佳的从肠的吸收、极佳的向靶器官的分布和极佳的细胞渗透。使用具有有利药物特性的“传统”(即，“里宾斯基顺应性(Lipinski-compliant)”(里宾斯基等人,先进药物递送评论(Adv.Drug Deliv.Rev.)2001,46,3-26)小分子来结合和调节靶RNA的活性将解决上述许多问题。。
在一个方面，本发明提供一种识别小分子结合到靶RNA中的结合位点或活性位点的特性或结构的方法，其包括以下步骤：i)使靶RNA与所公开的化合物接触，和ii)通过本文所公开的分析，任选地与计算方法组合来分析结果。在一些实施例中，靶RNA是选自mRNA或非编码RNA。在一些实施例中，靶RNA为适体或核糖开关。在一些实施例中，RNA为FMN核糖开关、前Q1或适体21。在一些实施例中，所述分析识别靶RNA上一或多个结合位点的一级序列中的位置。
靶向mRNA
在mRNA内，非编码区可以影响mRNA和蛋白质表达的水平。简单来说，这些非编码区包含影响翻译效率的IRES和上游开放阅读框(uORF)；影响剪接效率和选择性剪接模式的内含子序列；影响mRNA和蛋白质定位的3′UTR序列；和控制mRNA衰变和半衰期的粒子。这些RNA粒子的治疗调节可以具有有益效果。此外，mRNA可以含有如三核苷酸重复序列的简单重复序列的扩增。这些含有重复序列扩增的RNA可以为有毒的并且已经被观察到可驱使疾病病理学，尤其在某些神经和肌肉骨胳疾病中(参见盖切尔(Gatchel)与佐格比(Zoghbi),自然·遗传学综述(Nature Rev.Gen.)2005,6,743-755)。此外，剪接可以被调节以跳过具有引入终止密码子的突变的外显子以便解除在翻译期间的过早终止。
小分子可以在各种背景下用于调节前mRNA的剪接以获得治疗效益。一个实例是脊髓性肌萎缩(spinal muscular atrophy，SMA)。SMA是运动神经元存活(SMN)蛋白质量不足的结果。人类具有两种形式的SMN基因，SMN1和SMN2。SMA患者具有突变的SMN1基因，并且因此其SMN蛋白质仅仅依赖于SMN2。SMN2基因在外显子7中具有导致低效剪接的沉默突变以使得外显子7在大多数SMN2转录物中被跳过，导致产生在细胞中快速降解的缺陷蛋白质，因此限制由这种基因座产生的SMN蛋白质的量。在SMN2转录物的剪接期间促进外显子7的高效纳入的小分子将是有效的SMA治疗(帕拉奇诺(Palacino)等人,自然·化学生物学(NatureChem.Biol.),2015,11,511-517)。因此，在一个方面，本发明提供一种识别调节靶前mRNA的剪接以治疗疾病或病症的小分子的方法，其包括以下步骤：筛选一或多种与所述靶前mRNA结合的所公开的化合物；和通过本文所公开的RNA结合分析来分析结果。在一些实施例中，前mRNA是SMN2转录物。在一些实施例中，疾病或病症是脊髓性肌萎缩(SMA)。
即使在缺陷剪接并不导致疾病的情况下，剪接模式的改变也可以用于矫正疾病。如果外显子序列同框，那么导致过早翻译终止的无义突变可以通过外显子跳跃来消除。这可以产生至少部分功能性的蛋白质。使用外显子跳跃的一个实例是杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy，DMD)中的肌缩蛋白基因。在DMD患者中产生过早终止密码子的多种不同突变可以通过由寡核苷酸促进的外显子跳跃来消除(综述在费尔克拉夫(Fairclough)等人,自然·遗传学综述,2013,14,373-378中)。预期结合RNA结构并且影响剪接的小分子具有类似效应。因此，在一个方面，本发明提供一种识别调节靶前mRNA的剪接模式以治疗疾病或病症的小分子的方法，其包括以下步骤：筛选一或多种与所述靶前mRNA结合的所公开的化合物；和通过本文所公开的RNA结合分析来分析结果。在一些实施例中，前mRNA是肌缩蛋白基因转录物。在一些实施例中，小分子促进外显子跳跃以消除过早翻译终止。在一些实施例中，疾病或病症是杜氏肌营养不良(DMD)。
最后，mRNA和其翻译产物的表达可能受5′和3′UTR中的靶向非编码序列和结构影响。举例来说，5′UTR中的RNA结构可以影响翻译效率。5′UTR中的如发夹的RNA结构已经被证实会影响翻译。一般来说，RNA结构被认为在mRNA的翻译中起关键作用。这些RNA结构的两个实例是可以影响主开放阅读框的翻译水平的内部核糖体进入位点(internal ribosomeentry site，IRES)和上游开放阅读框(upstream open reading frames，uORF)(科马尔(Komar)和哈佐格卢(Hatzoglou),肿瘤学前沿(Frontiers Oncol.)5:233,2015；温加滕-加贝(Weingarten-Gabbay)等人,科学(Science)351:pii:aad4939,2016；卡尔沃(Calvo)等人,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)106:7507-7512；勒凯纳(Le Quesne)等人,病理学杂志(J.Pathol.)220:140-151,2010；巴尔博萨(Barbosa)等人,公共科学图书馆·遗传学(PLOS Genetics)9:e10035529,2013)。举例来说，所有人类mRNA中几乎一半具有uORF，并且其中的许多减少主ORF的翻译。靶向这些RNA的小分子可以用以调节特异性蛋白质水平以获得治疗效益。因此，在一个方面，本发明提供一种产生调节靶前mRNA或mRNA的表达或翻译效率以治疗疾病或病症的小分子的方法，其包括以下步骤：筛选一或多种与所述靶前mRNA或mRNA结合的所公开的化合物；和通过本文所公开的RNA结合分析来分析结果。在一些实施例中，小分子结合位点是5′UTR、内部核糖体进入位点或上游开放阅读框。
靶向调节RNA
RNA靶点的最大组是转录但不翻译成蛋白质的RNA，被称为“非编码RNA”。非编码RNA是高度保守的并且许多种非编码RNA发挥广泛范围的调节功能。如本文所用，术语“非编码RNA”包含但不限于微RNA(miRNA)、长非编码RNA(lncRNA)、长基因间非编码RNA(lincRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、竞争性内源RNA(ceRNA)和假基因。非编码RNA的这些子类别中的各者提供大量具有显著治疗潜力的RNA靶点。因此，在一些实施例中，本发明提供治疗由非编码RNA介导的疾病的方法。在一些实施例中，疾病是由miRNA、lncRNA、lincRNA、piRNA、ceRNA或假基因导致。在另一个方面，本发明提供一种产生调节靶非编码RNA的活性以治疗疾病或病症的小分子的方法，其包括以下步骤：筛选一或多种与所述靶非编码RNA结合的所公开的化合物；和通过本文所公开的RNA结合分析来分析结果。在一些实施例中，靶非编码RNA是miRNA、lncRNA、lincRNA、piRNA、ceRNA或假基因。
miRNA是调节基因表达的短双链RNA(参见埃利奥特(Elliott)与拉多梅里(Ladomery),RNA的分子生物学(Molecular Biology of RNA),第2版)。每个miRNA可以影响多种人类基因的表达。人体中存在接近2,000种miRNA。这些RNA调节许多生物过程，包含细胞分化、细胞命运、运动、存活和功能。miRNA表达水平在不同组织、细胞类型和疾病背景之间不同。与正常组织相比，其常常在肿瘤中异常表达，并且其活性可以在癌症中起重要作用(关于综述，参见克罗斯(Croce),自然·遗传学综述10:704-714,2009；迪克霍伦(Dykxhoorn)癌症研究(Cancer Res.)70:6401-6406,2010)。miRNA已经被证实可以调节致癌基因和肿瘤抑制因子，并且其自身可以充当致癌基因或肿瘤抑制因子。一些miRNA已经被证实可以促进上皮-间质转化(EMT)以及癌细胞侵袭和转移。在致癌miRNA的情况下，其抑制可以是有效抗癌治疗。因此，在一个方面，本发明提供一种产生调节靶miRNA的活性以治疗疾病或病症的小分子的方法，其包括以下步骤：筛选一或多种与所述靶miRNA结合的所公开的化合物；和通过本文所公开的RNA结合分析来分析结果。在一些实施例中，miRNA调节致癌基因或肿瘤抑制因子，或充当致癌基因或肿瘤抑制因子。在一些实施例中，疾病是癌症。在一些实施例中，癌症为实体肿瘤。
存在多种可以在治疗上靶向的致癌miRNA，包含miR-155、miR-17～92、miR-19、miR-21和miR-10b(参见斯塔尔赫特(Stahlhut)与斯拉克(Slack),基因组医学(GenomeMed.)2013,5,111)。miR-155在发炎、高血压、心力衰竭和癌症中起病理作用。在癌症中，miR-155触发致癌级联和细胞凋亡抗性，以及增加癌细胞侵袭性。miR-155变更表达已经描述于多种癌症中，反映了分期、进展和治疗结果。报告miR-155过度表达的癌症是乳癌、甲状腺癌、结肠癌、子宫颈癌和肺癌。其据报告在乳癌的药物抗性中起作用。miR-17～92(也称为Oncomir-1)是多顺反子1kb初级转录物，其包括miR-17、20a、18a、19a、92-1和19b-1。其由MYC激活。miR-19改变多种造血细胞中的基因表达和信号转导路径，并且其触发白血病生成和淋巴瘤生成。其牵涉多种多样的人类实体肿瘤和血液癌症。miR-21是降低多种肿瘤抑制因子的表达的致癌miRNA。其刺激癌细胞侵袭并且与多种多样的人类癌症相关，包含乳癌、卵巢癌、子宫颈癌、结肠癌、肺癌、肝癌、脑癌、食道癌、前列腺癌、胰腺癌和甲状腺癌。因此，在上文所描述的方法的一些实施例中，靶miRNA选自miR-155、miR-17～92、miR-19、miR-21或miR-10b。在一些实施例中，疾病或病症是选自以下的癌症：乳癌、卵巢癌、子宫颈癌、甲状腺癌、结肠癌、肝癌、脑癌、食道癌、前列腺癌、肺癌、白血病或淋巴结癌。在一些实施例中，癌症为实体肿瘤。
除肿瘤学以外，miRNA还在包含心血管疾病和代谢疾病的许多其它疾病中起作用(奎安特(Quiant)和奥尔森(Olson),临床研究杂志(J.Clin.Invest.)123:11-18,2013；奥尔森,科学转化医学(Science Trans.Med.)6:239ps3,2014；巴菲(Baffy),临床医学杂志(J.Clin.Med.)4:1977-1988,2015)。
许多成熟miRNA的长度相对较短并且因此可能缺乏充足的待由小分子靶向的折叠三维结构。然而，认为此类miRNA的含量可以通过结合初级转录物或前miRNA以阻断成熟miRNA的生物合成的小分子来降低。因此，在上文所描述的方法的一些实施例中，靶miRNA是初级转录物或前miRNA。
lncRNA是不编码蛋白质的具有超过200个核苷酸(nt)的RNA(参见林恩(Rinn)与常(Chang),生物化学年鉴(Ann.Rev.Biochem.)2012,81,145-166；关于综述，参见莫里斯(Morris)和马蒂克(Mattick),自然·遗传学综述15:423-437,2014；马蒂克和林恩,自然·结构与分子生物学(Nature Structural&Mol.Biol.)22:5-7,2015；艾耶尔(Iyer)等人,自然·遗传学(Nature Genetics)47:199-208,(2015))。其可以在转录、剪接和mRNA衰变的水平下影响蛋白质编码mRNA的表达。大量的研究已经显示，lncRNA可以通过募集通过改变染色质结构而增加或降低转录的表观遗传调节因子来调节转录(例如，霍洛克(Holoch)和莫阿塞德(Moazed),自然·遗传学综述16:71-84,2015)。lncRNA与包含以下的人类疾病相关：癌症、发炎性疾病、神经疾病和心血管疾病(例如普赖斯纳(Presner)和辛莱岩(Chinnaiyan),癌症发现(Cancer Discovery)1:391-407,2011；约翰逊(Johnson),疾病神经生物学(Neurobiology of Disease)46:245-254,2012；古契(Gutscher)和迪德里希斯(Diederichs),RNA生物学(RNA Biology)9:703-719,2012；库马尔(Kumar)等人,公共科学图书馆·遗传学9:e1003201,2013；凡德范德福特(van de Vondervoort)等人,分子神经科学前沿(Frontiers in Molecular Neuroscience),2013；李(Li)等人,国际分子科学杂志(Int.J.Mol.Sci.)14:18790-18808,2013)。可以对lncRNA进行靶向以上调或下调特异性基因和蛋白质的表达以获得治疗效益(例如，瓦勒斯泰特(Wahlestedt),自然·药物发现综述(Nature Reviews Drug Discovery)12:433-446,2013；久尔(Guil)和埃斯特尔(Esteller),自然·结构与分子生物学19:1068-1075,2012)。一般来说，lncRNA相对于mRNA以较低水平表达。许多lncRNA与染色质物理缔合(沃尔纳(Werner)等人,细胞报道(CellReports)12,1-10,2015)并且在非常接近蛋白质编码基因处转录。其常常在其转录位点保持物理缔合并且以顺式的方式局部起作用以调节邻近mRNA的表达。lncRNA的突变和失调与人类疾病相关；因此，存在众多的可以是治疗靶点的lncRNA。因此，在上文所描述的方法的一些实施例中，靶非编码RNA是lncRNA。在一些实施例中，lncRNA与癌症、发炎性疾病、神经疾病或心血管疾病相关。
lncRNA调节蛋白质编码基因的表达，在多种不同水平下作用以影响转录、替代性剪接和mRNA衰变。举例来说，lncRNA已经被证实与表观遗传调节因子PRC2结合以促进其募集到随后通过染色质修饰而抑制转录的基因。lncRNA可以形成介导其与各种调节蛋白的缔合的复杂结构。与这些lncRNA结构结合的小分子可以用于调节通常由单独lncRNA调节的基因的表达。
一种示例性靶lncRNA是HOTAIR，一种由人类染色体12上的HoxC基因座表达的lncRNA。其表达水平较低(约100个RNA拷贝/细胞)。不同于许多lncRNA，HOTAIR可以反式起作用以影响远端基因的表达。其结合表观遗传抑制因子PRC2以及LSD1/CoREST/REST复合物，另一种抑制性表观遗传调节因子(蔡(Tsai)等人,科学329,689-693,2010)。HOTAIR是高度结构化的RNA，其超过50％的核苷酸参与碱基配对。其常常在各种类型的癌症中失调(往往上调)(姚(Yao)等人,国际分子科学杂志15:18985-18999,2014；邓(Deng)等人,公共科学图书馆·综合(PLOS One)9:e110059,2014)。与具有低表达水平的那些患者相比，具有高HOTAIR表达水平的癌症患者具有显著更差的预后。HOTAIR据报告参与细胞凋亡、增殖、转移、血管生成、DNA修复、化学抗性和肿瘤细胞代谢的控制。其在转移性乳癌中高度表达。原发性乳房肿瘤中的高表达水平是后续转移和死亡的显著预测因子。HOTAIR还被报告与食道鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma)相关，并且其是结肠直肠癌、子宫颈癌、胃癌和子宫内膜癌中的预后因子。因此，HOTAIR结合小分子是新颖抗癌药物候选物。因此，在上文所描述的方法的一些实施例中，靶非编码RNA是HOTAIR。在一些实施例中，疾病或病症是乳癌、食道鳞状细胞癌、结肠直肠癌、子宫颈癌、胃癌或子宫内膜癌。
lncRNA中的另一种潜在癌症靶点是MALAT-1(转移相关的肺腺癌转录物1)，也称为NEAT2(富含细胞核的丰富转录物2)(古奇纳(Gutschner)等人,癌症研究73:1180-1189,2013；布朗(Brown)等人,自然·结构与分子生物学21:633-640,2014)。其是定位于细胞核斑中的高度保守的7kb细胞核lncRNA。其在正常组织中广泛表达，但在许多癌症中上调。MALAT-1是包含肺癌的多种癌症中的转移发展的预测性标记。其呈现为充当基因表达的调节因子，潜在地影响转录和/或剪接。MALAT-1基因剔除小鼠不具有表型，表明其具有有限的正常功能。然而，缺乏MALAT-1的癌细胞迁移削弱并且在小鼠异种移植肿瘤模型中形成更少肿瘤。阻断MALAT-1的反义寡核苷酸(ASO)在肿瘤植入小鼠中之后阻止转移形成。一些小鼠异种移植肿瘤模型数据表明，通过ASO进行的MALAT-1基因敲落可以抑制原发性肿瘤生长和转移两者。因此，预期靶向MALAT-1的小分子可以有效抑制肿瘤生长和转移。因此，在上文所描述的方法的一些实施例中，靶非编码RNA是MALAT-1。在一些实施例中，疾病或病症是MALAT-1上调的癌症，如肺癌。
在一些实施例中，本发明提供一种治疗由非编码RNA(如，HOTAIR或MALAT-1)介导的疾病或病症的方法，所述方法包括以下步骤：向有需要的患者投与本发明化合物。此类化合物详细描述于本文中。
靶向毒性RNA(重复序列RNA)
mRNA中的简单重复序列通常与人类疾病相关。其通常(但非排他地)是具有三个核苷酸的重复序列，如CAG(“三联体重复序列”)(关于综述，参见盖切尔和佐格比,自然·遗传学综述6:743-755,2005；克孜左西亚克(Krzyzosiak)等人,核酸研究(Nucleic AcidsRes.)40:11-26,2012；布德沃斯(Budworth)和麦克默里(McMurray),分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)1010:3-17,2013)。三联体重复序列在人类基因组中很丰富，并且其往往会经历数代扩增。大致40种人类疾病与重复序列的扩增相关。由三重扩增所导致的疾病被称为三联体重复序列扩增疾病(Triplet Repeat Expansion Disease，TRED)。健康个体具有可变数目的三联体重复序列，但存在阈值，超过所述阈值的更高重复序列数目会导致疾病。阈值对于不同病症而不同。三联体重复序列可能不稳定。在基因被遗传时，重复序列的数目可能增加，并且病状可能从一代到下一代更严重或更早发作。当个体具有处于正常范围中的多种重复序列时，预期其不会在被传到下一代时扩增。当重复序列数目处于前突变范围中(正常但不稳定的重复序列数目)时，那么重复序列在传到下一代时可能扩增或可能不扩增。携有前突变的正常个体并不具有病状，但有风险生下遗传了处于全突变范围中的三联体重复序列并且将会受影响的孩子。TRED可以是常染色体显性的、常染色体隐性的或X连锁的。更为常见的三联体重复序列病症是常染色体显性的。
重复序列可以在mRNA的编码或非编码部分中。在重复序列在非编码区内的情况下，重复序列可以位于5′UTR、内含子或3′UTR序列中。由编码区内的重复序列所导致的疾病的一些实例展示于表1中。
表1：重复序列存在于mRNA的编码区中的重复序列扩增疾病
疾病 基因 重复序列 正常重复序列数目 疾病重复序列数目
HD HTT CAG 6-35(SEQ ID NO:1) 36-250(SEQ ID NO:8)
DRPLA ATN1 CAG 6-35(SEQ ID NO:1) 49-88(SEQ ID NO:9)
SBMA AR CAG 9-36(SEQ ID NO:2) 38-62(SEQ ID NO:10)
SCA1 ATXN1 CAG 6-35(SEQ ID NO:1) 49-88(SEQ ID NO:9)
SCA2 ATXN2 CAG 14-32(SEQ ID NO:3) 33-77(SEQ ID NO:11)
SCA3 ATXN3 CAG 12-40(SEQ ID NO:4) 55-86(SEQ ID NO:12)
SCA6 CACNA1A CAG 4-18(SEQ ID NO:5) 21-30(SEQ ID NO:13)
SCA7 ATXN7 CAG 7-17(SEQ ID NO:6) 38-120(SEQ ID NO:14)
SCA17 TBP CAG 25-42(SEQ ID NO:7) 47-63(SEQ ID NO:15)
由mRNA的非编码区内的重复序列所导致的疾病的一些实例展示于表2中。
表2：重复序列存在于mRNA的非编码区中的重复序列扩增疾病
Figure BDA0002508295540000141
由重复序列产生的毒性可以是毒性RNA自身的作用的直接结果，或在重复序列扩增是在编码序列中的情况下，是由于RNA和/或异常蛋白质的毒性。重复序列扩增RNA可以通过将关键RNA结合蛋白(RBP)螯合到病灶中来起作用。螯合的RBP的一个实例是肌盲家族蛋白质MBNL1。RBP的螯合导致剪接缺陷以及RNA和蛋白质的细胞核-细胞质转运缺陷。RBP的螯合还可以影响miRNA生物合成。RNA生物学中的这些扰动可以极大地影响神经元功能和存活，导致各种神经疾病。
RNA中的重复序列形成结合RBP并且影响正常RNA生物学的二级和三级结构。一种特定实例疾病是强直性肌营养不良(DM1；营养不良性肌强直)，一种表征为肌肉无力和在收缩之后肌肉放松缓慢的常见遗传形式的肌肉疾病(马丘卡-慈利(Machuca-Tzili)等人,肌肉神经(Muscle Nerve)32:1-18,2005)。其是由营养不良性肌强直蛋白激酶(dystrophiamyotonica protein kinase，DMPK)基因的3′UTR中的CUG扩增导致。含这种重复序列的RNA通过对剪接调节因子MBNL1和CUG重复序列结合蛋白(CELF1)的作用而导致误调节数种发育调节的转录物的替代性剪接(惠勒(Wheeler)等人,科学325:336-339,2009)。结合DMPK转录物内的CUG重复序列的小分子将改变RNA结构并且阻止病灶形成并且缓解对这些剪接调节因子的作用。脆性X综合征(Fragile X Syndrome，FXS)，最常见的遗传形式的智力迟钝，是FMR1基因的5′UTR内的CGG重复序列扩增的结果(罗扎诺(Lozano)等人,难治性罕见疾病研究(Intractable Rare Dis.Res.)3:134-146,2014)。FMRP对于许多mRNA的翻译调节和对于蛋白质运输来说很关键，并且其是突触发育和神经可塑性的必需蛋白质。因此，其缺乏引起神经病理学。靶向这种CGG重复序列RNA的小分子可以缓解对FMR1 mRNA和FMRP蛋白质表达的抑制。具有极高未满足的医疗需要的另一种TRED是亨廷顿氏病(Huntington's disease，HD)。HD是具有运动、认知和精神变化的进行性神经病症(祖卡托(Zuccato)等人,生理学评论(Physiol Rev.)90:905-981,2010)。其被表征为聚谷氨酰胺或聚Q病症，因为HTT基因的编码序列内的CAG重复序列导致蛋白质具有呈现为对转录、囊泡运输、粒线体功能和蛋白酶体活性具有有害作用的聚谷氨酰胺重复序列。然而，HTT CAG重复序列RNA自身也展现毒性，包含MBNL1蛋白质螯合到核包涵体中。一个其它特定实例是C9orf72(染色体9开放阅读框72)基因中的GGGGCC重复序列扩增，其在家族性额颞痴呆(frontotemporal dementia，FTD)和肌萎缩性侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)中很普遍(凌(Ling)等人,神经元(Neuron)79:416-438,2013；霍伊斯勒(Haeusler)等人,自然507:195-200,2014)。重复序列RNA结构形成螯合关键RNA结合蛋白的核灶。GGGGCC重复序列RNA还结合并且螯合RanGAP1以削弱RNA和蛋白质的核质转运(张(Zhang)等人,自然525:56-61,2015)。选择性靶向这些重复序列扩增RNA中的任一种可以在这些神经疾病中增加治疗效益。
本发明涵盖一种治疗疾病或病症的方法，其中异常RNA自身引起致病作用，而非通过蛋白质表达的机制或蛋白质表达的调节来起作用。在一些实施例中，疾病或病症是由如上文或表1和2中所描述的那些的重复序列RNA介导。在一些实施例中，疾病或病症是重复序列存在于mRNA的编码区中的重复序列扩增疾病。在一些实施例中，疾病或病症是重复序列存在于mRNA的非编码区中的重复序列扩增疾病。在一些实施例中，疾病或病症是选自亨廷顿氏病(HD)；齿状核红核-苍白球丘脑下部核萎缩(dentatorubral-pallidoluysianatrophy，DRPLA)；脊髓-延髓肌肉萎缩(spinal-bulbar muscular atrophy，SBMA)或选自SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7或SCA17的脊髓小脑共济失调(spinocerebellar ataxia，SCA)。在一些实施例中，疾病或病症是选自脆性X综合征；强直性肌营养不良(DM1或营养不良性肌强直)；弗里德希氏共济失调(Friedreich's Ataxia，FRDA)；选自SCA8、SCA10或SCA12的脊髓小脑共济失调(SCA)或C9FTD(肌萎缩性侧索硬化或ALS)。
在一些实施例中，疾病是肌萎缩性侧索硬化(ALS)、亨廷顿氏病(HD)、额颞痴呆(FTD)、强直性肌营养不良(DM1或营养不良性肌强直)或脆性X综合征。
在一些实施例中，本发明提供一种治疗由重复序列RNA介导的疾病或病症的方法，其包括以下步骤：向有需要的患者投与本发明化合物。此类化合物详细描述于本文中。
还提供一种产生调节靶重复序列扩增RNA的活性以治疗疾病或病症的小分子的方法，其包括以下步骤：筛选一或多种与所述靶重复序列扩增RNA结合的所公开的化合物；和通过本文所公开的RNA结合分析来分析结果。在一些实施例中，重复序列扩增RNA导致选自以下的疾病或病症：HD、DRPLA、SBMA、SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7或SCA17。在一些实施例中，疾病或病症是选自脆性X综合征、DM1、FRDA、SCA8、SCA10、SCA12或C9FTD。
其它靶RNA和疾病/病状
已知大量额外RNA与疾病或病状之间存在关联，其中的一些展示于下表3中。因此，在上文所描述的方法的一些实施例中，靶RNA是选自表3中的那些靶RNA。在一些实施例中，疾病或病症是选自表3中的那些疾病或病症。
表3：靶RNA和相关疾病/病状
Figure BDA0002508295540000161
Figure BDA0002508295540000171
Figure BDA0002508295540000181
Figure BDA0002508295540000191
Figure BDA0002508295540000201
Figure BDA0002508295540000211
表4：额外靶RNA
基因 通用名称 类别 上调/下调？ TA 一或多种迹象
CTSL 组织蛋白酶L 蛋白酶 上调 神经 PD
AR AR-V7 NHR 下调 癌症 CRPC
JMJD6 JMJD6 HDM 下调 癌症 GBM
DNMT1 DNMT1 Me-转移酶 下调 癌症 GBM
ASGR1 ASGR1 ASG受体 下调 CVD CVD
NAMPT NAMPT 转移酶 下调 癌症 各种
IRE
ARID1B ARID1B
SOX10 SOX10
HNF1B TCF2
PTPN2 PTPN2
NLGN3 NLGN3
ETS
2.化合物和其用途
现在已发现本发明的化合物和其药学上可接受的组合物作为用于药物发现和用于制备适用于药物发现的核酸偶联物的药剂是有效的。举例来说，本发明化合物和其药物组合物可以用于确定活性位点或变构位点的位置和/或结构和/或靶RNA的三级结构。
在一个方面，所公开的化合物适用作诊断或分析试剂。在一些实施例中，本发明提供一种确定靶核酸中核苷酸的三维结构、所关注的配体的结合位点或可接近性的方法，其包括：使靶核酸与所公开的化合物接触；照射所述化合物；确定是否发生核酸的核苷酸的共价修饰；和任选地导出核苷酸修饰模式、三维结构、配体结合位点或关于核酸的其它结构信息。
在另一个方面，本发明提供一种制备核酸偶联物的方法，其包括：使靶核酸与所公开的化合物接触；照射所述化合物；和任选地通过亲和分析、拉下方法或所属领域中已知的其它方式分离所得核酸偶联物。此类核酸偶联物适用于确定关于包含在偶联物中的靶核酸的结构信息，其允许普通技术人员设计在体内与靶核酸结合以治疗疾病、病症或病状(如本文所公开的那些疾病、病症或病状)的小分子药物。在一些实施例中，核酸为RNA，如本文所描述的引起疾病的RNA。
在另一个方面，本发明提供一种评估药物候选物的转录物组的选择性的方法，其包括使包括两种或更多种RNA转录物的生物样品与包括系栓到所述药物候选物的所公开的光激活基团的药物候选物接触；照射所述药物候选物；和确定RNA转录物的共价修饰。
在另一个方面，本发明提供一种确定药物候选物的细胞中的靶点占用率的方法，其包括使包括靶RNA的生物样品与包括系栓到所述药物候选物的所公开的光激活基团的所公开的化合物或药物候选物接触；照射所述化合物或药物候选物；和确定所述靶RNA的共价修饰。在一些实施例中，所述方法确认靶接合并且与细胞生物学相关。
在一些实施例中，所述方法通过识别子位点结合以说明生物化学作用模式而实现组装结合位点映射。
在一些实施例中，所述方法进一步实现将靶接合与靶点突变和细胞功能相关。这对于理解细胞中药物候选物的分子机制是有用的。
在另一个方面，本发明提供一种确定与靶RNA相关的RNA结合蛋白(RBP)的存在的方法，其包括：使靶RNA与所公开的化合物接触；照射所述化合物；和确定是否发生RBP的氨基酸的共价修饰。
在一些实施例中，本发明提供一种化合物，其包括：
(a)选择性地与靶RNA上的一或多个结合位点结合的小分子配体；
(b)光激活基团(或“弹头”)，其共价结合到所述小分子配体并且一旦用可见光或紫外光照射，就与所述靶RNA形成共价键；
(c)任选地，点击就绪基团；
(d)任选地，拉下基团；和
(e)任选地，一个或两个系链基团，其共价连接小分子配体和光活性基团，并且任选地，点击就绪基团。
不希望受任何具体的理论所束缚，认为本发明化合物选择性地与靶RNA上一或多个活性位点或变构位点结合，或与由小分子配体与靶RNA的结构之间的结合相互作用所确定的其它位点结合；一旦照射，就共价修饰靶RNA的一或多个位置，如腺苷或鸟苷核苷酸的C8碳或靶RNA的2′-OH基团；并且随后用于通过对经修饰核苷酸的分布的测序和其它分析来识别活性位点或其它结合位点，因为修饰模式将受到连接配体与RNA弹头的系链的长度和构象限制。靶RNA在接触化合物之前可以在细胞内部、在细胞裂解物中，或呈分离形式。所公开化合物的文库的筛选将识别靶RNA的活性的高效小分子调节剂。应理解，通过此类筛选来识别的此类小分子可以用作靶RNA的调节剂以治疗、预防或减轻有需要的患者的疾病或病状。
在一个方面，本发明提供一种通式I化合物：
Figure BDA0002508295540000231
或其药学上可接受的盐；其中：
配体是小分子RNA结合子；
T1是二价系链基团；并且
Rmod是光激活基团；其中每种变量如下文所定义。
在另一个方面，本发明提供一种通式II化合物：
Figure BDA0002508295540000232
或其药学上可接受的盐；其中：
配体是小分子RNA结合子；
T1是二价系链基团；
T2是共价键或二价系链基团；
Rmod是光激活基团；并且
RCG是点击就绪基团或拉下基团。
在另一个方面，本发明提供一种通式III化合物：
Figure BDA0002508295540000233
或其药学上可接受的盐；其中：
配体是小分子RNA结合子；
T1是三价系链基团；
T2是二价系链基团；
Rmod是光激活基团；并且
RCG是点击就绪基团或拉下基团；其中每种变量如下文所定义。
在另一个方面，本发明提供一种通式II-a化合物：
Figure BDA0002508295540000241
或其药学上可接受的盐；其中：
配体是小分子RNA结合子；
T1是共价键或二价系链基团；
T2是共价键或二价系链基团；
Rmod是光激活基团；并且
RCG是点击就绪基团或拉下基团；其中每种变量如下文所定义。
在另一个方面，本发明提供一种通式II-b或II-c化合物：
Figure BDA0002508295540000242
或其药学上可接受的盐；其中：
配体是小分子RNA结合子；
T1是二价系链基团；
Rmod是光激活基团；并且
RCG是点击就绪基团或拉下基团；其中每种变量如下文所定义。
在另一个方面，本发明提供一种RNA偶联物，其包括靶RNA和式I、II、II-a或III中的任一者的化合物，其中Rmod在用可见光或紫外光照射之后与靶RNA形成共价键。在一些实施例中，本发明提供一种式IV的RNA偶联物：
Figure BDA0002508295540000251
其中配体是与靶RNA结合的小分子；
RNA代表靶RNA；
T1是二价系链基团；并且
Rmod是光激活基团；
其中每种变量如下文所定义。
在一些实施例中，本发明提供一种式V的RNA偶联物：
Figure BDA0002508295540000252
其中配体是与靶RNA结合的小分子；
RNA代表靶RNA；
T1是三价系链基团；
T2是二价系链基团；
Rmod是光激活基团；并且
RCG是点击就绪基团或拉下基团；
其中每种变量如下文所定义。
在一些实施例中，本发明提供一种式VI的RNA偶联物：
Figure BDA0002508295540000261
其中配体是与靶RNA结合的小分子；
RNA代表靶RNA；
T1是二价系链基团；
T2是共价键或二价系链基团；
Rmod是光激活基团；并且
RCG是点击就绪基团或拉下基团；
其中每种变量如下文所定义。
在一些实施例中，本发明提供一种式VI-a的RNA偶联物：
Figure BDA0002508295540000262
其中配体是与靶RNA结合的小分子；
RNA代表靶RNA；
T1是二价系链基团；
T2是共价键或二价系链基团；
Rmod是光激活基团；并且
RCG是点击就绪基团或拉下基团；
其中每种变量如下文所定义。
在另一个方面，本发明提供一种偶联物，其包括靶RNA、式II或III的化合物和拉下基团，其中Rmod与所述靶RNA形成共价键。
在一些实施例中，本发明提供一种式VII的RNA偶联物：
Figure BDA0002508295540000271
其中配体是与靶RNA结合的小分子；
RNA代表靶RNA；
T1是三价系链基团；
T2是二价系链基团；
Rmod是光激活基团；
RCP是由在RPD上的点击就绪基团与适当官能团之间的点击反应产生的反应产物；并且
RPD是拉下基团；
其中每种变量如下文所定义。在一些实施例中，RCP是
Figure BDA0002508295540000272
在一些实施例中，本发明提供一种式VIII的RNA偶联物：
Figure BDA0002508295540000281
其中配体是与靶RNA结合的小分子；
RNA代表靶RNA；
T1是二价系链基团；
T2是共价键或二价系链基团；
Rmod是光激活基团；
RCP是由在RPD上的点击就绪基团与适当官能团之间的点击反应产生的反应产物；并且
RPD是拉下基团；
其中每种变量如下文所定义。在一些实施例中，RCP是
Figure BDA0002508295540000282
在一些实施例中，本发明提供一种式VIII-a的RNA偶联物：
Figure BDA0002508295540000283
其中配体是与靶RNA结合的小分子；
RNA代表靶RNA；
T1是二价系链基团；
T2是共价键或二价系链基团；
Rmod是光激活基团；
RCP是由在RPD上的点击就绪基团与适当官能团之间的点击反应产生的反应产物；并且
RPD是拉下基团；
其中每种变量如下文所定义。在一些实施例中，RCP是
Figure BDA0002508295540000291
在一个方面，本发明提供一种式X-a化合物：
Figure BDA0002508295540000292
或其互变异构体或药学上可接受的盐，其中：
Ar1为任选地经取代的苯基或具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5-6元单环杂芳香族环；
Ar2为具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5-6元单环杂芳香族环，或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8-10元双环杂芳香族环；
X是选自二价C1-3亚烷基链，其中所述链的1-2个亚甲基单元独立地并且任选地经-O-、-NR6-、-S-、-C(O)-、-CO2-、-CS-、-C(NR6)-、-S(O)-或-S(O)2-置换；
R1是选自-C(O)R6、-CO2R、-C(O)NR2、-C1-6脂族基、-CN、-(CH2)1-3OR、-(CH2)1-3NHR、-N(R)C(O)OR6、-N(R6)C(O)R、-OC(O)R、-OR、-NHR6或-N(R)C(O)NHR；
如果R3不存在，那么R2为任选地包括点击就绪基团的光激活基团；
R3不存在或为点击就绪基团或拉下基团；
每个R6独立地为氢或为任选地经1、2、3、4、5或6个氘或卤素原子取代的C1-6烷基；
每个R独立地为氢或为选自以下的任选地经取代的基团：C1-6脂族基；3-8元饱和或部分不饱和单环碳环；苯基；8-10元双环芳香族碳环；具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-8元饱和或部分不饱和单环杂环；具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳香族环；或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元双环杂芳香族环；
L1是C1-20二价、三价或四价直链或支链烃链，其中所述链的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个亚甲基单元独立地并且任选地经天然或非天然氨基酸、-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)-、-C(O)N(R)-、-(R)NC(O)-、-OC(O)N(R)-、-(R)NC(O)O-、-N(R)C(O)N(R)-、-S-、-SO-、-SO2-、-SO2N(R)-、-(R)NSO2-、-C(S)-、-C(S)O-、-OC(S)-、-C(S)N(R)-、-(R)NC(S)-、-(R)NC(S)N(R)-或-Cy-置换；并且所述链的1-20个亚甲基单元独立地并且任选地经-OCH2CH2-置换；
每个-Cy-独立地为：任选地经取代的二价3-8元饱和或部分不饱和单环碳环；任选地经取代的亚苯基；具有1-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的4-8元饱和或部分不饱和单环杂环；具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5-6元单环杂芳香族环；具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8-10元双环或桥联双环饱和或部分不饱和杂环；或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8-10元双环或桥联双环杂芳香族环；并且
n为0或1。
在另一方面中，本发明提供一种式X-b化合物：
Figure BDA0002508295540000301
或其互变异构体或药学上可接受的盐，其中：
Ar1为任选地经取代的苯基或具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5-6元单环杂芳香族环；
Ar2为具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5-6元单环杂芳香族环，或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8-10元双环杂芳香族环；
其中Ar1或Ar2中的一者经一个R2取代；
X是选自二价C1-3亚烷基链，其中所述链的1-2个亚甲基单元独立地并且任选地经-O-、-NR6-、-S-、-C(O)-、-CO2-、-CS-、-C(NR6)-、-S(O)-或-S(O)2-置换；
R1是选自-C(O)R6、-CO2R、-C(O)NR2、-C1-6脂族基、-CN、-(CH2)1-3OR、-(CH2)1-3NHR、-N(R)C(O)OR6、-N(R6)C(O)R、-OC(O)R、-OR、-NHR6或-N(R)C(O)NHR；
如果R3不存在，那么R2为任选地包括点击就绪基团的光激活基团；
R3不存在或为点击就绪基团或拉下基团；
每个R6独立地为氢或为任选地经1、2、3、4、5或6个氘或卤素原子取代的C1-6烷基；
每个R独立地为氢或为选自以下的任选地经取代的基团：C1-6脂族基；3-8元饱和或部分不饱和单环碳环；苯基；8-10元双环芳香族碳环；具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-8元饱和或部分不饱和单环杂环；具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳香族环；或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元双环杂芳香族环；
L1是C1-20二价或三价直链或支链烃链，其中所述链的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个亚甲基单元独立地并且任选地经天然或非天然氨基酸、-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)-、-C(O)N(R)-、-(R)NC(O)-、-OC(O)N(R)-、-(R)NC(O)O-、-N(R)C(O)N(R)-、-S-、-SO-、-SO2-、-SO2N(R)-、-(R)NSO2-、-C(S)-、-C(S)O-、-OC(S)-、-C(S)N(R)-、-(R)NC(S)-、-(R)NC(S)N(R)-或-Cy-置换；并且所述链的1-20个亚甲基单元独立地并且任选地经-OCH2CH2-置换；
每个-Cy-独立地为：任选地经取代的二价3-8元饱和或部分不饱和单环碳环；任选地经取代的亚苯基；具有1-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的4-8元饱和或部分不饱和单环杂环；具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5-6元单环杂芳香族环；具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8-10元双环或桥联双环饱和或部分不饱和杂环；或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8-10元双环或桥联双环杂芳香族环；并且
n为0或1。
如在上文中一般定义，Ar1为任选地经取代的苯基或具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5-6元单环杂芳香族环。
在一些实施例中，Ar1为任选地经取代的苯基。在一些实施例中，Ar1为具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5-6元单环杂芳香族环。
在一些实施例中，Ar1为任选地经1、2、3或4个选自以下的取代基取代的苯基：卤素、-C1-6脂族基、-CN、-OR、-NR2、-CO2R、-C(O)R、-SR或-C(O)NR2。在一些实施例中，任选取代基是选自卤素、-CN、-C1-6烷基或-OMe。在一些实施例中，任选取代基是卤素。在一些实施例中，存在1个或2个取代基。在一些实施例中，Ar1是选自下表5中所描绘的那些。
如在上文中一般定义，Ar2为具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5-6元单环杂芳香族环，或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8-10元双环杂芳香族环。
在一些实施例中，Ar2为具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5-6元单环杂芳香族环。在一些实施例中，Ar2为具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8-10元双环杂芳香族环。
在一些实施例中，Ar2为任选地经取代的吡啶基、嘧啶基、咪唑基或吡咯基。在一些实施例中，Ar2为任选地经取代的吡啶基。在一些实施例中，Ar2为吡啶基。在一些实施例中，Ar2为3-吡啶基或4-吡啶基。在一些实施例中，Ar2是选自下表5中所描绘的那些。
如在上文中一般定义，X为二价C1-3亚烷基链，其中所述链的1-2个亚甲基单元独立地并且任选地经-O-、-NR6-、-S-、-C(O)-、-CO2-、-CS-、-C(NR6)-、-S(O)-或-S(O)2-置换。
在一些实施例中，X为-CH2-、-O-、-NR6-、-S-、-C(O)-、-CO2-、-CS-、-C(NR6)-、-S(O)-或-S(O)2-。在一些实施例中，X为C2亚烷基链，其中所述链的1-2亚甲基单元独立地并且任选地经-O-、-NR6-、-S-、-C(O)-、-CO2-、-CS-、-C(NR6)-、-S(O)-或-S(O)2-置换。在一些实施例中，X为C3亚烷基链，其中所述链的1-2亚甲基单元独立地并且任选地经-O-、-NR6-、-S-、-C(O)-、-CO2-、-CS-、-C(NR6)-、-S(O)-或-S(O)2-置换。
在一些实施例中，X是选自-CH2O-、CH2C(O)-、-C(O)CH2-、-CH2C(O)O-、-C(O)CH2O-、-C(O)O-、-C(O)N(R6)-、-CH2N(R6)-或-N(R6)C(O)-。在一些实施例中，X为-OCH2-或-CH2O-。在一些实施例中，X是选自下表5中所描绘的那些。
如在上文中一般定义，R1是选自-C(O)R6、-CO2R、-C(O)NR2、-C1-6脂族基、-CN、-(CH2)1-3OR、-(CH2)1-3NHR、-N(R)C(O)OR6、-N(R6)C(O)R、-OC(O)R、-OR、-NHR6或-N(R)C(O)NHR。
在一些实施例中，R1为-C(O)R6。在一些实施例中，R1为-CO2R。在一些实施例中，R1为-C(O)NR2。在一些实施例中，R1为C1-6脂族基。在一些实施例中，R1为-CN。在一些实施例中，R1为-(CH2)1-3OR。在一些实施例中，R1为-(CH2)1-3NHR。在一些实施例中，R1为-N(R)C(O)OR6。在一些实施例中，R1为-N(R6)C(O)R。在一些实施例中，R1为-OC(O)R。在一些实施例中，R1为-OR。在一些实施例中，R1为-NHR6。在一些实施例中，R1为-N(R)C(O)NHR。在一些实施例中，R1是选自下表5中所描绘的那些。
如在上文中一般定义，如果R3不存在，那么R2为任选地包括点击就绪基团的光激活基团。在一些实施例中，R2为光激活基团。在一些实施例中，R2为进一步经点击就绪基团取代的光激活基团。
在一些实施例中，R2为一旦用紫外线(UV)辐射照射，就产生自由基、芳基或杂芳基碳阳离子、氮烯或碳烯中间体的官能团，并且如果R3不存在，那么其任选地经点击就绪基团或拉下基团取代。在一些实施例中，R2为任选地经取代的苯基或8-10元双环芳香族碳环叠氮化物或5-8元杂芳基或8-10元双环杂芳基叠氮化物；任选地经取代的苯甲酰基叠氮化物或5-8元杂芳酰基叠氮化物或8-10元杂芳酰基叠氮化物，其中环原子中的1-3个原子是选自氮、硫或氧；任选地经取代的苯基或8-10元双环芳香族碳环重氮盐；任选地经取代的5-8元杂芳基或8-10元双环杂芳基重氮盐，其中环原子中的1-3个原子是选自氮、硫或氧；任选地经取代的C2-6脂肪族重氮官能团；任选地经取代的C2-6脂肪族双吖丙啶；或任选地经取代的二苯基或8-10元二杂芳基酮，其中环原子中的1-3个原子是选自氮、硫或氧；任选地经取代的二氢芘；任选地经取代的螺噁嗪；任选地经取代的蒽；任选地经取代的俘精酸酐(fulgide)；任选地经取代的螺吡喃；任选地经取代的α-吡喃酮或任选地经取代的嘧啶酮；并且其任选地经点击就绪基团或拉下基团取代。在一些实施例中，点击就绪基团为C1-6烷基叠氮化物或炔烃。在一些实施例中，R2是选自
Figure BDA0002508295540000331
Figure BDA0002508295540000341
其中Y-为药学上可接受的阴离子。
在一些实施例中，R2是选自下表5中所描绘的那些。
如在上文中一般定义，R3不存在或为点击就绪基团或拉下基团。在一些实施例中，R3不存在。在一些实施例中，R3为点击就绪基团。在一些实施例中，R3为拉下基团。在一些实施例中，R3为C1-6烷基叠氮化物、C1-6炔烃或生物素。
在一些实施例中，R3是选自下表5中所描绘的那些。
如在上文中一般定义，每个R6独立地为氢或为任选地经1、2、3、4、5或6个氘或卤素原子取代的C1-6烷基。
在一些实施例中，R6为氢。在一些实施例中，R6为任选地经1、2、3、4、5或6个氘或卤素原子取代的C1-6烷基。
在一些实施例中，R6为任选地经1、2或3个卤素原子取代的C1-3烷基。
在一些实施例中，R6是选自下表5中所描绘的那些。
如在上文中一般定义，L1为C1-20二价或三价直链或支链烃链，其中所述链的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个亚甲基单元独立地并且任选地经天然或非天然氨基酸、-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)-、-C(O)N(R)-、-(R)NC(O)-、-OC(O)N(R)-、-(R)NC(O)O-、-N(R)C(O)N(R)-、-S-、-SO-、-SO2-、-SO2N(R)-、-(R)NSO2-、-C(S)-、-C(S)O-、-OC(S)-、-C(S)N(R)-、-(R)NC(S)-、-(R)NC(S)N(R)-或-Cy-置换；并且所述链的1-20个亚甲基单元独立地并且任选地经-OCH2CH2-置换。
在一些实施例中，L1为C1-10二价或三价直链或支链烃链，其中所述链的1、2、3、4或5个亚甲基单元独立地并且任选地经天然或非天然氨基酸、-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)-、-C(O)N(R)-、-(R)NC(O)-、-OC(O)N(R)-、-(R)NC(O)O-、-N(R)C(O)N(R)-、-S-、-SO-、-SO2-、-SO2N(R)-、-(R)NSO2-、-C(S)-、-C(S)O-、-OC(S)-、-C(S)N(R)-、-(R)NC(S)-、-(R)NC(S)N(R)-或-Cy-置换；并且所述链的1-5个亚甲基单元独立地并且任选地经-OCH2CH2-置换。在一些实施例中，L1包括1-3个天然氨基酸。在一些实施例中，氨基酸是选自脯氨酸、赖氨酸、甘氨酸或丙氨酸。在一些实施例中，L1包括选自1,2,3-亚三唑基或1,2,4-亚三唑基的1-2个-Cy-基团。在一些实施例中，L1包括1-10、1-8、1-6、1-4、1-3、1-2、1、2或3个-OCH2CH2-单元。
在一些实施例中，L1是选自下表5中所描绘的那些。
如在上文中一般定义，每个-Cy-独立地为：任选地经取代的二价3-8元饱和或部分不饱和单环碳环；任选地经取代的亚苯基；具有1-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的4-8元饱和或部分不饱和单环杂环；具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5-6元单环杂芳香族环；具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8-10元双环或桥联双环饱和或部分不饱和杂环；或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8-10元双环或桥联双环杂芳香族环。
在一些实施例中，-Cy-为任选地经取代的二价3-8元饱和或部分不饱和单环碳环。在一些实施例中，-Cy-为任选地经取代的亚苯基。在一些实施例中，-Cy-为具有1-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的4-8元饱和或部分不饱和单环杂环。在一些实施例中，-Cy-为具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5-6元单环杂芳香族环。在一些实施例中，-Cy-为具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8-10元双环或桥接双环饱和或部分不饱和杂环。在一些实施例中，-Cy-为具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8-10元双环或桥联双环杂芳香族环。
在一些实施例中，-Cy-为亚苯基、亚吡啶基、亚嘧啶基、1,2,3-亚三唑基或1,2,4-亚三唑基。
在一些实施例中，-Cy-是选自下表5中所描绘的那些。
如在上文中一般定义，n为0或1。
在一些实施例中，n为0。在一些实施例中，n为1。
在另一个方面，本发明提供一种式XXV化合物：
Figure BDA0002508295540000351
或其药学上可接受的盐，其中：
Ar1为任选地经取代的苯基或具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5-6元单环杂芳香族环；
Ar3为任选地经取代的苯基；具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5-6元单环杂芳香族环；任选地经取代的8-12元双环芳香族环或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8-10元双环杂芳香族环；
X是选自二价C1-3亚烷基链，其中所述链的1-2个亚甲基单元独立地并且任选地经-O-、-NR6-、-S-、-C(O)-、-CO2-、-CS-、-C(NR6)-、-S(O)-或-S(O)2-置换；
X2是选自二价C1-3亚烷基链，其中所述链的1-2个亚甲基单元独立地并且任选地经-O-、-NR6-、-S-、-C(O)-、-CO2-、-CS-、-C(NR6)-、-S(O)-或-S(O)2-置换；
如果R3不存在，那么R2为任选地包括点击就绪基团的光激活基团；
R3不存在或为点击就绪基团或拉下基团；
每个R4独立地为R、卤素、-CN、-NO2、-OR、-SR、-NR2、-S(O)2R、-S(O)2NR2、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2、-N(R)S(O)2R或-N(R)S(O)2NR2；或R4的两个例子可以与其所附接的原子一起形成C4-8部分不饱和碳环；
每个R5独立地为R、卤素、-CN、-NO2、-OR、-SR、-NR2、-S(O)2R、-S(O)2NR2、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2、-N(R)S(O)2R或-N(R)S(O)2NR2；或R5的两个例子可以一起形成＝O或＝S；
每个R6独立地为氢或为任选地经1、2、3、4、5或6个氘或卤素原子取代的C1-6烷基；
每个R独立地为氢或为选自以下的任选地经取代的基团：C1-6脂族基；3-8元饱和或部分不饱和单环碳环；苯基；8-10元双环芳香族碳环；具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-8元饱和或部分不饱和单环杂环；具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳香族环；或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元双环杂芳香族环；
L2为C1-20任选地经取代的二价或三价直链或支链烃链，其中所述链的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个亚甲基单元独立地并且任选地经天然或非天然氨基酸、-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)-、-C(O)N(R)-、-(R)NC(O)-、-OC(O)N(R)-、-(R)NC(O)O-、-N(R)C(O)N(R)-、-S-、-SO-、-SO2-、-SO2N(R)-、-(R)NSO2-、-C(S)-、-C(S)O-、-OC(S)-、-C(S)N(R)-、-(R)NC(S)-、-(R)NC(S)N(R)-或-Cy-置换；并且所述链的1-20个亚甲基单元独立地并且任选地经-OCH2CH2-置换；
每个-Cy-独立地为：任选地经取代的二价3-8元饱和或部分不饱和单环碳环；任选地经取代的亚苯基；具有1-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的4-8元饱和或部分不饱和单环杂环；具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5-6元单环杂芳香族环；具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8-10元双环或桥联双环饱和或部分不饱和杂环；或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8-10元双环或桥联双环杂芳香族环；
m为0、1、2、3或4；并且
p为0、1、2、3或4。
在另一个方面，本发明提供一种式XXVI化合物：
Figure BDA0002508295540000371
或其药学上可接受的盐，其中：
Ar1为任选地经取代的苯基或具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5-6元单环杂芳香族环；
Ar3为任选地经取代的苯基；具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5-6元单环杂芳香族环；任选地经取代的8-12元双环芳香族环或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8-10元双环杂芳香族环；
X是选自二价C1-3亚烷基链，其中所述链的1-2个亚甲基单元独立地并且任选地经-O-、-NR6-、-S-、-C(O)-、-CO2-、-CS-、-C(NR6)-、-S(O)-或-S(O)2-置换；
X2是选自二价C1-3亚烷基链，其中所述链的1-2个亚甲基单元独立地并且任选地经-O-、-NR6-、-S-、-C(O)-、-CO2-、-CS-、-C(NR6)-、-S(O)-或-S(O)2-置换；
如果R3不存在，那么R2为任选地包括点击就绪基团的光激活基团；
R3不存在或为点击就绪基团或拉下基团；
每个R4独立地为R、卤素、-CN、-NO2、-OR、-SR、-NR2、-S(O)2R、-S(O)2NR2、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2、-N(R)S(O)2R或-N(R)S(O)2NR2；或R4的两个例子可以与其所附接的原子一起形成C4-8部分不饱和碳环；
每个R5独立地为R、卤素、-CN、-NO2、-OR、-SR、-NR2、-S(O)2R、-S(O)2NR2、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2、-N(R)S(O)2R或-N(R)S(O)2NR2；或R5的两个例子可以一起形成＝O或＝S；
每个R6独立地为氢或为任选地经1、2、3、4、5或6个氘或卤素原子取代的C1-6烷基；
每个R7独立地为R、卤素、-CN、-NO2、-OR、-SR、-NR2、-S(O)2R、-S(O)2NR2、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2、-N(R)S(O)2R或-N(R)S(O)2NR2；或R4的两个例子可以与其所附接的原子一起形成C4-8部分不饱和碳环；
每个R独立地为氢或为选自以下的任选地经取代的基团：C1-6脂族基；3-8元饱和或部分不饱和单环碳环；苯基；8-10元双环芳香族碳环；具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-8元饱和或部分不饱和单环杂环；具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳香族环；或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元双环杂芳香族环；
L2为C1-20任选地经取代的二价或三价直链或支链烃链，其中所述链的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个亚甲基单元独立地并且任选地经天然或非天然氨基酸、-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)-、-C(O)N(R)-、-(R)NC(O)-、-OC(O)N(R)-、-(R)NC(O)O-、-N(R)C(O)N(R)-、-S-、-SO-、-SO2-、-SO2N(R)-、-(R)NSO2-、-C(S)-、-C(S)O-、-OC(S)-、-C(S)N(R)-、-(R)NC(S)-、-(R)NC(S)N(R)-或-Cy-置换；并且所述链的1-20个亚甲基单元独立地并且任选地经-OCH2CH2-置换；
每个-Cy-独立地为：任选地经取代的二价3-8元饱和或部分不饱和单环碳环；任选地经取代的亚苯基；具有1-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的4-8元饱和或部分不饱和单环杂环；具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5-6元单环杂芳香族环；具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8-10元双环或桥联双环饱和或部分不饱和杂环；或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8-10元双环或桥联双环杂芳香族环；
m为0、1、2、3或4；并且
p为0、1、2、3或4。
如在上文中一般定义，Ar1为任选地经取代的苯基或具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5-6元单环杂芳香族环。
在一些实施例中，Ar1为任选地经取代的苯基。在一些实施例中，Ar1为具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5-6元单环杂芳香族环。
在一些实施例中，Ar1为任选地经1、2、3或4个选自以下的取代基取代的苯基：卤素、-C1-6脂族基、-CN、-OR、-NR2、-CO2R、-C(O)R、-SR或-C(O)NR2。在一些实施例中，任选取代基是选自卤素、-CN、-C1-6烷基或-OMe。在一些实施例中，任选取代基中的至少一个为C1-6烷基。在一些实施例中，存在1、2或3个取代基。在一些实施例中，Ar1是选自下表5中所描绘的那些。
如在上文中一般定义，Ar3为任选地经取代的苯基；具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5-6元单环芳香族环；任选地经取代的8-12元双环芳香族环；或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8-10元双环芳香族环。
在一些实施例中，Ar3为任选地经取代的苯基。在一些实施例中，Ar3为具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5-6元单环杂芳香族环。在一些实施例中，Ar3为任选地经取代的8-12元双环芳香族碳环。在一些实施例中，Ar3为具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8-10元双环杂芳香族环。
在一些实施例中，Ar3为任选地经取代的吡啶基、嘧啶基、咪唑基或吡咯基。在一些实施例中，Ar3为任选地经取代的吡啶基。在一些实施例中，Ar3为吡啶基。在一些实施例中，任选取代基是选自卤素、-C1-6脂族基、-CN、-OR、-NR2、-CO2R、-C(O)R、-SR或-C(O)NR2。
在一些实施例中，Ar3为任选地经1、2、3或4个选自以下的取代基取代的苯基：卤素、-C1-6脂族基、-CN、-OR、-NR2、-CO2R、-C(O)R、-SR或-C(O)NR2。在一些实施例中，任选取代基是选自卤素、-CN、-C1-6烷基或-OMe。在一些实施例中，任选取代基中的至少一个为卤素。在一些实施例中，存在1、2或3个取代基。在一些实施例中，Ar3为经3个选自以下的取代基取代的苯基：卤素、C1-6脂族基和-OR。在一些实施例中，Ar3是选自下表5中所描绘的那些。
如在上文中一般定义，X是选自二价C1-3亚烷基链，其中所述链的1-2个亚甲基单元独立地并且任选地经-O-、-NR6-、-S-、-C(O)-、-CO2-、-CS-、-C(NR6)-、-S(O)-或-S(O)2-置换。
在一些实施例中，X为二价C1-3亚烷基链，其中所述链的1-2个亚甲基单元独立地并且任选地经-O-、-NR6-、-S-、-C(O)-、-CO2-、-CS-、-C(NR6)-、-S(O)-或-S(O)2-置换。在一些实施例中，X为-O-、-NR6-、-S-、-C(O)-、-CO2-、-CS-、-C(NR6)-、-S(O)-或-S(O)2-(即，C1亚烷基，其中亚甲基单元经-O-、-NR6-等置换)。在一些实施例中，X为二价C1-2亚烷基链，其中所述链的一个亚甲基单元独立地并且任选地经-O-、-NR6-、-S-、-C(O)-、-CO2-、-CS-、-C(NR6)-、-S(O)-或-S(O)2-置换。在一些实施例中，X为-O-、-C(O)-、-C(O)-O-、-O-C(O)-、-NH-C(O)-或-C(O)-NH-。在一些实施例中，X是选自下表5中所描绘的那些。
如在上文中一般定义，X2是选自二价C1-3亚烷基链，其中所述链的1-2个亚甲基单元独立地并且任选地经-O-、-NR6-、-S-、-C(O)-、-CO2-、-CS-、-C(NR6)-、-S(O)-或-S(O)2-置换。
在一些实施例中，X2为二价C1-3亚烷基链，其中所述链的1-2个亚甲基单元独立地并且任选地经-O-、-NR6-、-S-、-C(O)-、-CO2-、-CS-、-C(NR6)-、-S(O)-或-S(O)2-置换。在一些实施例中，X2为-O-、-NR6-、-S-、-C(O)-、-CO2-、-CS-、-C(NR6)-、-S(O)-或-S(O)2-(即，C1亚烷基，其中亚甲基单元经-O-、-NR6-等置换)。在一些实施例中，X2为二价C1-2亚烷基链，其中所述链的一个亚甲基单元独立地并且任选地经-O-、-NR6-、-S-、-C(O)-、-CO2-、-CS-、-C(NR6)-、-S(O)-或-S(O)2-置换。在一些实施例中，X2为-CH2-NH-、-NH-CH2-、-OCH2-、-CH2O-、-O-、-C(O)-、-C(O)-O-、-O-C(O)-、-NH-C(O)-或-C(O)-NH-。在一些实施例中，X2是选自下表5中所描绘的那些。
如在上文中一般定义，如果R3不存在，那么R2为任选地包括点击就绪基团的光激活基团。在一些实施例中，R2为光激活基团。在一些实施例中，R2为进一步经点击就绪基团取代的光激活基团。
在一些实施例中，R2为一旦用紫外线(UV)辐射照射，就产生自由基、芳基或杂芳基碳阳离子、氮烯或碳烯中间体的官能团，并且如果R3不存在，那么其任选地经点击就绪基团或拉下基团取代。在一些实施例中，R2为任选地经取代的苯基或8-10元双环芳香族碳环叠氮化物或5-8元杂芳基或8-10元双环杂芳基叠氮化物；任选地经取代的苯甲酰基叠氮化物或5-8元杂芳酰基叠氮化物或8-10元杂芳酰基叠氮化物，其中环原子中的1-3个原子是选自氮、硫或氧；任选地经取代的苯基或8-10元双环芳香族碳环重氮盐；任选地经取代的5-8元杂芳基或8-10元双环杂芳基重氮盐，其中环原子中的1-3个原子是选自氮、硫或氧；任选地经取代的C2-6脂肪族重氮官能团；任选地经取代的C2-6脂肪族双吖丙啶；或任选地经取代的二苯基或8-10元二杂芳基酮，其中环原子中的1-3个原子是选自氮、硫或氧；任选地经取代的二氢芘；任选地经取代的螺噁嗪；任选地经取代的蒽；任选地经取代的俘精酸酐；任选地经取代的螺吡喃；任选地经取代的α-吡喃酮或任选地经取代的嘧啶酮；并且其任选地经点击就绪基团或拉下基团取代。在一些实施例中，点击就绪基团为C1-6烷基叠氮化物或炔烃。在一些实施例中，R2是选自
Figure BDA0002508295540000411
Figure BDA0002508295540000412
其中Y-为药学上可接受的阴离子。
在一些实施例中，R2是选自下表5中所描绘的那些。
如在上文中一般定义，R3不存在或为点击就绪基团或拉下基团。在一些实施例中，R3不存在。在一些实施例中，R3为点击就绪基团。在一些实施例中，R3为拉下基团。在一些实施例中，R3为C1-6烷基叠氮化物、C1-6炔烃或半抗原，如生物素。
在一些实施例中，R3是选自下表5中所描绘的那些。
如在上文中一般定义，每个R4独立地为R、卤素、-CN、-NO2、-OR、-SR、-NR2、-S(O)2R、-S(O)2NR2、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2、-N(R)S(O)2R或-N(R)S(O)2NR2；或R4的两个例子可以与其所附接的原子一起形成C4-8部分不饱和碳环。
在一些实施例中，R4为R。在一些实施例中，R4为卤素。在一些实施例中，R4为-CN。在一些实施例中，R4为-NO2。在一些实施例中，R4为-OR。在一些实施例中，R4为-SR。在一些实施例中，R4为-NR2。在一些实施例中，R4为-S(O)2R。在一些实施例中，R4为-S(O)2NR2。在一些实施例中，R4为-S(O)R。在一些实施例中，R4为-C(O)R。在一些实施例中，R4为-C(O)OR。在一些实施例中，R4为-C(O)NR2。在一些实施例中，R4为-C(O)N(R)OR。在一些实施例中，R4为-OC(O)R。在一些实施例中，R4为-OC(O)NR2。在一些实施例中，R4为-N(R)C(O)OR。在一些实施例中，R4为-N(R)C(O)R。在一些实施例中，R4为-N(R)C(O)NR2。在一些实施例中，R4为-N(R)S(O)2R。在一些实施例中，R4为-N(R)S(O)2NR2。在一些实施例中，R4的两个例子与其所附接的原子一起形成C4-8部分不饱和碳环。
在一些实施例中，R4为氢；C1-6脂族基；3-8元饱和或部分不饱和单环碳环；苯基；8-10元双环芳香族碳环；具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-8元饱和或部分不饱和单环杂环；具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳香族环；具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元双环杂芳香族环；卤素；-CN；-NO2；-OR；-SR；-NR2；-S(O)2R；-S(O)2NR2；-S(O)R；-C(O)R；-C(O)OR；-C(O)NR2；-OC(O)R或-N(R)C(O)R。
在一些实施例中，R4为氢；任选地经1、2、3、4、5或6个氘或卤素原子取代的C1-6烷基；3-8元饱和或部分不饱和单环碳环；苯基；具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-8元饱和或部分不饱和单环杂环；具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳香族环；卤素；-CN；-OR；-NR2；-S(O)2NR2；-C(O)R；-C(O)OR；-C(O)NR2；-OC(O)R或-N(R)C(O)R。在一些实施例中，R4为氢、C1-6烷基、苯基、卤素、-CN、-OR或-NR2。在一些实施例中，R4是选自下表5中所描绘的那些。
如在上文中一般定义，每个R5独立地为R、卤素、-CN、-NO2、-OR、-SR、-NR2、-S(O)2R、-S(O)2NR2、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2、-N(R)S(O)2R或-N(R)S(O)2NR2；或R5的两个例子可以一起形成＝O或＝S。
在一些实施例中，R5为R。在一些实施例中，R5为卤素。在一些实施例中，R5为-CN。在一些实施例中，R5为-NO2。在一些实施例中，R5为-OR。在一些实施例中，R5为-SR。在一些实施例中，R5为-NR2。在一些实施例中，R5为-S(O)2R。在一些实施例中，R5为-S(O)2NR2。在一些实施例中，R5为-S(O)R。在一些实施例中，R5为-C(O)R。在一些实施例中，R5为-C(O)OR。在一些实施例中，R5为-C(O)NR2。在一些实施例中，R5为-C(O)N(R)OR。在一些实施例中，R5为-OC(O)R。在一些实施例中，R5为-OC(O)NR2。在一些实施例中，R5为-N(R)C(O)OR。在一些实施例中，R5为-N(R)C(O)R。在一些实施例中，R5为-N(R)C(O)NR2。在一些实施例中，R5为-N(R)S(O)2R。在一些实施例中，R5为-N(R)S(O)2NR2。在一些实施例中，R5的两个例子一起形成＝O或＝S。
在一些实施例中，R5为氢；C1-6脂族基；3-8元饱和或部分不饱和单环碳环；苯基；8-10元双环芳香族碳环；具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-8元饱和或部分不饱和单环杂环；具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳香族环；具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元双环杂芳香族环；卤素；-CN；-NO2；-OR；-SR；-NR2；-S(O)2R；-S(O)2NR2；-S(O)R；-C(O)R；-C(O)OR；-C(O)NR2；-OC(O)R或-N(R)C(O)R。
在一些实施例中，R5为；任选地经取代1、2、3、4、5或6个氘或卤素原子取代的C1-6烷基；3-8元饱和或部分不饱和单环碳环；苯基；具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-8元饱和或部分不饱和单环杂环；具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳香族环；卤素；-CN；-OR；-NR2；-S(O)2NR2；-C(O)R；-C(O)OR；-C(O)NR2；-OC(O)R或-N(R)C(O)R。在一些实施例中，R5为氢、C1-6烷基、苯基、卤素、-CN、-OR或-NR2。
如在上文中一般定义，每个R6独立地为氢或为任选地经1、2、3、4、5或6个氘或卤素原子取代的C1-6烷基。
在一些实施例中，R6为氢。在一些实施例中，R6为任选地经1、2、3、4、5或6个氘或卤素原子取代的C1-6烷基。
在一些实施例中，R6为任选地经1、2或3个卤素原子取代的C1-3烷基。
在一些实施例中，R6是选自下表5中所描绘的那些。
如在上文中一般定义，每个R7独立地为R、卤素、-CN、-NO2、-OR、-SR、-NR2、-S(O)2R、-S(O)2NR2、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2、-N(R)S(O)2R或-N(R)S(O)2NR2；或R7的两个例子可以与其所附接的原子一起形成C4-8部分不饱和碳环。
在一些实施例中，R7为R。在一些实施例中，R7为卤素。在一些实施例中，R7为-CN。在一些实施例中，R7为-NO2。在一些实施例中，R7为-OR。在一些实施例中，R7为-SR。在一些实施例中，R7为-NR2。在一些实施例中，R7为-S(O)2R。在一些实施例中，R7为-S(O)2NR2。在一些实施例中，R7为-S(O)R。在一些实施例中，R7为-C(O)R。在一些实施例中，R7为-C(O)OR。在一些实施例中，R7为-C(O)NR2。在一些实施例中，R7为-C(O)N(R)OR。在一些实施例中，R7为-OC(O)R。在一些实施例中，R7为-OC(O)NR2。在一些实施例中，R7为-N(R)C(O)OR。在一些实施例中，R7为-N(R)C(O)R。在一些实施例中，R7为-N(R)C(O)NR2。在一些实施例中，R7为-N(R)S(O)2R。在一些实施例中，R7为-N(R)S(O)2NR2。在一些实施例中，R7的两个例子与其所附接的原子一起形成C4-8部分不饱和碳环。
在一些实施例中，R7为氢；C1-6脂族基；3-8元饱和或部分不饱和单环碳环；苯基；8-10元双环芳香族碳环；具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-8元饱和或部分不饱和单环杂环；具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳香族环；具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元双环杂芳香族环；卤素；-CN；-NO2；-OR；-SR；-NR2；-S(O)2R；-S(O)2NR2；-S(O)R；-C(O)R；-C(O)OR；-C(O)NR2；-OC(O)R或-N(R)C(O)R。
在一些实施例中，R7为氢；任选地经1、2、3、4、5或6个氘或卤素原子取代的C1-6烷基；3-8元饱和或部分不饱和的单环碳环；苯基；具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-8元饱和或部分不饱和单环杂环；具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳香族环；卤素；-CN；-OR；-NR2；-S(O)2NR2；-C(O)R；-C(O)OR；-C(O)NR2；-OC(O)R或-N(R)C(O)R。在一些实施例中，R7为氢、C1-6烷基、苯基、卤素、-CN、-OR或-NR2。在一些实施例中，R7是选自下表5中所描绘的那些。
如在上文中一般定义，L2为C1-20任选地经取代的二价或三价直链或支链烃链，其中所述链的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个亚甲基单元独立地并且任选地经天然或非天然氨基酸、-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)-、-C(O)N(R)-、-(R)NC(O)-、-OC(O)N(R)-、-(R)NC(O)O-、-N(R)C(O)N(R)-、-S-、-SO-、-SO2-、-SO2N(R)-、-(R)NSO2-、-C(S)-、-C(S)O-、-OC(S)-、-C(S)N(R)-、-(R)NC(S)-、-(R)NC(S)N(R)-或-Cy-置换；并且所述链的1-20个亚甲基单元独立地并且任选地经-OCH2CH2-置换。
在一些实施例中，L2为C1-10任选地经取代的二价或三价直链或支链烃链，其中所述链的1、2、3、4或5个亚甲基单元独立地并且任选地经天然或非天然氨基酸、-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)-、-C(O)N(R)-、-(R)NC(O)-、-OC(O)N(R)-、-(R)NC(O)O-、-N(R)C(O)N(R)-、-S-、-SO-、-SO2-、-SO2N(R)-、-(R)NSO2-、-C(S)-、-C(S)O-、-OC(S)-、-C(S)N(R)-、-(R)NC(S)-、-(R)NC(S)N(R)-或-Cy-置换；并且所述链的1-5个亚甲基单元独立地并且任选地经-OCH2CH2-置换。在一些实施例中，L2包括1-3个天然氨基酸。在一些实施例中，氨基酸是选自脯氨酸、赖氨酸、甘氨酸或丙氨酸。在一些实施例中，L2包括选自1,2,3-亚三唑基或1,2,4-亚三唑基的1-2个-Cy-基团。在一些实施例中，L2包括1-10、1-8、1-6、1-4、1-3、1-2、1、2或3个-OCH2CH2-单元。
在一些实施例中，L2为C1-20任选地经取代的二价或三价直链或支链烃链，其中所述链的1、2、3、4或5个亚甲基单元独立地并且任选地经-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)-、-C(O)N(R)-、-(R)NC(O)-、-S-、-SO-、-SO2-、-C(S)-或-Cy-置换；并且所述链的1-20个亚甲基单元独立地并且任选地经-OCH2CH2-置换。
在一些实施例中，L2为C1-20任选地经取代的二价或三价直链烃链，其中所述链的1、2、3、4或5个亚甲基单元独立地并且任选地经-O-、-C(O)-、-N(R)-或-Cy-置换；并且所述链的1-20个亚甲基单元独立地并且任选地经-OCH2CH2-置换。
在一些实施例中，所述链的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个亚甲基单元经-OCH2CH2-置换。在一些实施例中，所述链的1、2、3、4、5、6、7或8；或1、2、3、4或5个亚甲基单元经-OCH2CH2-置换。
在一些实施例中，L2是选自下表5中所描绘的那些。
如在上文中一般定义，每个-Cy-独立地为：任选地经取代的二价3-8元饱和或部分不饱和单环碳环；任选地经取代的亚苯基；具有1-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的4-8元饱和或部分不饱和单环杂环；具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5-6元单环杂芳香族环；具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8-10元双环或桥联双环饱和或部分不饱和杂环；或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8-10元双环或桥联双环杂芳香族环。
在一些实施例中，-Cy-为任选地经取代的二价3-8元饱和或部分不饱和单环碳环。在一些实施例中，-Cy-为任选地经取代的亚苯基。在一些实施例中，-Cy-为具有1-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的4-8元饱和或部分不饱和单环杂环。在一些实施例中，-Cy-为具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5-6元单环杂芳香族环。在一些实施例中，-Cy-为具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8-10元双环或桥接双环饱和或部分不饱和杂环。在一些实施例中，-Cy-为具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8-10元双环或桥联双环杂芳香族环。
在一些实施例中，-Cy-为亚苯基、亚吡啶基、亚嘧啶基、1,2,3-亚三唑基或1,2,4-亚三唑基。
在一些实施例中，-Cy-是选自下表5中所描绘的那些。
如在上文中一般定义，m为0、1、2、3或4。在一些实施例中，m为0。在一些实施例中，m为1。在一些实施例中，m为2。在一些实施例中，m为3。在一些实施例中，m为4。在一些实施例中，m为0、1、2或3。在一些实施例中，m为0、1或2。在一些实施例中，m为1或2。
如在上文中一般定义，p为0、1、2、3或4。在一些实施例中，p为0。在一些实施例中，p为1。在一些实施例中，p为2。在一些实施例中，p为3。在一些实施例中，p为4。在一些实施例中，p为0、1、2或3。在一些实施例中，p为0、1或2。在一些实施例中，p为1或2。
在一些实施例中，本发明提供一种式X-c、X-d、X-e或X-f化合物：
Figure BDA0002508295540000461
或其互变异构体或药学上可接受的盐，其中Ar1、Ar2、X、L1、R1、R2、R3、R6、R、-Cy-和n中的每一者如上文所定义并且如在本文的实施例中单独和以组合形式所描述。
在一些实施例中，本发明提供一种式XI或XII化合物：
Figure BDA0002508295540000462
或其互变异构体或药学上可接受的盐，其中Ar1、Ar2、X、L1、R1、R2、R3、R6、R、-Cy-和n中的每一者如上文所定义并且如在本文的实施例中单独和以组合形式所描述。
在一些实施例中，本发明提供一种式XIII化合物：
Figure BDA0002508295540000471
或其互变异构体或药学上可接受的盐，其中Ar1、Ar2、R1、R2、R6、R和-Cy-中的每一者如上文所定义并且如在本文的实施例中单独和以组合形式所描述。
在一些实施例中，本发明提供一种式XIV化合物：
Figure BDA0002508295540000472
或其互变异构体或药学上可接受的盐，其中X、L1、R1、R2、R3、R6、R、-Cy-和n中的每一者如上文所定义并且如在本文的实施例中单独和以组合形式所描述。
在一些实施例中，本发明提供一种式XV化合物：
Figure BDA0002508295540000473
或其互变异构体或药学上可接受的盐，其中X、L1、R1、R2、R3、R6、R、-Cy-和n中的每一者如上文所定义并且如在本文的实施例中单独和以组合形式所描述。
在一些实施例中，本发明提供一种式XVI、XVII、XVIII或XIX化合物：
Figure BDA0002508295540000481
或其互变异构体或药学上可接受的盐，其中L1、R1、R2、R3、R6、R、-Cy-和n中的每一者如上文所定义并且如在本文的实施例中单独和以组合形式所描述。
在一些实施例中，本发明提供一种式XX、XXI、XXII、XXIII或XXIV化合物：
Figure BDA0002508295540000482
Figure BDA0002508295540000491
或其互变异构体或药学上可接受的盐，其中R2、R3、R6、R、-Cy-和n中的每一者如上文所定义并且如在本文的实施例中单独和以组合形式所描述。
在一些实施例中，本发明提供一种式XXVII或XXVIII化合物：
Figure BDA0002508295540000492
或其药学上可接受的盐，其中Ar1、Ar3、X、X2、L2、R2、R3、R4、R5、R6、R、-Cy-、m和p中的每一者如上文所定义并且如在本文的实施例中单独和以组合形式所描述。
在一些实施例中，本发明提供一种式XXIX、XXX、XXXI、XXXII或XXXIII化合物：
Figure BDA0002508295540000501
或其药学上可接受的盐，其中X、X2、L2、R2、R3、R4、R6、R、-Cy-和m中的每一者如上文所定义并且如在本文的实施例中单独和以组合形式所描述。
在一些实施例中，本发明提供一种式XXXIV、XXXV、XXXVI或XXXVII化合物：
Figure BDA0002508295540000502
Figure BDA0002508295540000511
或其药学上可接受的盐，其中Ar1、Ar3、X、X2、L2、R2、R3、R4、R6、R7、R、-Cy-、m和p中的每一者如上文所定义并且如在本文的实施例中单独和以组合形式所描述。
在一些实施例中，本发明提供一种式XXXVIII、XXXIX、XL、XLI或XLII化合物：
Figure BDA0002508295540000512
Figure BDA0002508295540000521
或其药学上可接受的盐，其中X、L2、R2、R3、R4、R6、R7、R、-Cy-、m和p中的每一者如上文所定义并且如在本文的实施例中单独和以组合形式所描述。
本发明的示例性化合物阐述于下表5中。
表5：示例性化合物
Figure BDA0002508295540000522
Figure BDA0002508295540000531
Figure BDA0002508295540000541
Figure BDA0002508295540000551
Figure BDA0002508295540000561
Figure BDA0002508295540000571
Figure BDA0002508295540000581
Figure BDA0002508295540000591
在一些实施例中，本发明提供一种上表1中阐述的化合物或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，化合物或偶联物是选自图1-44中展示的那些化学式或其药学上可接受的盐、立体异构体或互变异构体。
小分子RNA配体
能够结合RNA的新颖小分子配体的设计和合成在很大程度上代表未被开发的治疗潜力。在一些实施例中，小分子配体是选自已知与RNA结合的化合物，如杂芳基二氢嘧啶(HAP)、大环内酯(例如红霉素(erythromycin)、阿奇霉素(azithromycin))、生物碱(例如黄连素(berberine)、巴马亭(palmatine))、氨基糖苷(例如巴龙霉素(paromomycin)、新霉素B(neomycin B)、卡那霉素A(kanamycin A))、四环素(例如多西环素(doxycycline)、土霉素(oxytetracycline))、茶碱、瑞博希、克林霉素(Clindamycin)、氯霉素(chloramphenicol)、LMI070、基于三蝶烯的骨架、噁唑烷酮(例如利奈唑胺、特地唑胺)或CPNQ。
在一些实施例中，小分子配体为瑞博希，其具有以下结构：
Figure BDA0002508295540000601
或其药学上可接受的盐。瑞博希为与FMN核糖开关(PDB 5KX9)结合并且抑制核糖开关功能的药物样配体(自然2015,526,672-677)。
在一些实施例中，小分子配体为噁唑烷酮，如利奈唑胺、特地唑胺、依哌唑胺(eperezolid)或PNU 176798。示例性基于噁唑烷酮的光探针描述于例如马塔索瓦,N.B.(Matassova,N.B.)等人,RNA(1999),5:939-946；利奇,K.L.(Leach,K.L.)等人,分子细胞(Molecular Cell)2007,26,393-402；科尔卡,J.R.(Colca,J.R.)等人,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)2003,278(24),21972-21979中；并且其中的每一者特此以引用的方式并入。
此类噁唑烷酮包含以下各者：
Figure BDA0002508295540000602
Figure BDA0002508295540000611
前述噁唑烷酮可以在任何可用位置处经如本文所描述的光激活基团取代，任选地用使所述光激活基团与噁唑烷酮连接的系链取代。叠氮化物光激活基团任选地用本文所描述的其它光激活基团置换。星号(*)指示在原始参考文献中使用125I或14C放射性配体的位置，并且所述位置对于在本发明中用作拉下基团是可选的。
芳基重氮盐(例如，L-5-羧基精胺和L-2-羧基腐胺的对重氮酰苯胺)也已经展示适用作用于RNA映射和RNA/蛋白质相互作用的印迹的光激活探针。参见例如加西亚,A.(Garcia,A.)等人,核酸研究(Nucleic Acids Res.)1990,18(1),89-95。
此外，包括喹啉核心的某些化合物能够结合RNA，CPNQ是所述化合物之一。CPNQ具有以下结构：
Figure BDA0002508295540000621
因此，在一些实施例中，小分子配体是选自CPNQ或其药学上可接受的盐。在其它实施例中，配体是选自与CPNQ相关的喹啉化合物，如图36或39-43中任一个中提供的那些；或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，根据如本文所描述的每一个实施例，CPNQ或与CPNQ相关的喹啉在一或多个可用位置经修饰以用系链(-T1-和/或-T2-)、点击就绪基团(-RCG)或弹头(-Rmod)置换氢。举例来说，CPNQ或与CPNQ相关的喹啉可以具有下式中的一个：
Figure BDA0002508295540000622
或其药学上可接受的盐；其中Rmod任选地经-RCG或-T2-RCG取代，并且进一步任选地经拉下基团取代。式IX-a或IX-b的化合物可以进一步任选地经一或多个如下文所定义的任选取代基(如1个或2个任选取代基)取代。
有机染料、氨基酸、生物辅因子、金属络合物以及肽也展示出RNA结合能力。有可能调节RNA，如核糖开关、具有扩增的核苷酸重复序列的RNA分子和病毒RNA粒子。
如本文所用，术语“结合靶RNA的小分子”、“小分子RNA结合子”、“亲和力部分”、“配体”或“配体部分”包含通常被分类为能够以充足亲和力和特异性与靶RNA结合以用于所公开方法中或用以治疗、预防或减轻与靶RNA相关的疾病的小分子的所有化合物。用于本发明中的结合RNA的小分子可以与靶RNA的一或多个二级或三级结构粒子结合。这些位点包含RNA三链体、发夹、凸起环、假结、内部环、接合点和本文所描述或提及的其它高级RNA结构基序。
因此，在一些实施例中，与靶RNA结合的小分子(例如，以上式I-VIII中的配体)是选自杂芳基二氢嘧啶(HAP)、大环内酯、生物碱、氨基糖苷、四环素家族成员、噁唑烷酮、SMN2前mRNA配体(如LMI070(NVS-SM1))、瑞博希或其类似物、克林霉素、氯霉素、蒽、三蝶烯、茶碱或其类似物、或CPNQ或其类似物。在一些实施例中，与靶RNA结合的小分子是选自巴龙霉素、新霉素(如新霉素B)、卡那霉素(如卡那霉素A)、利奈唑胺、特地唑胺、截短侧耳素、瑞博希、蒽、三蝶烯、或CPNQ或其类似物；其中每个小分子可以任选地经一或多个如下文所定义的“任选取代基”(如1、2、3或4个，例如1个或2个任选取代基)取代。在一些实施例中，小分子是选自图1-8或18-44中所示的那些小分子或其药学上可接受的盐、立体异构体或互变异构体。
在一些实施例中，配体是选自
Figure BDA0002508295540000631
Figure BDA0002508295540000632
Figure BDA0002508295540000641
Figure BDA0002508295540000642
或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，配体与靶RNA中的接合点、茎-环或凸起结合。在一些实施例中，配体与核酸三向接合点(3WJ)结合。在一些实施例中，3WJ是两个RNA分子之间的反式3WJ。在一些实施例中，3WJ是miRNA与mRNA之间的反式3WJ。在一些实施例中，配体与DNA结合，如DNA环或接合点。
本发明化合物包含在本文中一般描述的那些化合物，并且通过本文中所公开的类别、子类和种类进一步说明。如本文所用，除非另外指明，否则以下定义应适用。出于本发明的目的，化学元素是根据元素周期表，CAS版本，化学与物理手册(Handbook of Chemistryand Physics)，第75版来识别。此外，有机化学的一般原理描述于“有机化学(OrganicChemistry)”,托马斯索雷尔(Thomas Sorrell),大学科学书籍(University ScienceBooks),索萨利托(Sausalito):1999和“马奇高等有机化学(March's Advanced OrganicChemistry)”,第5版,编辑：史密斯M.B.(Smith,M.B.)和马奇J.(March,J.),约翰·威利父子公司(John Wiley&Sons),纽约(New York):2001中，这些文献的全部内容特此以引用的方式并入。
如本文所用，术语“脂族基”或“脂肪族基团”意指完全饱和或含有一或多个不饱和单元的直链(即，未分支)或支链、经取代或未经取代的烃链，或完全饱和或含有一或多个不饱和单元但不是芳香族的单环烃或双环烃(在本文中也称为“碳环”、“环脂族基”或“环烷基”)，其具有与分子的其余部分的单点连接。除非另外说明，否则脂肪族基团含有1-6个脂肪族碳原子。在一些实施例中，脂肪族基团含有1-5个脂肪族碳原子。在其它实施例中，脂肪族基团含有1-4个脂肪族碳原子。在其它实施例中，脂肪族基团含有1-3个脂肪族碳原子，并且在另外其它实施例中，脂肪族基团含有1-2个脂肪族碳原子。在一些实施例中，“环脂族”(或“碳环”或“环烷基”)是指完全饱和或含有一或多个不饱和单元但不是芳香族的单环C3-C6烃，所述烃具有与分子的其余部分的单点连接。适合的脂族基包含但不限于直链或支链、经取代或未经取代的烷基、烯基、炔基和其混合物，如(环烷基)烷基、(环烯基)烷基或(环烷基)烯基。
如本文所用，术语“桥联双环”是指具有至少一个桥键的饱和或部分不饱和的任何双环系统，即碳环或杂环。如IUPAC所定义，“桥键”是原子的未分支链或或连接两个桥头的原子或价键，其中“桥头”是键结到三个或更多个骨架原子(除氢以外)的环系统的任何骨架原子。在一些实施例中，桥联双环基团具有7-12个环成员和0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子。此类桥联双环基团在所属领域中是众所周知的并且包含在下文中阐述的那些基团，其中每个基团在任何可取代碳或氮原子处附接到分子的其余部分。除非另外规定，否则桥联双环基团任选地经一或多个如对于脂肪族基团阐述的取代基取代。另外或替代地，桥联双环基团的任何可取代氮为任选地经取代的。示例性桥联双环包含：
Figure BDA0002508295540000651
Figure BDA0002508295540000661
术语“低碳烷基”是指C1-4直链或支链烷基。示例性低碳烷基是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基和叔丁基。
术语“低碳卤烷基”是指经一或多个卤素原子取代的C1-4直链或支链烷基。
术语“杂原子”意指氧、硫、氮、磷或硅中的一或多种(包含氮、硫、磷或硅的任何氧化形式；任何碱性氮的季铵化形式；或杂环的可取代氮，例如N(如3,4-二氢-2H-吡咯基中)、NH(如吡咯烷基中)或NR+(如经N取代的吡咯烷基中))。
如本文所用，术语「不饱和」意指具有一或多个不饱和单元的部分。
如本文所用，术语“二价C1-8(或C1-6)饱和或不饱和、直链或支链烃链”是指如本文所定义的直链或支链的二价亚烷基、亚烯基和亚炔基链。
术语“亚烷基”是指二价烷基。“亚烷基链”是聚亚甲基，即，-(CH2)n-，其中n是正整数，优选1到6、1到4、1到3、1到2，或2到3。经取代的亚烷基链是一或多个亚甲基氢原子经取代基置换的聚亚甲基。适合的取代基包含下文关于经取代的脂肪族基团所描述的那些取代基。
术语“亚烯基”是指二价烯基。经取代的亚烯基链是含有至少一个双键的聚亚甲基，其中一或多个氢原子经取代基置换。适合的取代基包含下文关于经取代的脂肪族基团所描述的那些取代基。
术语“卤素”意指F、Cl、Br或I。
如在“芳烷基”、“芳烷氧基”或“芳氧基烷基”中单独或作为较大部分的一部分使用的术语“芳基”是指具有总共五到十四个环成员的单环或双环系统，其中系统中的至少一个环是芳香族的并且其中系统中的每个环含有3个到7个环成员。术语“芳基”可以与术语“芳环”互换使用。在本发明的某些实施例中，“芳基”是指芳香族环系统，其包含但不限于苯基、联苯基、萘基、蒽基等，其可以具有一或多个取代基。本文所用，在术语“芳基”的范围内还包含芳香族环与一或多个非芳香族环稠合的基团，如茚满基、邻苯二甲酰亚胺基、萘酰亚胺基、啡啶基或四氢萘基等。
单独或作为例如“杂芳烷基”或“杂芳烷氧基”的较大部分的一部分使用的术语“杂芳基”和“杂芳-”是指具有5到10个环原子，优选5、6或9个环原子；在环阵列中共用6、10或14个π电子；并且除碳原子以外还具有一到五个杂原子的基团。术语“杂原子”是指氮、氧或硫，并且包含氮或硫的任何氧化形式以及碱性氮的任何季铵化形式。杂芳基包含但不限于：噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吲哚嗪基、嘌呤基、萘啶基及蝶啶基。如本文所用，术语“杂芳基”和“杂芳-”还包含杂芳香族环与一或多个芳基、环脂族或杂环基环稠合的基团，其中连接基团或点在杂芳香族环上。非限制性实例包含吲哚基、异吲哚基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、4H-喹嗪基、咔唑基、吖啶基、啡嗪基、啡噻嗪基、啡噁嗪基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基和吡啶并[2,3-b]-1,4-噁嗪-3(4H)-酮。杂芳基可以是单环或双环的。术语“杂芳基(heteroaryl)”可以与术语“杂芳基环(heteroarylring)”、“杂芳基(heteroaryl group)”或“杂芳香族(heteroaromatic)”互换使用，这些术语中的任一个都包含任选地经取代的环。术语“杂芳烷基”是指经杂芳基取代的烷基，其中烷基和杂芳基部分独立地任选地经取代。
如本文所用，术语“杂环(heterocycle)”、“杂环基(heterocyclyl)”、“杂环基(heterocyclic radical)”和“杂环(heterocyclic ring)”可互换使用并且是指稳定5到7元单环或7-10元双环杂环部分，其是饱和或部分不饱和的，并且除碳原子以外还具有一或多个、优选一到四个如上文所定义的杂原子。当关于杂环的环原子使用时，术语“氮”包含经取代的氮。作为一个实例，在具有0-3个选自氧、硫或氮的杂原子的饱和或部分不饱和环中，氮可以是N(如3,4-二氢-2H-吡咯基中)、NH(如吡咯烷基中)或+NR(如N经取代的吡咯烷基中)。
杂环可以在任何杂原子或碳原子处附接到其侧基，从而产生稳定结构，并且环原子中的任一个可以任选地经取代。此类饱和或部分不饱和杂环基的实例包含但不限于：四氢呋喃基、四氢噻吩基、吡咯烷基、哌啶基、吡咯啉基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、噁唑烷基、哌嗪基、二噁烷基、二氧杂环戊烷基、二氮呯基、噁氮呯基、噻氮呯基、吗啉基和奎宁环基。术语“杂环(heterocycle)”、“杂环基(heterocyclyl)”、“杂环基环(heterocyclyl ring)”、“杂环基(heterocyclic group)”、“杂环部分(heterocyclicmoiety)”和“杂环基(heterocyclic radical)”在本文中可互换使用，并且还包含杂环基环与一或多个芳基、杂芳基或环脂族环稠合的基团，如二氢吲哚基、3H-吲哚基、色满基、啡啶基或四氢喹啉基。杂环基可以是单环或双环的。术语“杂环基烷基”是指经杂环基取代的烷基，其中烷基和杂环基部分独立地任选地经取代。
如本文所用，术语“部分不饱和”是指包含至少一个双键或三键的环部分。如本文所定义，术语“部分不饱和”旨在涵盖具有多个不饱和位点的环，但并不旨在包含芳基或杂芳基部分。
如本文所描述，本发明化合物可以含有“任选地经取代的”部分。一般来说，术语“经取代”无论前面是否有术语“任选地”，都意指所指定部分中的一或多个氢被适合的取代基置换。除非另外指示，否则“任选地经取代的”基团可以在基团的每个可取代位置处具有适合的取代基(“任选取代基”)，并且当任何既定结构中的超过一个位置可以被超过一个选自指定基团的取代基取代时，在每一位置处取代基可以是相同或不同的。本发明所设想的取代基的组合优选是导致稳定或化学上可行的化合物形成的那些组合。如本文所用，术语“稳定”是指化合物在经历允许其产生、检测和在某些实施例中，其回收、纯化以及用于本文所公开的一或多个目的时，基本上不发生改变。
“任选地经取代的”基团的可取代碳原子上的适合的一价取代基独立地为：卤素；-(CH2)0-4Ro；-(CH2)0-4ORo；-O(CH2)0-4Ro；-O-(CH2)0-4C(O)ORo；-(CH2)0-4CH(ORo)2；-(CH2)0- 4SRo；-(CH2)0-4Ph，其可以经Ro取代；-(CH2)0-4O(CH2)0-1Ph，其可以经Ro取代；-CH＝CHPh，其可以经Ro取代；-(CH2)0-4O(CH2)0-1-吡啶基，其可以经Ro取代；-NO2；-CN；-N3；-(CH2)0-4N(Ro)2；-(CH2)0-4N(Ro)C(O)Ro；-N(Ro)C(S)Ro；-(CH2)0-4N(Ro)C(O)NRo 2；-N(Ro)C(S)NRo 2；-(CH2)0-4N(Ro)C(O)ORo；-N(Ro)N(Ro)C(O)Ro；-N(Ro)N(Ro)C(O)NRo 2；-N(Ro)N(Ro)C(O)ORo；-(CH2)0-4C(O)Ro；-C(S)Ro；-(CH2)0-4C(O)ORo；-(CH2)0-4C(O)SRo；-(CH2)0-4C(O)OSiRo 3；-(CH2)0-4OC(O)Ro；-OC(O)(CH2)0-4SR-；SC(S)SRo；-(CH2)0-4SC(O)Ro；-(CH2)0-4C(O)NRo 2；-C(S)NRo 2；-C(S)SRo；-SC(S)SRo；-(CH2)0-4OC(O)NRo 2；-C(O)N(ORo)Ro；-C(O)C(O)Ro；-C(O)CH2C(O)Ro；-C(NORo)Ro；-(CH2)0-4SSRo；-(CH2)0-4S(O)2Ro；-(CH2)0-4S(O)2ORo；-(CH2)0-4OS(O)2Ro；-S(O)2NRo 2；-(CH2)0-4S(O)Ro；-N(Ro)S(O)2NRo 2；-N(Ro)S(O)2Ro；-N(ORo)Ro；-C(NH)NRo 2；-P(O)2Ro；-P(O)Ro 2；-OP(O)Ro 2；-OP(O)(ORo)2；SiRo 3；-(C1-4直链或支链亚烷基)O-N(Ro)2；；或-(C1-4直链或支链亚烷基)C(O)O-N(Ro)2，其中每个Ro可以如下文所定义经取代并且独立地为：氢；C1-6脂族基；-CH2Ph；-O(CH2)0-1Ph；-CH2-(5-6元杂芳香族环)；或5-6元饱和、部分不饱和或具有0-4独立地选自氮、氧或硫的杂原子的芳基环；或不管上文所定义，Ro的两种独立存在与其一或多个插入原子一起形成3-12元饱和、部分不饱和或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的芳基单环或双环，其可以如下文所定义经取代。
Ro(或由Ro的两种独立存在与其插入原子一起所形成的环)上的适合的一价取代基独立地为：卤素；-(CH2)0-2R·；-(卤基R·)；-(CH2)0-2OH；-(CH2)0-2OR·；-(CH2)0-2CH(OR·)2；-O(卤基R·)；-CN；-N3；-(CH2)0-2C(O)R·；-(CH2)0-2C(O)OH；-(CH2)0-2C(O)OR·；-(CH2)0-2SR·；-(CH2)0-2SH；-(CH2)0-2NH2；-(CH2)0-2NHR·；-(CH2)0-2NR· 2；-NO2；-SiR· 3；-OSiR· 3；-C(O)SR·；-(C1-4直链或支链亚烷基)C(O)OR·或SSR·，每个R·未经取代或前面加“卤基”的为仅经一或多个卤素取代，并且独立地选自C1-4脂族基；-CH2Ph；-O(CH2)0-1Ph或5-6元饱和、部分不饱和或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的芳基环。Ro的饱和碳原子上的适合的二价取代基包含＝O和＝S。
“任选地经取代的”基团的饱和碳原子上的适合的二价取代基包含以下：＝O、＝S、＝NNR* 2、＝NNHC(O)R*、＝NNHC(O)OR*、＝NNHS(O)2R*、＝NR*、＝NOR*、-O(C(R* 2))2-3O-或-S(C(R* 2))2-3S-，其中R*的每个独立存在是选自氢、C1-6脂族基(其可以如下文所定义经取代)或未经取代的5-6元饱和、部分不饱和或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的芳基环。与“任选地经取代的”基团的邻位可取代碳结合的适合的二价取代基包含：-O(CR* 2)2-3O-，其中R*的每个独立存在是选自氢、C1-6脂族基(其可以经下文所定义的取代)或未经取代的5-6元饱和、部分不饱和或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的芳基环。
R*的脂族基上的适合的取代基包含：-R·、-(卤基R·)、-OH、-OR·、-O(卤基R·)、-CN、-C(O)OH、-C(O)OR·、-NH2、-NHR·、-NR· 2或-NO2，其中每个R·未经取代或前面加“卤基”的为仅经一或多个卤素取代，并且独立地为C1-4脂族基、-CH2Ph、-O(CH2)0-1Ph或5-6元饱和、部分不饱和或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的芳基环。
“任选地经取代的”基团的可取代氮上的适合的取代基包含：
Figure BDA0002508295540000691
Figure BDA0002508295540000692
或
Figure BDA0002508295540000693
其中每个
Figure BDA0002508295540000694
独立地为氢、C1-6脂族基(其可以如下文所定义经取代)、未经取代的-OPh或未经取代的5-6元饱和、部分不饱和或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子芳基环，或不管上文所定义，
Figure BDA0002508295540000695
的两种独立存在与其一或多个插入原子一起形成未经取代的3-12元饱和、部分不饱和或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的芳基单环或双环。
Figure BDA0002508295540000696
的脂族基上的适合肥肉取代基独立地为：卤素、-R·、-(卤基R·)、-OH、-OR·、-O(卤基R·)、-CN、-C(O)OH、-C(O)OR·、-NH2、-NHR·、-NR· 2或-NO2，其中每个R·未经取代的或前面加“卤基”的为仅经一或多个卤素取代，并且独立地为C1-4脂族基、-CH2Ph、-O(CH2)0-1Ph或5-6元饱和、部分不饱和或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的芳基环。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指在合理医学判断范围内适用于与人类和低等动物的组织接触而无不当毒性、刺激、过敏反应等，并且与合理的效益/风险比相称的那些盐。药学上可接受的盐在所属领域中是众所周知的。举例来说，S.M.贝尔奇(S.M.Berge)等人在药物科学杂志(J.Pharmaceutical Sciences)，1977，66，1-19中详细描述了药学上可接受的盐，所述文献以引用的方式并入本文中。本发明化合物的药学上可接受的盐包含衍生自适合的无机和有机酸和碱的那些盐。药学上可接受的无毒性酸加成盐的实例是氨基与无机酸(如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和过氯酸)或与有机酸(如乙酸、草酸、顺丁烯二酸、酒石酸、柠檬酸、丁二酸或丙二酸)形成的盐，或通过使用所属领域中所用的其它方法(如离子交换)形成的盐。其它药学上可接受的盐包含己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、反丁烯二酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘化物、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、顺丁烯二酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯丙酸盐、磷酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、丁二酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。
衍生自适当的碱的盐包含碱金属盐、碱土金属盐、铵盐和N+(C1-4烷基)4盐。代表性碱金属盐或碱土金属盐包含钠、锂、钾、钙、镁等。其它药学上可接受的盐包含(适当时)使用平衡离子(如卤离子、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、低碳烷基磺酸根和芳基磺酸根)形成的无毒铵、季铵和胺阳离子。
除非另外规定，否则本文所描绘的结构还意图包含所述结构的所有异构(例如，对映异构、非对映异构和几何异构(或构象异构))形式；例如，关于每个不对称中心的R与S构形、Z与E双键异构体，以及Z与E构象异构体。因此，本发明化合物的单一立体化学异构体以及对映异构、非对映异构和几何异构(或构象异构)混合物都在本发明的范围内。除非另外说明，否则本发明化合物的所有互变异构形式都在本发明的范围内。此外，除非另外说明，否则本文所描绘的结构也意指包含仅在一或多个同位素增浓原子存在下不同的化合物。举例来说，具有包含由氘或氚置换氢或由13C或14C增浓的碳置换碳的本发明结构的化合物在本发明的范围内。此类化合物适用作例如分析工具，用作生物分析中的探针，或用作根据本发明的治疗剂。在某些实施例中，所提供的化合物的弹头部分R1包括一或多个氘原子。
如本文所用，术语“抑制剂”被定义为以可测量亲和力结合到和/或调节或抑制靶RNA的化合物。在某些实施例中，抑制剂的IC50和/或结合常数小于约100μM、小于约50μM、小于约1μM、小于约500nM、小于约100nM、小于约10nM或小于约1nM。
如本文所用，术语“可测量亲和力”和“可测量地抑制”意指在包括本发明化合物或其组合物和靶RNA的样品与包括靶RNA(不存在所述化合物或其组合物的情况下)的同等样品之间的下游生物效应中的可测量变化。
如本文所用，术语“RNA”(核糖核酸)意指天然存在或合成的寡核糖核苷酸，与来源(例如，RNA可以由人类、动物、植物、病毒或细菌产生，或可以是合成来源的)、生物环境(例如，RNA可以在细胞核中、在血液中循环、在体外、在细胞裂解物中、或呈分离或纯形式)或物理形式(例如，RNA可以呈单链、双链或三链形式(包括RNA-DNA杂合体)，可以包含表观遗传修饰、天然转录后修饰、人工修饰(例如，通过化学或体外修饰来获得)或其它修饰，可以结合到例如金属离子、小分子、蛋白质伴侣蛋白或辅因子，或可以呈变性、部分变性或折叠状态，包含任何天然或非天然二级或三级结构，如接合点(例如，顺式或反式三向接合点(3WJ))、四链体、发夹、三链体、发夹、凸起环、假结和内部环等，和RNA所呈现的任何瞬态形式或结构)无关。在一些实施例中，RNA的长度为100个或更多个核苷酸。在一些实施例中，RNA的长度为250个或更多个核苷酸。在一些实施例中，RNA的长度为350、450、500、600、750或1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、7,500、10,000、15,000、25,000、50,000个或更多个核苷酸。在一些实施例中，RNA的长度在250个与1,000个核苷酸之间。在一些实施例中，RNA为前RNA、前miRNA或前转录物。在一些实施例中，RNA为非编码RNA(ncRNA)、信使RNA(mRNA)、微RNA(miRNA)、核酶、核糖开关、lncRNA、lincRNA、snoRNA、snRNA、scaRNA、piRNA、ceRNA、假基因、病毒RNA或细菌RNA。如本文所用，术语“靶RNA”意指具有能够结合本文所描述的小分子配体的二级或三级结构的任何类型的RNA。靶RNA在接触化合物之前可以在细胞内部、在细胞裂解物中，或呈分离形式。
光激活基团
用于本发明的适合的共价修饰部分(例如，以上式I-VIII中所示的Rmod)一般包含一旦用可见光或紫外光照射，就产生反应性中间体的光激活基团。在一些实施例中，光激活基团为一旦用紫外辐射(UV)辐射照射，就产生碳中心或氧中心自由基、芳基或杂芳基碳阳离子、氮烯或碳烯中间体的官能团；并且其中Rmod为能够与配体结合的靶RNA反应以与所述靶RNA产生共价键。下文展示在照射之后产生的示例性光激活发色团和反应性物质。
Figure BDA0002508295540000721
方案1：二苯甲酮与芳基叠氮化物的反应
Figure BDA0002508295540000722
方案2：双吖丙啶的反应
Figure BDA0002508295540000731
方案3：核酸嘌呤与光激活基团的示例性反应
由于弹头在激活之前不具有反应性，因此成功光激活修饰需要非共价RNA-配体相互作用。如果不存在适当安置的大分子，那么反应性碳烯/氮烯中间体会由水快速淬灭。
α-吡喃酮和嘧啶酮也是可以用于本发明的光激活基团。举例来说，巴滕伯格,O.A.(Battenberg,O.A.)等人(有机化学杂志(J.Org.Chem.)2011,76,6075-6087)公开如下的光探针：
Figure BDA0002508295540000732
在一些实施例中，光激活基团是选自如上文的那些吡喃酮或嘧啶酮。
在其它实施例中，光激活基团在照射并且与靶RNA形成共价键之后，经历任选地包含恢复到其原始状态的平衡过程。可以在不同波长的光照射下以可逆方式异构化并且可以用作光激活基团的合成分子包含重氮苯、二氢芘、螺噁嗪、蒽、俘精酸酐和螺吡喃。示例性螺吡喃和其照射诱导的平衡过程展示于以下方案中。
Figure BDA0002508295540000741
方案4：示例性螺吡喃光探针
其中R＝-(CH2)2O2C(CH2)2NH2并且上文1可任选地经取代；螺吡喃可以通过如本文所描述的共价键或系链连接到小分子配体和任选的拉下基团。与其它可逆系统相比的螺吡喃1的一个特征在于其光化学交换实际上是完全的(在365nm下的UV照射之后>95％的2a)，因为1(350nm)和2a(563nm)的区别地不同的吸收最大值，而重氮苯不同，其在暴露于365nm的UV光时达到70-90％顺式的光静止状态。2a和2b的平衡还可以受pH影响。参见例如杨,D.D.(Young,D.D.)等人,化学生物化学(ChemBioChem)2008,9,1225-1228。
在一些实施例中，光激活基团是选自任选地经取代的苯基或8-10元双环芳香族碳环叠氮化物或5-8元杂芳基或8-10元双环杂芳基叠氮化物；任选地经取代的苯甲酰基叠氮化物或5-8元杂芳酰基叠氮化物或8-10元杂芳酰基叠氮化物，其中环原子中的1-3个原子是选自氮、硫或氧；任选地经取代的苯基或8-10元双环芳香族碳环重氮盐；任选地经取代的5-8元杂芳基或8-10元双环杂芳基重氮盐，其中环原子中的1-3个原子是选自氮、硫或氧；任选地经取代的C2-6脂肪族重氮功能团；任选地经取代的C2-6脂肪族双吖丙啶；或任选地经取代的二苯基或8-10元二杂芳基酮，其中环原子中的1-3个原子是选自氮、硫或氧；任选地经取代的二氢芘；任选地经取代的螺噁嗪；任选地经取代的蒽；任选地经取代的俘精酸酐；任选地经取代的螺吡喃；任选地经取代的α-吡喃酮或任选地经取代的嘧啶酮。
在一些实施例中，光激活基团是选自例如：
Figure BDA0002508295540000751
光激活基团可以通过所属领域的普通技术人员已知并且如本文所描述的常规偶合反应结合到小分子配体或系链。举例来说，如D-光亮氨酸或L-光亮氨酸、光甲硫氨酸、光赖氨酸、对苯甲酰苯丙氨酸等的光激活氨基酸可以充当将光激活基团引入到根据本发明的化合物中的方便方式。
在一些实施例中，光激活基团为芳酰基或杂芳基叠氮化物，如烟酰基叠氮化物(NAz)。此类化合物一旦照射就形成氮烯中间体，并且已用于研究核酸(如SAM-1核糖开关和rRNA)在细胞中的溶剂可接近性。例如，NAz探针与可接近的嘌呤的C8位置反应。
如本文所用，术语“共价修饰部分”或“弹头”意指能够与RNA的可用核苷酸形成共价键以在一旦用可见光或UV光照射就产生经修饰的RNA(如C8修饰的嘌呤或2′-O修饰的RNA)的任何光激活基团。
通常选择用于激活光激活基团的可见光或UV光的波长以产生反应性中间体，如氮烯，而不实质上降低研究中的生物系统或引起非目标反应性。波长通常为已知用于产生对于每个特定光激活基团的反应性中间体的波长。在一些实施例中，波长为约252nm、302nm或365nm；或254nm、265-275nm、365nm、300-460nm或约250nm到约350nm。
当芳基叠氮化物暴露于UV光(250到350nm)时，其形成可以引发与双键的加成反应、插入到C-H和N-H位点中或随后环扩增以与亲核体(例如伯胺)反应的氮烯基团。当在样品中存在伯胺时，后一反应路径占优势。
在光激活之前和期间的所有步骤期间，样品溶液中必须避免含硫醇还原剂(例如DTT或2-巯基乙醇)，因为其将叠氮化物官能团还原成胺，从而阻止光激活。可以在多种无胺的缓冲液条件下进行反应。如果使用异双官能光激活交联剂，那么使用与所涉及的两种反应性化学物质相容的缓冲液。一般来说，实验在弱光下和/或在反应器被箔片覆盖的情况下进行直到达到预期的光激活。通常，光激活是通过放置于接近反应溶液的手持式UV灯并且直接照射在反应溶液上(即，不通过玻璃或聚丙烯)几分钟来实现的。
芳基叠氮化物的实例包含单苯基叠氮化物、羟苯基叠氮化物和硝苯基叠氮化物。一般来说，需要短波长UV光(例如254nm；265到275nm)以有效激活单苯基叠氮化物，而长UV光(例如365nm；300到460nm)足以用于硝苯基叠氮化物。
Figure BDA0002508295540000761
RBP蛋白质和其它邻近生物分子的共价修饰
在一些实施例中，光激活基团与接近靶RNA上的小分子配体结合位点的蛋白质反应。RNA结合蛋白(RBP)经常与所关注的靶RNA相关。在一些情况下，RBP与所公开的光激活化合物所结合的靶向RNA子结构相关或以其它方式接近所公开的光激活化合物所结合的靶向RNA子结构。因此，光亲和力弹头的优点为其对接近附接到小分子配体的光激活基团的RNA或蛋白质(如RBP)的共价修饰是不可知的。因此，在一些实施例中，所公开的化合物共价修饰靶RNA或与靶RNA相关的RBP。这继而产生以下见解：哪些RBP与靶RNA结合并且哪些细胞或组织与生物体结合，以及小分子结合对RBP结合的影响。
因此，在一个方面，本发明提供一种确定RNA结合蛋白(RBP)与靶RNA的存在或缔合/结合的方法，其包括以下步骤：使靶RNA与所公开的化合物接触并且用可见光或UV光照射化合物，并且任选地进行一或多种分析以确定RBP是否已通过化合物的光激活基团共价修饰。
与先前已知的方法不同，高度反应性并且因此相对无差别的碳烯、氮烯、双自由基以及通过光亲和力弹头激活产生的其它中间体因此具有共价修改靶RNA或邻近的任何生物分子的优点。
系链基团(连接子)
本发明涵盖使用多种多样的系链基团(系链；例如，如上式I-VIII中所示的变量T1和T2)以提供对靶RNA的邻近结合位点的核苷酸或RBP的最优结合和反应性。在一些实施例中，T1和T2是选自图10-17中所示的那些。举例来说，在一些实施例中，T1和/或T2是例如1-10个乙二醇子单元的聚乙二醇(PEG)基团。在一些实施例中，T1和/或T2是任选地经取代的C1-12脂肪族基团或包括1-8个氨基酸的肽。
在一些实施例中，T1和T2各自独立地选自L1或L2，如在本文的实施例中所定义的L1和L2。
在一些实施例中，系链的例如长度、刚度、疏水性和/或其它特性的物理特性被选择以优化靶RNA或相关RBP与光激活基团(弹头)之间的邻位诱导的共价键形成的模式。在一些实施例中，选择系链的物理特性(如以上那些)，使得一旦将化合物与靶RNA的活性位点或变构位点结合，就修改部分选择性地与靶RNA的可用官能团(如接近活性位点或变构位点的靶RNA的嘌呤C8碳或2′-OH基团)反应，或与RBP的邻近氨基酸反应。
点击就绪基团
多种生物正交反应配偶体(例如，式I-VIII中的RCG或上式中的R2)可以用于本发明以使本文所描述的化合物与拉下部分偶合。如本文所用，术语“生物正交化学”或“生物正交反应”是指可以在活系统中进行而不干扰天然生物化学过程的任何化学反应。因此，“生物正交反应配偶体”是能够经历与适当反应配偶体的生物正交反应以使本文所描述的化合物偶合到拉下部分的化学部分。在一些实施例中，生物正交反应配偶体共价附接到化学修饰部分或系链基团。在一些实施例中，生物正交反应配偶体是选自点击就绪基团或能够经历硝酮/环辛炔反应、肟/腙形成、四嗪连接、基于胩的点击反应或四环庚烷连接的基团。
在一些实施例中，生物正交反应配偶体是点击就绪基团。术语“点击就绪基团”是指能够进行点击反应的化学部分，如叠氮化物或炔烃。
点击反应倾向于涉及具有明确定义的反应坐标的高能(“负载弹簧”)试剂，从而产生宽范围的选择性成键事件。实例包含应变环亲电子试剂(环氧化物、氮丙啶、吖丙啶鎓离子、表锍离子)的亲核捕获、某种羰基反应性(例如，醛与肼或羟胺之间的反应)和数种环加成反应。叠氮化物-炔烃1,3-偶极环加成和狄尔斯-阿尔德环加成是两种此类反应。
此类点击反应(即，偶极环加成)与高活化能相关并且因此需要热量或催化剂。实际上，铜催化剂的使用常规地用于点击反应中。然而，在点击化学尤其适用的某些情况下(例如，在生物偶联反应中)，铜的存在可能是有害的(参见沃尔贝斯,F.(Wolbers,F.)等人；电泳(Electrophoresis)2006,27,5073)。因此，在不使用金属催化的情况下开发进行偶极环加成反应的方法。此类“无金属”点击反应利用激活部分以便促进环加成。因此，本发明提供适用于无金属点击化学的点击就绪基团。
某些无金属的点击部分是文献中已知的。实例包含4-二苯并环辛炔醇(DIBO)(来自宁(Ning)等人；应用化学国际版(Angew Chem Int Ed),2008,47,2253)；gem-二氟化环辛炔(DIFO或DFO)(来自科莱里(Codelli)等人；美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)2008,130,11486-11493.)；二芳基氮杂环辛炔酮(BARAC)(来自朱厄特(Jewett)等人；美国化学学会杂志2010,132,3688.)；或二环壬炔(BCN)(来自多梅霍特(Dommerholt)等人；应用化学国际版,2010,49,9422-9425)。
如本文所用，短语“适用于无金属的点击化学的部分”是指能够在不使用金属催化剂的情况下进行偶极环加成的官能团。此类部分包含激活的炔烃(如应变环辛炔)、肟(如氧化腈前体)或氧杂降冰片二烯，用于与叠氮化物偶合以形成环加成产物(例如，三唑或异噁唑)。
因此，在某些实施例中，点击就绪基团是选自叠氮化物、炔烃、4-二苯并环辛炔醇(DIBO)、gem二氟化环辛炔(DIFO或DFO)、二芳基氮杂环辛炔酮(BARAC)、双环辛炔(BCN)、应变环辛炔、肟或氧杂降冰片二烯。
在一些实施例中，即点基团是选自图9中所示的那些。
拉下基团
多种拉下基团(例如上式I-VIII中的RPD)可以用于本发明。在一些实施例中，拉下基团含有生物正交反应配偶体，其与点击就绪基团反应以将拉下基团附接到化合物的其余部分，以及适当的官能团或亲和力基团，如半抗原(例如，生物素)或放射性标记，从而允许选择性地分离或检测拉下化合物。举例来说，使用亲和素或链霉亲和素与下拉基团相互作用将允许仅分离如下文进一步详细阐释的共价修饰的那些RNA。
在一些实施例中，在与靶RNA结合之前并且在照射以激活光激活基团之前，将拉下基团共价附接到如上问所描述和本文所描述的式中的所公开的化合物。在其它实施例中，在光激活基团被照射并且靶RNA已发生共价修饰之后，拉下基团附接到化合物或RNA偶联物。在一些实施例中，此类附接是通过化合物或RNA偶联物上的点击就绪基团与作为拉下基团的一部分的适当反应配偶体之间的生物正交反应实现。因此，在一些实施例中，拉下基团包括通过系链(如本文中其它地方所描述)附接到亲和力基团或生物正交官能团的点击就绪基团。在一些实施例中，亲和力基团或生物正交官能团为半抗原(例如，生物素)或放射性标记，例如125I、14C、32P或3H。
3.提供本发明化合物的一般方法
本发明化合物一般可以通过所属领域的技术人员已知的用于类似化合物的合成和/或半合成方法和通过本文实例和图式详细描述的方法制备或分离。
在实施方式、实例和图式中所描绘的方案和化学反应中，在描绘具体保护基(“PG”)、离去基(“LG”)或转化条件时，所属领域的普通技术人员将了解，其它保护基、离去基和转化条件也是适合的并且被涵盖在内。此类基团和转化详细描述于马彻高等有机化学：反应、机制和结构(March's Advanced Organic Chemistry:Reactions,Mechanisms,and Structure),M.B.史密斯(M.B.Smith)和J.马彻(J.March),第5版,约翰·威利父子公司,2001；综合有机转化(Comprehensive Organic Transformations),R.C.拉罗克(R.C.Larock),第2版,约翰·威利父子公司,1999；和有机合成中的保护基(ProtectingGroups in Organic Synthesis),T.W.格林(T.W.Greene)和P.G.M.伍兹(P.G.M.Wuts),第3版,约翰·威利父子公司,1999中，所述文献中的每一者的全部内容特此以引用的方式并入本文中。
如本文所用，短语“离去基”(LG)包含但不限于卤素(例如氟离子、氯离子、溴离子、碘离子)、磺酸根(例如甲磺酸根、甲苯磺酸根、苯磺酸根、溴苯磺酸根、硝基苯磺酸根、三氟甲磺酸根)、重氮鎓等。
如本文所用，短语“氧保护基”包含例如羰基保护基、羟基保护基等。羟基保护基在所属领域中是熟知的并且包含详细描述于有机合成中的保护基,T.W.格林和P.G.M.伍兹,第3版,约翰·威利父子公司,1999中的那些羟基保护基，所述文献的全部内容以引用的方式并入本文中。适合的羟基保护基的实例包含但不限于：酯、烯丙基醚、醚、硅烷基醚、烷基醚、芳烷基醚和烷氧基烷基醚。此类酯的实例包含甲酸酯、乙酸酯、碳酸酯和磺酸酯。特定实例包含甲酸酯、苯甲酰基甲酸酯、氯乙酸酯、三氟乙酸酯、甲氧基乙酸酯、三苯基甲氧基乙酸酯、对氯苯氧基乙酸酯、3-苯基丙酸酯、4-氧代戊酸酯、4,4-(亚乙基二硫基)戊酸酯、新戊酸(三甲基乙酰)酯、巴豆酸酯、4-甲氧基-巴豆酸酯、苯甲酸酯、对苯甲基苯甲酸酯、2,4,6-三甲基苯甲酸酯、碳酸酯，如甲酯、9-芴基甲酯、乙酯、2,2,2-三氯乙酯、2-(三甲基硅烷基)乙酯、2-(苯磺酰基)乙酯、乙烯酯、烯丙酯和对硝基苯甲酯。此类硅烷基醚的实例包含三甲基硅烷基醚、三乙基硅烷基醚、叔丁基二甲基硅烷基醚、叔丁基二苯基硅烷基醚、三异丙基硅烷基醚和其它三烷基硅烷基醚。烷基醚包含甲基醚、苯甲基醚、对甲氧基苯甲基醚、3,4-二甲氧基苯甲基醚、三苯甲基醚、叔丁基醚、烯丙基醚和烯丙氧基羰基醚或衍生物。烷氧基烷基醚包含缩醛，如甲氧基甲基醚、甲硫基甲基醚、(2-甲氧基乙氧基)甲基醚、苯甲氧基甲基醚、β-(三甲基硅烷基)乙氧基甲基醚和四氢吡喃基醚。芳烷基醚的实例包含苯甲基醚、对甲氧基苯甲基醚(MPM)、3,4-二甲氧基苯甲基醚、邻硝基苯甲基醚、对硝基苯甲基醚、对卤基苯甲基醚、2,6-二氯苯甲基醚、对氰基苯甲基醚以及2-吡啶甲基醚和4-吡啶甲基醚。
氨基保护基在所属领域中是熟知的并且包含详细描述于有机合成中的保护基,T.W.格林和P.G.M.伍兹,第3版,约翰·威利父子公司,1999中的那些氨基保护基，所述文献的全部内容以引用的方式并入本文中。适合的氨基保护基包含但不限于：芳烷基胺、氨基甲酸酯、环酰亚胺、烯丙基胺、酰胺等。此类基团的实例包含叔丁氧基羰基(BOC)、乙氧基羰基、甲氧基羰基、三氯乙氧基羰基、烯丙氧基羰基(Alloc)、苯甲氧基羰基(CBZ)、烯丙基、邻苯二甲酰亚胺、苯甲基(Bn)、芴基甲基羰基(Fmoc)、甲酰基、乙酰基、氯乙酰基、二氯乙酰基、三氯乙酰基、苯乙基、三氟乙酰基、苯甲酰基等。
所属领域的技术人员应了解，存在于本发明化合物中的各种官能团(如脂族基、醇、羧酸、酯、酰胺、醛、卤素和腈)可以通过包含但不限于：还原、氧化、酯化、水解、部分氧化、部分还原、卤化、脱水、部分水合和水合的所属领域中熟知的技术互相转化。“马奇高等有机化学”,第5版,编者：史密斯M.B.和马奇J.,约翰·威利父子公司,纽约:2001，所述文献的全部内容以引用的方式并入本文中。此类互相转化可能需要前述技术中的一或多种，并且用于合成本发明化合物的某些方法描述于下文例证和图式中。
4.用途、调配和投与
药学上可接受的组合物
根据另一个实施例，本发明提供一种组合物，其包括本发明化合物或其药学上可接受的衍生物和药学上可接受的载剂、佐剂或媒剂。本发明组合物中的化合物的量是使得对可测量地抑制或调节生物样品或患者中的靶RNA或其突变体有效的量。在某些实施例中，本发明组合物中的化合物的量是使得对可测量地抑制或调节生物样品或患者中的靶RNA有效的量。在某些实施例中，本发明组合物经调配成用于向需要此类组合物的患者投与。在一些实施例中，本发明组合物经调配成用于向患者经口投与。
如本文所用，术语“患者”意指动物，优选为哺乳动物，并且最优选为人类。
术语“药学上可接受的载体、佐剂或媒剂”是指不会破坏一起调配的化合物的药理学活性的无毒载体、佐剂或媒剂。可以用于本发明的组合物的药学上可接受的载剂、佐剂或媒剂包含但不限于：离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(如人血清白蛋白)、缓冲物质(如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质(如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐)、胶态二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
“药学上可接受的衍生物”意指一旦向接受者投与就能够直接或间接提供本发明的化合物或其抑制活性代谢物或残余物的本发明化合物的任何无毒盐、酯、酯的盐或其它衍生物。
本发明组合物可以经口、非经肠、通过吸入喷雾、局部、经直肠、经鼻、经颊、经阴道或通过植入式贮器投与。如本文所用，术语“非经肠”包含皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。优选地，组合物经口、经腹膜内或经静脉内投与。本发明组合物的无菌可注射形式可以是水性或油性悬浮液。这些悬浮液可以根据所属领域中已知的技术使用适合的分散剂或湿润剂和悬浮剂来调配。无菌可注射制剂还可以为在无毒非经肠可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如呈在1,3-丁二醇中的溶液形式。可以采用的可接受的媒剂和溶剂中有水、林格氏溶液(Ringer'ssolution)和等张氯化钠溶液。另外，无菌不挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质。
出于此目的，可以采用任何温和的不挥发性油，包含合成单甘油酯或二甘油酯。如油酸的脂肪酸和其甘油酯衍生物适用于制备可注射剂，如天然的药学上可接受的油，如橄榄油或蓖麻油，尤其呈其聚氧乙基化形式。这些油溶液或悬浮液还可以含有长链醇稀释剂或分散剂，如羧甲基纤维素或常用于调配药学上可接受的剂型(包含乳液和悬浮液)的类似分散剂。出于调配的目的，还可以使用其它常用表面活性剂(如吐温(Tweens)、司盘(Spans))和其它常用于制造药学上可接受的固体、液体或其它剂型的乳化剂或生物可用性增强剂。
本发明的药学上可接受的组合物可以任何经口可接受剂型经口投与，所述剂型包含但不限于：胶囊、片剂、水性悬浮液或溶液。在口服使用的片剂的情况下，常用载剂包含乳糖和玉米淀粉。典型地还添加如硬脂酸镁的润滑剂。对于以胶囊形式经口投与，适用的稀释剂包含乳糖和干燥玉米淀粉。当口服使用需要水性悬浮液时，将活性成分与乳化剂和悬浮剂合并。必要时，还可以添加某些甜味剂、调味剂或着色剂。
可替代地，本发明的药学上可接受的组合物可以用于经直肠投与的栓剂形式投与。这些栓剂可以通过将药剂与适合的非刺激性赋形剂混合来制备，所述赋形剂在室温下是固体但在直肠温度下是液体并且因此将在直肠中熔化以释放药物。此类材料包含可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。
本发明的药学上可接受的组合物也可以局部投与，尤其在治疗靶点包含通过局部施用容易达到的区域或器官(包含眼睛、皮肤或下部肠道的疾病)时。容易制备适用于这些区域或器官中的每一着的局部调配物。
对下部肠道的局部施用可以直肠栓剂调配物(参见上文)或以适合的灌肠剂调配物实现。还可以使用局部经皮贴片。
对于局部施用来说，所提供的药学上可接受的组合物可以含有悬浮或溶解于一或多种载剂中的活性组分的适合软膏形式调配。用于本发明化合物的局部投与的载剂包含但不限于矿物油、液体矿脂、白矿脂、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。可替代地，所提供的药学上可接受的组合物可以含有悬浮或溶解于一或多种药学上可接受的载剂中的活性组分适合的洗剂或乳膏形式调配。适合的载剂包含但不限于矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、鲸蜡酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。
对于眼科使用，所提供的药学上可接受的组合物可以在存在或不存在如苯扎氯铵的防腐剂情况下，调配为于pH经调整的等张无菌生理食盐水中的微粉化悬浮液或优选调配为于pH值经调整的等张无菌生理食盐水中的溶液。或者对于眼科使用，药学上可接受的组合物可以在如矿脂的软膏中调配。
本发明的药学上可接受的组合物还可以通过鼻气雾剂或吸入投与。此类组合物是根据医药调配物领域中所熟知的技术制备，并且可以采用苯甲醇或其它适合的防腐剂、增强生物可用性的吸收促进剂、碳氟化合物和/或其它常规增溶剂或分散剂，以在生理食盐水中的溶液形式制备。
最优选地，调配本发明的药学上可接受的组合物以用于经口投与。此类调配物可以在存在或不存在进食的情况下投与。在一些实施例中，本发明的药学上可接受的组合物在不存在进食的情况下投与。在其它实施例中，本发明的医药学上可接受的组合物在存在进食的情况下投与。
可以与载剂材料合并以产生呈单一剂型的组合物的本发明化合物的量将视所治疗的宿主、特定投与模式而变化。优选地，应该调配所提供的组合物以使得可以向接受这些组合物的患者投与剂量在0.01-100mg/kg体重/天之间的抑制剂。
还应理解，针对任何特定患者的特定剂量和治疗方案将取决于各种因素，包含所采用的特定化合物的活性、年龄、体重、整体健康状况、性别、饮食、投与时间、排泄率、药物组合和治疗医师的判断以及所治疗特定疾病的严重程度。组合物中本发明化合物的量也将视组合物中的特定化合物而定。
化合物和药学上可接受的组合物的用途
本文所描述的化合物和组合物通常适用于调节靶RNA以击退RNA介导的疾病或病状。
本发明中用以调节靶RNA的化合物的活性可以在体外、体内或细胞系中进行分析。体外分析包含确定靶RNA的调节的分析。替代性体外分析定量化合物与靶RNA结合的能力。用于分析在本发明中用以调节靶RNA的化合物的详细条件阐述于以下实例中。
如本文所用，术语“治疗(treatment/treat/treating)”是指逆转、减轻如本文所描述的疾病或病症或其一或多种症状，延迟其发作，或抑制其进展。在一些实施例中，可以在已出现一或多种症状后投与治疗。在其它实施例中，可以在无症状存在下投与治疗。举例来说，可以在症状发作之前向易感个体投与治疗(例如，根据症状病史和/或根据遗传学或其它易感性因素)。还可以在症状已经消退之后继续进行治疗，例如以预防或延迟其复发。
所提供的化合物为靶RNA的调节因子，并且因此适用于治疗与靶RNA相关或受其影响(例如，其下游)的一或多种病症。因此，在某些实施例中，本发明提供一种用于治疗RNA介导的病症的方法，其包括以下步骤：向有需要的患者投与本发明化合物或其药学上可接受的组合物。
如本文所用，术语“RNA介导的”病症、疾病和/或病状如本文所用意指已知RNA(如过度表达、不足表达、突变、错误折叠、致病或致癌的RNA)在其中起一定作用的任何疾病或其它有害病状。因此，本发明的另一个实施例涉及治疗或减轻已知RNA(如过度表达、不足表达、突变、错误折叠、致病或致癌的RNA)在其中起一定作用的一或多种疾病的严重程度。
在一些实施例中，本发明提供一种用于治疗一或多种病症、疾病和/或病状的方法，其中所述病症、疾病或病状包含但不限于细胞增殖性病症。
细胞增殖性病症
本发明提供了用于通过调节靶RNA来诊断和预后细胞增殖性病症(例如，癌症)和治疗这些病症的方法和组合物。本文所描述的细胞增殖性病症包含例如癌症、肥胖症和增殖依赖性疾病。此类病症可以使用所属领域中已知的方法诊断。
癌症
在一个实施例中，癌症包含但不限于：白血病(例如，急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性成髓细胞性白血病(acute myeloblastic leukemia)、急性早幼粒细胞性白血病(acute promyelocytic leukemia)、急性骨髓单核细胞性白血病(acute myelomonocytic leukemia)、急性单核细胞性白血病、急性红白血病、慢性白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如，霍奇金氏病(Hodgkin's disease)或非霍奇金氏病)、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)、多发性骨髓瘤、重链疾病以及实体肿瘤，如肉瘤和癌瘤(例如，纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓质癌(medullary carcinoma)、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒膜癌(choriocarcinoma)、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆氏瘤(Wilm's tumor)、子宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤)。在一些实施例中，癌症是黑素瘤或乳癌。
在另一个实施例中，癌症包含但不限于：间皮瘤、肝胆(肝和胆管)癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、胃肠(胃、结肠直肠和十二指肠)癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金氏病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、睾丸癌、慢性或急性白血病、慢性骨髓性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、非霍奇金氏淋巴瘤、脊轴瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、肾上腺皮质癌、胆囊癌、多发性骨髓瘤、胆管癌、纤维肉瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤或前述癌症中的一或多种的组合。
在一些实施例中，本发明提供一种治疗有需要的患者的肿瘤的方法，其包括向患者投与本文所描述的化合物、盐或药物组合物中的任一种。在一些实施例中，肿瘤包括本文所描述的癌症中的任一种。在一些实施例中，肿瘤包括黑素瘤癌。在一些实施例中，肿瘤包括乳癌。在一些实施例中，肿瘤包括肺癌。在一些实施例中，肿瘤包括小细胞肺癌(SCLC)。在一些实施例中，肿瘤包括非小细胞肺癌(NSCLC)。
在一些实施例中，肿瘤是通过遏制肿瘤的进一步生长来治疗。在一些实施例中，通过将肿瘤的大小(例如，体积或质量)相对于治疗前的肿瘤的大小减少至少5％、10％、25％、50％、75％、90％或99％来治疗肿瘤。在一些实施例中，通过将患者中的肿瘤的量相对于治疗前的肿瘤的量减少至少5％、10％、25％、50％、75％、90％或99％来治疗肿瘤。
其它增殖性疾病
其它增殖性疾病包含例如肥胖症、良性前列腺增生、牛皮癣、异常角质化、淋巴组织增生病症(例如淋巴系统细胞异常增殖的病症)、慢性类风湿性关节炎、动脉硬化、再狭窄(restenosis)和糖尿病性视网膜病。特此以引用的方式并入的增殖性疾病包含美国专利第5,639,600号和第7,087,648号中所描述的那些。
发炎性病症和疾病
本发明化合物也适用于：治疗皮肤的发炎性或过敏性病状，例如牛皮癣、接触性皮炎、异位性皮炎、斑秃、多形性红斑、疱疹样皮炎、硬皮病、白斑病、超敏性血管炎、荨麻疹、大疱性类天疱疮、红斑狼疮、全身性红斑性狼疮症、寻常天疱疮、落叶型天疱疮、副肿瘤性天疱疮、获得性大疱性表皮松懈、寻常痤疮和其它发炎性或过敏性皮肤病状。
本发明化合物还可以用于治疗其它疾病或病状，如具有发炎性组分的疾病或病状，例如治疗眼睛的疾病和病状，如眼过敏、结膜炎、干眼症(keratoconjunctivitissicca)和春季结膜炎；影响鼻部的疾病，包含过敏性鼻炎；和牵涉自身免疫反应或具有自身免疫组分或病因的发炎性疾病，包含自身免疫血液病症(例如溶血性贫血、再生障碍性贫血、纯红细胞贫血和特发性血小板减少症)、全身性红斑性狼疮症、类风湿性关节炎、多软骨炎、硬皮病、韦格纳肉牙肿病(Wegener granulamatosis)、皮肌炎、慢性活动性肝炎、重症肌无力、史蒂芬-约翰逊综合征(Steven-Johnson syndrome)、特发性口炎性腹泻(idiopathicsprue)、自身免疫发炎性肠病(例如溃疡性结肠炎和克罗恩氏病(Crohn's disease))、肠易激综合征(irritable bowel syndrome)、乳糜泻(celiac disease)、牙周炎、透明膜病、肾病、肾小球病、酒精性肝病、多发性硬化症、内分泌眼病变、格雷氏病(Grave's disease)、肉状瘤病、肺泡炎、慢性超敏性肺炎、多发性硬化症、原发性胆汁性肝硬化、葡萄膜炎(前和后)、休格连氏综合征(Sjogren's syndrome)、干眼症和春季角膜结膜炎、间质肺纤维化、牛皮癣性关节炎、全身性幼年型特发性关节炎、隐热蛋白相关周期综合征、肾炎、血管炎、憩室炎、间质性膀胱炎、肾小球肾炎(有或无肾病综合征，例如包含特发性肾病综合征或微小变化肾病变)、慢性肉芽肿性疾病、子宫内膜异位、钩端螺旋体病肾病、青光眼、视网膜病、衰老、头痛、疼痛、复合区域性疼痛综合征、心脏肥大、肌肉萎缩、分解代谢病症、肥胖症、胎儿生长迟缓、高胆固醇血症、心脏病、慢性心力衰竭、间皮瘤、无汗性外胚层发育异常、贝塞特氏病(Behcet's disease)、色素失禁症、佩吉特氏病(Paget's disease)、胰腺炎、遗传性周期性发热综合征、哮喘(过敏性和非过敏性、轻度、中度、重度、支气管炎的和运动诱导的)、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、嗜曙红细胞增多、超敏反应、过敏反应、鼻窦炎、眼睛过敏、二氧化硅诱导的疾病、COPD(减少损害、气道发炎、支气管过度反应、重塑或疾病进展)、肺病、囊性纤维化、酸诱导的肺损伤、肺高血压、多发性神经病变、白内障、肌肉发炎结合全身性硬化症、包涵体肌炎、重症肌无力、甲状腺炎、艾迪森氏病(Addison's disease)、扁平苔癣、1型糖尿病或2型糖尿病、阑尾炎、异位性皮炎、哮喘、过敏、睑炎、细支气管炎、支气管炎、滑囊炎、宫颈炎、胆管炎、胆囊炎、慢性移植排斥、结肠炎、结膜炎、克罗恩氏病、膀胱炎、泪腺炎、皮炎、皮肌炎、脑炎、心内膜炎、子宫内膜炎、肠炎、小肠结肠炎、上髁炎、附睾炎、筋膜炎、纤维组织炎、胃炎、肠胃炎、过敏性紫癜、肝炎、化脓性汗腺炎、免疫球蛋白A肾病变、间质性肺病、喉炎、乳腺炎、脑膜炎、脊髓炎、心肌炎、肌炎、肾炎、卵巢炎、睾丸炎、骨炎、耳炎、胰腺炎、腮腺炎、心包炎、腹膜炎、咽炎、胸膜炎、静脉炎、局限性肺炎(pneumonitis)、肺炎(pneumonia)、多发性肌炎、直肠炎、前列腺炎、肾盂肾炎、鼻炎、输卵管炎、鼻窦炎、口腔炎、滑膜炎、肌腱炎、扁桃体炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、阴道炎、血管炎或外阴炎。
在一些实施例中，可以根据本发明的方法治疗的发炎性疾病为皮肤疾病。在一些实施例中，皮肤的发炎性疾病是选自接触性皮炎、异位性皮炎、斑秃、多形性红斑、疱疹样皮炎、硬皮病、白斑病、超敏性血管炎、荨麻疹、大疱性类天疱疮、寻常天疱疮、落叶型天疱疮、副肿瘤性天疱疮、获得性大疱性表皮松懈和皮肤的其它发炎性或过敏性病状。
在一些实施例中，可以根据本发明的方法治疗的发炎性疾病是选自急性和慢性痛风、慢性痛风性关节炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、全身性幼年型特发性关节炎(Systemic jubenile idiopathic arthritis，SJIA)、隐热蛋白相关周期综合征(CAPS)和骨关节炎。
在一些实施例中，可以根据本发明的方法治疗的发炎性疾病为TH17介导的疾病。在一些实施例中，TH17介导的疾病是选自全身性红斑性狼疮症、多发性硬化症和发炎性肠病(包含克罗恩病或溃疡性结肠炎)。
在一些实施例中，可以根据本发明的方法治疗的发炎性疾病是选自休格连氏综合征；过敏性病症；骨关节炎；如眼过敏、结膜炎、干眼症和春季结膜炎的眼睛病状；和影响鼻部的疾病，如过敏性鼻炎。
代谢疾病
在一些实施例中，本发明提供一种治疗代谢疾病的方法。在一些实施例中，代谢疾病是选自1型糖尿病、2型糖尿病、代谢综合征或肥胖症。
根据本发明的方法的化合物和组合物可以使用对于治疗癌症、自体免疫性病症、增生性病症、发炎性病症、神经退化性或神经病症、精神分裂症、骨相关病症、肝病或心脏病症或减轻其严重程度有效的任何量和任何投与途径来投与。所需的确切量将因个体而异，这取决于个体的物种、年龄和一般状况、感染的严重程度、特定药剂、其投与模式等。优选地按单位剂型调配本发明化合物以易于实现投与和剂量均一性。如本文所用，表述“单位剂型”是指适于待治疗患者的药剂的物理离散单元。然而，应理解，本发明化合物和组合物的总日用量将由主治医师在合理医学判断范围内决定。对于任何特定患者或生物体的特定有效剂量水平将取决于多种因素，包含所治疗的病症和病症的严重程度；所用特定化合物的活性；所用特定组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所用特定化合物的投与时间、投与途径和排泄率；治疗持续时间；与所用特定化合物组合或同时使用的药物；和医学领域中熟知的类似因素。如本文所用，术语“患者”意指动物，优选为哺乳动物，并且最优选为人类。
本发明的药学上可接受的组合物可以经口、经直肠、非经肠、脑池内、阴道内、腹膜内、局部(如通过散剂、软膏或滴剂)、经颊、作为经口或经鼻喷雾等向人类和其它动物投与，取决于所治疗感染的严重程度。在某些实施例中，本发明化合物可以经口或非经肠以每天约0.01mg/kg到约50mg/kg并且优选约1mg/kg到约25mg/kg个体体重的剂量水平一天一或多次投与，以获得所需治疗效果。
用于经口投与的液体剂型包含但不限于药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除了活性化合物之外，液体剂型还可能含有所属领域中常用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(尤其是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯和其混合物。除了惰性稀释剂之外，口服组合物还可以包含佐剂，如湿润剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂和芳香剂。
可以根据已知技术使用适合的分散剂或湿润剂和悬浮剂来调配可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性悬浮液。无菌可注射制剂也可以为无毒非经肠可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液或乳液，例如呈在1,3-丁二醇中的溶液形式。可以采用的可接受媒剂和溶剂是水、林格氏溶液、U.S.P.及等张氯化钠溶液。另外，无菌不挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质。出于此目的，可以采用任何温和的不挥发性油，包含合成单甘油酯或二甘油酯。此外，在可注射剂制备中使用如油酸的脂肪酸。
可注射调配物可以例如通过通过细菌截留过滤器过滤或通过并入灭菌剂来灭菌，所述灭菌剂呈可以在使用前溶解或分散于无菌水或其它无菌可注射介质中的无菌固体组合物形式。
为了延长本发明化合物的作用，通常需要皮下或肌肉内注射的化合物缓慢吸收。这可以通过使用具有水溶性差的结晶或非晶形材料的液体悬浮液来实现。化合物的吸收速率随后取决于其溶解速率，溶解速率转而可能取决于晶体大小和结晶形式。可替代地，通过将化合物溶解或悬浮于油媒剂中来实现非经肠投与的化合物形式的延迟吸收。通过形成化合物在生物可降解聚合物(如聚丙交酯-聚乙交酯)中的微胶囊基质来制备可注射积存形式。取决于化合物与聚合物的比率和所用特定聚合物的性质，可以控制化合物的释放速率。其它生物可降解聚合物的实例包含聚(原酸酯)和聚(酸酐)。还通过将化合物包覆于与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备积存可注射调配物。
用于经直肠或经阴道投与的组合物优选是可以通过将本发明化合物与适合的无刺激性赋形剂或载剂(如可可脂、聚乙二醇)混合而制备的栓剂；或在环境温度下是固体但在体温下是液体并且因此在直肠或阴道腔中熔化并释放活性化合物的栓剂蜡。
用于经口投与的固体剂型包含胶囊、片剂、丸剂、散剂和颗粒。在此类固体剂型中，活性化合物与以下各者混合：至少一种惰性、药学上可接受的赋形剂或载剂，如柠檬酸钠或磷酸二钙，和/或a)填充剂或增量剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸；b)粘合剂，例如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；c)保湿剂，如甘油；d)崩解剂，如琼脂-琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；e)溶液迟延剂，如石蜡；f)吸收促进剂，如季铵化合物；g)湿润剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；h)吸附剂，如高岭土和膨润土；和i)润滑剂，如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠和其混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型还可以包括缓冲剂。
还可以使用类似类型的固体组合物作为使用如乳糖(lactose/milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等的此类赋形剂的软和硬填充明胶胶囊中的填充剂。片剂、糖衣药丸、胶囊、丸剂及颗粒的固体剂型可以用包衣和外壳(如肠溶包衣和药物调配领域中熟知的其它包衣)来制备。其可以任选地含有乳浊剂，并且还可以具有使其任选地在肠道某一部分中以延迟方式仅或优先释放一或多种活性成分的组成。可以使用的包埋组合物的实例包含聚合物质和蜡。还可以使用类似类型的固体组合物作为使用如乳糖(lactose/milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等的此类赋形剂的软和硬填充明胶胶囊中的填充剂。
活性化合物还可以呈与如上文所提及的一或多种赋形剂的微胶囊化形式。片剂、糖衣药丸、胶囊、丸剂以及颗粒的固体剂型可以用包衣和外壳(如肠溶衣、释放控制包衣和药物调配领域中熟知的其他包衣)来制备。在此类固体剂型中，活性化合物可以与至少一种惰性稀释剂(如蔗糖、乳糖或淀粉)混合。正常实践时，此类剂型还可以包括除惰性稀释剂以外的额外物质，例如压片润滑剂和其它压片助剂，如硬脂酸镁和微晶纤维素。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型还可以包括缓冲剂。其可以任选地含有乳浊剂，并且还可以具有使其任选地在肠道某一部分中以延迟方式仅或优先释放一或多种活性成分的组成。可以使用的包埋组合物的实例包含聚合物质和蜡。
用于局部或经皮投与的本发明化合物的剂型包含软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、散剂、溶液、喷雾剂、吸入剂或贴片。在无菌条件下将活性组分与药学上可接受的载剂和任何所需的防腐剂或缓冲剂按要求混合。眼用调配物、滴耳剂和滴眼剂也涵盖在本发明的范围内。另外，本发明涵盖了使用经皮贴片，其具有提供化合物可控制地递送到身体的额外优点。此类剂型可以通过将化合物溶解或分配于适当介质中来制备。还可以使用吸收增强剂来增加化合物穿过皮肤的通量。可以通过提供速率控制膜或将化合物分散于聚合物基质或凝胶中来控制速率。
根据一个实施例，本发明涉及一种调节生物样品中的靶RNA的活性的方法，其包括使所述生物样品与本发明化合物或包括所述化合物的组合物接触的步骤。
根据另一个实施例，本发明涉及一种调节生物样品中的靶RNA的活性的方法，其包括使所述生物样品与本发明化合物或包括所述化合物的组合物接触的步骤。在某些实施例中，本发明涉及一种不可逆地抑制生物样品中的靶RNA的活性的方法，其包括使所述生物样品与本发明化合物或包括所述化合物的组合物接触的步骤。
如本文所用，术语“生物样品”包含但不限于细胞培养物或其提取物；从哺乳动物获得的活组织检查物质或其提取物；和血液、唾液、尿液、粪便、精液、眼泪、脑脊髓液或其它体液或其提取物。
本发明的另一个实施例涉及一种调节患者中的靶RNA的活性的方法，其包括向所述患者投与本发明化合物或包括所述化合物的组合物的步骤。
根据另一个实施例，本发明涉及一种抑制患者中的靶RNA的活性的方法，其包括向所述患者投与本发明化合物或包括所述化合物的组合物的步骤。根据某些实施例，本发明涉及一种不可逆地抑制患者中的靶RNA的活性的方法，其包括向所述患者投与本发明化合物或包括所述化合物的组合物的步骤。在其它实施例中，本发明提供一种治疗有需要的患者的由靶RNA介导的病症的方法，其包括向所述患者投与根据本发明的化合物或其药学上可接受的组合物的步骤。此类病症详细描述于本文中。
例证
如以下实例中所描绘，示例性化合物是根据以下一般程序制备并且用于本文一般描述的生物分析和其它程序中。应了解，虽然一般方法描绘了某些本发明化合物的合成，但以下一般方法和所属领域普通技术人员已知的其它方法可以适用于如本文所描述的所有化合物和这些化合物中的每一者的子类和物种。类似地，分析和其它分析可以根据所属领域的普通技术人员的知识来进行调整。
实例1：应用光探针以定位和定量RNA中的修饰位点
如上文所论述，多种RNA分子在细胞中起重要调节作用。RNA二级和三级结构对于这些调节活性来说很关键。各种工具可以用于确定RNA结构。最有效的方法中的一个是SHAPE(选择性2'-羟基酰化和引子延伸)。这种方法利用所有RNA中的核糖基团都具有反应性会受局部核苷酸柔性和对溶剂的可接近性影响的2'-羟基的特征。这种2′-羟基在RNA为单链并且为柔性的区域中具有反应性，但在碱基配对的核苷酸处不具反应性。换句话说，SHAPE反应性与核苷酸在RNA二级结构内碱基配对的概率成反比。在这种2'-羟基处化学修饰RNA的试剂可以用作探针以辨别RNA结构。SHAPE试剂包含与柔性核苷酸的2'-羟基反应以形成2'-O-加合物的小分子，如1-甲基-7-硝基靛红酸酐(1M7)和苯甲酰氰(BzCN)。可以使用其它酰化亲电子试剂，如2-甲基烟碱酸咪唑化物(NAI)和2-甲基-3-糠酸咪唑化物(FAI)。
本发明的一个有用方面为将RNA结合小分子配体系栓到光探针。这将光激活介导的共价修饰事件与配体结合事件联系，使得光探针最可能与接近(例如进空间)配体的结合位点的RNA的的一部分反应。因此，RNA上的修饰模式将以决定性方式改变，因为光激活剂的活性将被限制于邻近RNA上的配体结合袋的核苷酸。因此，如在如测序的适当分析方法中所揭露，可以从改变的反应性模式推断配体结合袋的存在和位置。
SHAPE-MaP方法利用导致逆转录酶错读SHAPE修饰的核苷酸并且将与原始序列非互补的核苷酸并入到新合成的cDNA中的条件。将SHAPE加合物的位置和相对频率记录为cDNA一级序列中的突变。在SHAPE-MaP实验中，将RNA用SHAPE试剂处理或仅用溶剂处理，并且对RNA进行修饰。使来自每个实验条件的RNA逆转录，并且随后对所得cDNA测序。通过从未经处理样品获得的数据减去经处理样品的数据并且通过对变性(未折叠)对照RNA的数据归一化，来识别反应位置。
SHAPE-MaP可以根据详细公开的方法来进行和分析(马丁(Martin)等人,RNA2012；18:77-87；麦吉尼斯(McGuinness)等人,美国化学学会杂志2012；134:6617-6624；齐格弗里德(Siegfried)等人,自然方法(Nature Methods)2014；11:959-965；莱文达(Lavender)等人,公共科学图书馆计算生物学(PLoS Comput.Biol.)2015；11(5)e1004230；麦吉尼斯等人,美国国家科学院院刊2015；112:2425-2430)。SHAPE-MaP序列数据可以使用ShapeFinder(瓦萨(Vasa)等人,RNA 2008；14:1979-1990)或ShapeMapper(齐格弗里德等人,自然方法2014；11:959-965)或其它软件进行分析。前述出版物中的每一个特此以引用的方式并入。
PEARL-seq(通过RNA连接测序的邻近增强激活)偏离SHAPE和SHAPE-MaP，因为其使用系链将酰化事件连接到配体结合事件，因此以决定性方式改变在测序中观测到为‘突变’的酰化模式，因为仅将邻近配体结合袋的核糖酰化。由此推断靶向RNA上小分子结合位点的存在以及那些配体结合位点在转录物组上的位置。可以通过点击可点击生物素，并且随后与珠粒上的链霉亲和素复合，拉下还携有点击官能团的那些RNA配体/系链/弹头构筑体(‘钩’)。这种点击/拉下方案使得能够仅对通过‘钩’共价修饰的那些RNA测序。分别对靶向RNA执行的SHAPE-MaP与RING-MaP方案使得能够构建靶向RNA的结构模型作为增强“共价亲和力转录物组学”序列数据的解释的框架。通过细胞中的游离配体的生物活性来测量成果。
用于本发明的文库含有系栓到亲电子弹头的小分子(“RNA配体”)，所述小分子选择性地与接近靶RNA中的结合位点的核苷酸形成共价键。文库的多样性涵盖RNA配体结构、系链结构和弹头结构的变化形式。
将RNA配体基于关于RNA亲和力的结构决定因素的假设设计，并且随后合成并附接到系链和弹头。作为一个实例，劳(Lau)和同事使用SELEX(通过指数增浓的配体的系统性进化)来进化称为适体-21的短RNA序列，作为高亲和力适体(Kd＝50nM)来对抗杂芳基二氢嘧啶结构，以下化合物1b(本文中的I-1)：
Figure BDA0002508295540000911
(劳,J.L.；巴克什,M.M.(Baksh,M.M.)；费德勒,J.D.(Fiedler,J.D.)；布朗,S.D.(Brown,S.D.)；库斯洛,A.(Kussrow,A.)；博恩霍普,D.J.(Bornhop,D.J.)；奥杜卡尼安,P.(Ordoukhanian,P.)；芬,M.G.(Finn,M.G.)美国化学学会·纳米(ACS Nano),2011,5,7722-7729；更多关于SELEX的信息还参考例如：a)S.E.奥斯伯恩(S.E.Osborne),A.D.艾灵顿(A.D.Ellington),化学评论1997,97,349-370；b)L.戈尔德(L.Gold),D.布朗(D.Brown),Y.Y.何(Y.Y.He),T.什塔特兰(T.Shtatland),B.S.辛格(B.S.Singer),Y.吴(Y.Wu),美国国家科学院院刊1997,94,59-64；c)L.戈尔德(L.Gold),B.波利斯基(B.Polisky),O.乌伦贝克(O.Uhlenbeck.,M.雅鲁士(M.Yarus),生物化学年鉴1995,64,763-797)。选择这一结构作为不具有与哺乳动物或细菌细胞的交叉反应性的代表性药物样分子。作者还通过表达技术在病毒样粒子内部衣壳化的更长RNA序列中包埋适体21、其较弱结合变异体和针对茶碱的已知适体。这些核蛋白粒子通过反向散射干涉法展示以与游离(非衣壳化)适体类似的那些亲和力与小分子配体结合。化合物I-1为水溶性、无毒的，并且结构与天然生物分子充分不相似以最小化脱靶结合。其特征在于安置有与铜催化叠氮化炔烃环加成(CuAAC)化学反应的1,4-三唑键，其实现配体与其它所关注的分子的方便连接。预期本文所描述的其它HAP变异体具有类似的有利特性。此外，适体21RNA作为起点的使用提供了已知结构的良好表征的RNA的有点，并且其与I-1的结合模式可以参考原始公开案来验证。适体21具有以下序列：GGGUAGGCCAGGCAGCCAACUAGCGAGAGCUUAAAUCUCUGAGCCCGAGAGGGUUCAGUGCUGCUUAUGUGGACGGCU(SEQ.ID:25)。
可替代地，RNA配体基于其与已知RNA配体的类似性或与RNA结合袋的互补性而选自可商购来源，购入，并且使其经历进一步合成以附接到系链和弹头。实例包含但不限于：四环素抗生素、氨基糖苷抗生素、茶碱和类似结构(例如，黄嘌呤)、瑞博希和类似结构、利奈唑胺和类似结构。在第三并且互补方法中，使用组合化学技术制备RNA配体文库。具体来说，使所选系链连接到支持有机合成的聚合物，并且通过一系列合成化学步骤，以一个珠粒一个化合物形式制得化合物。这些步骤导致在最终RNA配体中并入由广泛范围的官能团连接的广泛范围的片段和反应物。释放那些化合物，并且最终脱珠粒步骤为附接RNA弹头。
作为文库的功能结果的关键要素，对于每个RNA配体和RNA弹头，并入多种结构不同的系链以便优化系链长度、系链柔性和耐受额外官能团(具体来说，点击官能团)的能力。所研究的特定系链包含含有一到六个乙烯单元的寡聚乙二醇、高度柔性(例如，含有一到六个氨基酸的寡甘氨酸或寡-N-甲基甘氨酸)或刚性更大(例如，含有一到六个氨基酸的寡脯氨酸或寡-4-羟基脯氨酸)的寡肽。将点击官能团并入到寡聚乙二醇系链中需要在系链的RNA配体或RNA弹头末端插入携有可点击官能团的氨基酸。将点击官能团并入到寡肽系链中仅仅需要用携有可点击官能团的氨基酸置换氨基酸残基中的任一个。
RNA弹头是选自已知或修饰的光激活官能团。额外弹头将通过(1)对前述弹头合成修饰以确立RNA弹头的结构/活性关系以及(2)筛选可商购的光激活基团来识别。
点击官能团是选自所公开的点击试剂和反应物的标准‘工具包’。本发明工作集中于叠氮化物、炔烃(末端和应变)、二烯、四嗪和亲二烯体。
SHAPE、SHAPE-MaP和PEARL-seq方法的其它细节，包含替代试剂、条件和数据分析描述于WO 2017/136450、WO 2015/054247、US 2014/0154673、U.S.7,745,614和U.S.8,313,424中，所述文献中的每一者特此以全文引用的方式并入。
实例2：CPNQ类似物和其它基于喹啉的配体的制备
基于CPNQ和其它喹啉骨架的示例性小分子配体可以基于WO2017/136450中所示的合成方案制备，所述合成方案特此以全文引用的方式并入。
实例3：示例性光探针化合物的合成
通常：除非另外指出，否则所有反应都在N2氛围下进行。所有溶剂和试剂均在不经进一步纯化的情况下按原样使用。化合物1是如先前劳,J.L.；巴克什,M.M.；费德勒,J.D.；布朗,S.D.；库斯洛,A.；博恩霍普,D.J.；奥杜卡尼安,P.；芬,M.G.美国化学学会·纳米,2011,5,7722-7729中所描述的来合成。3-叠氮基-5-(叠氮基甲基)苯甲酸是如先前吉田,S.(Yoshida,S.)；三泽,Y.(Misawa,Y.)；细谷,T.(Hosoya,T.)欧洲有机化学杂志(Eur.J.Org.Chem.),2014,19,3991-3995中所描述的来制备。旋转蒸发是在30托下在40℃以下的浴温度下进行。分析性LC-MS数据是在配备有超高效BEH(Acquity BEH)1.7μm C18柱(2.1×50mm)和90:10A:B到40:60A:B的洗脱梯度(持续2.3分钟)的沃特世超高效UPLC(Waters Acquity UPLC)系统上获得，其中A＝含0.1％甲酸的水，并且B＝含0.1％甲酸的乙腈，并且流动速率为0.80mL/分钟。柱色谱是在特尔戴恩公司伊斯科闪式色谱Rf+系统(Teledyne Isco Combiflash Rf+system)上使用预填充RediSep Rf+戈尔德硅胶(特尔戴恩公司伊斯科)或40-60μm球形C18硅胶柱(艾杰尔(Agela))进行。在Bruker 400MHz光谱仪上获得NMR光谱；化学位移参考溶剂的残余单-1H-同位素体：CHD2OD＝3.31ppm；CD3SOCD2H＝2.49ppm；CHCl3＝7.26ppm。
Figure BDA0002508295540000941
化合物2：在室温下向MeOH(4mL)和H2O(1mL)的溶液中添加1(100mg，242μmol，1当量)、2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙胺(42mg，242μmol，1.0当量)、CuSO4·5H2O(60mg，242μmol，1.0当量)和抗坏血酸钠(96mg，483μmol，2.0当量)。在20℃下搅拌混合物0.5小时。用NaHCO3饱和水溶液(30mL)稀释混合物，随后用EtOAc萃取混合物(3×50mL)。合并的萃取物用NaCl饱和水溶液洗涤，随后经Na2SO4干燥。过滤固体并且在减压下浓缩滤液，以得到呈黄色固体状的粗产物。通过制备型HPLC，使用菲罗门(Phenomenex)Synergi C18柱(150×25×10μm)来纯化残余物，用含10-30％CH3CN的含0.05％HCl的水梯度洗脱，以得到呈黄色固体状的2(HCl盐，65mg，43％产率)。LCMS：tR：1.749分钟；(M+H)＝588.2。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)ppm＝9.12(br s,2H),8.21(br d,J＝17.1Hz,3H),7.76(dd,J＝6.0,8.7Hz,1H),7.42(dd,J＝2.4,8.6Hz,1H),7.26(dt,J＝2.6,8.3Hz,1H),6.42(s,1H),5.02-4.93(m,2H),4.84(s,2H),4.65(t,J＝5.0Hz,2H),3.94(t,J＝5.0Hz,2H),3.75-3.55(m,9H),3.10(t,J＝4.8Hz,2H)。
Figure BDA0002508295540000942
通用程序A-HATU介导的酸胺偶合反应：在室温下含甲酸(1.2当量)的DMF(0.05M)的搅拌溶液中添加HATU(2.0当量)、N,N-二异丙基乙胺(4.0当量)和伯胺(1当量)。将所得溶液在室温下培育2-16小时，随后将反应混合物直接装载到预填充C18-硅胶柱上以用于纯化。合并含有所期望的产物的部分，在-78℃(丙酮/CO2)下冷冻，并且冻干以得到呈固体状的最终光探针化合物。
Figure BDA0002508295540000951
化合物3：根据以上通用程序A，由2(30mg，51μmol)和4-苯甲酰苯甲酸制备化合物3。粗产物混合物通过C18-硅胶上的反相色谱纯化，用含0.1％甲酸的水中的0-100％CH3CN洗脱。将探针3分离为浅棕褐色固体(甲酸盐，39mg，83％产率)。LC-MS：tR：1.49分钟；[M+H]+796.2。
Figure BDA0002508295540000952
化合物4：根据以上通用程序A，由2(30mg，51μmol)和4-[3-(三氟甲基)-3H-双吖丙啶-3-基]苯甲酸制备化合物4。粗产物混合物通过C18-硅胶上的反相色谱纯化，用含0.1％甲酸的水中的0-100％CH3CN洗脱。将化合物4分离为亮黄色固体(甲酸盐，19mg，44％产率)。LC-MS：tR：1.56分钟；[M+H]+800.2。
Figure BDA0002508295540000961
化合物5：根据以上通用程序A，由2(50mg，85μmol)和4-叠氮苯甲酸(作为甲基叔丁基醚中的0.2M溶液)制备化合物5。在室温下搅拌3小时之后，将粗产物混合物部分浓缩以去除甲基叔丁基醚，随后通过在C18-硅胶上的反相色谱纯化所得产物溶液(在DMF中)，用含0.1％甲酸的水中的0-100％CH3CN洗脱。将化合物5分离为亮黄色固体(甲酸盐，32mg，49％产率)。LC-MS：tR：1.45分钟；[M+H]+733.2。
Figure BDA0002508295540000962
化合物6：在室温下向含2(30mg，51μmol，1当量)的DMF(2.0mL)的搅拌溶液中添加N,N-二异丙基乙胺(27μL，153μmol，3.0当量)和3-(3-甲基-3H-双吖丙啶-3-基)丙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-酯(12mg，54μmol，1.05当量)。使所得亮黄色反应混合物在室温下搅拌2小时，随后通过C18-硅胶上的快速柱色谱立即纯化，用含0.1％甲酸的水中的0-60％CH3CN洗脱。在减压下浓缩含有所期望的产物的部分以去除CH3CN，随后在-78℃下冷冻并冻干，以得到呈浅黄色固体状的所期望的产物6(甲酸盐，16.0mg，42％产率)。LC-MS：tR：1.40分钟；[M+H]+698.3。
Figure BDA0002508295540000971
化合物7：向含1(321mg，0.78mmol，1当量)的叔BuOH(4.0mL)和水(4.0mL)的搅拌悬浮液中添加3-叠氮基丙胺(93mg，0.93mmol，1.2当量)和CuSO4·5H2O(15mg，62μmol，0.08当量)。向所得悬浮液中添加含抗坏血酸钠(46mg，0.23mmol，0.30当量)的水(1.0mL)的溶液。使所得悬浮液在室温下剧烈搅拌2小时，随后在减压下浓缩以去除叔BuOH。剩余的粗产物溶液通过C18-硅胶上的快速柱色谱直接纯化，用含0.1％NH3的水中的0-30％CH3CN洗脱。将含有所期望的产物的部分在-78℃下冷冻并冻干，以得到呈浅黄色固体状的化合物7(305mg，77％产率)。LCMS：tR：1.19分钟；[M+H]+514.2。
Figure BDA0002508295540000972
化合物8：在室温下，向含7(30mg，58μmol，1当量)的DMF(2.0mL)的搅拌溶液中添加N,N-二异丙基乙胺(41μL，233μmol，4.0当量)和3-(3-甲基-3H-双吖丙啶-3-基)丙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-酯(14mg，64μmol，1.10当量)。使所得亮黄色反应混合物在室温下搅拌2小时，随后通过C18-硅胶上的快速柱色谱立即纯化，用含0.1％甲酸的水中的0-100％CH3CN洗脱。在减压下浓缩含有所期望的产物的部分以去除CH3CN，随后在-78℃下冷冻并冻干，以得到呈浅黄色固体状的所期望的产物(甲酸盐，17.0mg，44％产率)。LC-MS：tR：1.40分钟；[M+H]+624.2。
Figure BDA0002508295540000981
化合物9：在室温下，向含4-[3-(三氟甲基)-3H-双吖丙啶-3-基]苯甲酸(27mg，116μmol，1.2当量)的CH2Cl2(2.0mL)的搅拌悬浮液中添加DMF(约10μL)和含乙二酰氯的CH2Cl2(49μL，98μmol，1.0当量)的2.0M溶液。使所得透明、无色混合物在室温下搅拌1小时，随后添加7(50mg，97μmol，1当量)和N,N-二异丙基乙胺(68μL，0.39mmol，4.0当量)。使混合物在室温下搅拌3小时，随后在减压下浓缩。粗产物通过C18-硅胶上的反相快速柱色谱纯化，用含0.1％甲酸的水中的0-100％CH3CN洗脱。将含有所期望的产物的部分合并并且部分蒸发，随后在-78℃下冷冻并冻干，以得到呈黄色固体状的所期望的产物(甲酸盐，32mg，47％产率)。LC-MS：tR：1.57分钟；[M+H]+726.0。
通用程序B-氨基酸、甲酸NHS酯和胺的三组分偶合：在室温下，向含氨基酸(1当量)的DMF(2.0mL)的悬浮液中添加N,N-二异丙基乙胺(4.0当量)和甲酸N-羟基丁二酰亚胺酯(1.05当量)。使所得悬浮液在室温下搅拌12-48小时。一旦酰胺形成完成(如通过LC-MS分析确定)，就添加3-氧化六氟磷酸1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓(HATU)(2.0当量)和胺(1.2当量)，并且使所得亮黄色混合物在室温下搅拌3小时。通过C18硅胶上的柱色谱直接纯化混合物。将含有所期望的产物的部分合并并且部分蒸发以去除CH3CN，随后在-78℃下冷冻并冻干，以得到呈固体状的所期望的产物。
Figure BDA0002508295540000991
化合物10：根据以上通用程序B，由L-光亮氨酸(25mg，0.17mmol，1当量)、生物素N-羟基丁二酰亚胺酯(62mg，0.18mmol，1.05当量)和2(122mg，0.21mmol，1.2当量)制备化合物10。混合物通过C18硅胶上的柱色谱直接纯化，用含0.1％甲酸的水中的0-100％CH3CN洗脱。将含有所期望的产物的部分合并并且部分蒸发以去除CH3CN，随后在-78℃下冷冻并冻干，以得到呈黄色固体状的所期望的产物(甲酸盐，97mg，57％产率)。LC-MS：tR：1.35分钟；[M+H]+939.3。
Figure BDA0002508295540000992
化合物11：根据以上通用程序B，由Nα-叔丁氧基羰基-L-赖氨酸(50mg，0.20mmol，1当量)、3-(3-甲基-3H-双吖丙啶-3-基)丙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-酯(48mg，0.21mmol，1.05当量)和2(142mg，0.24mmol，1.2当量)制备化合物11。混合物通过C18硅胶上的柱色谱直接纯化，用含0.1％甲酸的水中的0-50％CH3CN洗脱。将含有所期望的产物的部分合并并且部分蒸发以去除CH3CN，随后在-78℃下冷冻并冻干，以得到呈黄色固体状的所期望的产物(甲酸盐，120mg，61％产率)。LC-MS：tR：1.46分钟；[M+H]+926.4。
Figure BDA0002508295540001001
化合物12：根据以上通用程序B，由Nα-叔丁氧基羰基-L-赖氨酸(50mg，0.20mmol，1当量)、生物素N-羟基丁二酰亚胺酯(72mg，0.21mmol，1.05当量)和2(142mg，0.24mmol，1.2当量)制备化合物12。混合物通过C18硅胶上的柱色谱直接纯化，用含0.1％甲酸的水中的0-50％CH3CN洗脱。将含有所期望的产物的部分合并并且部分蒸发以去除CH3CN，随后在-78℃下冷冻并冻干，以得到呈黄色固体状的所期望的产物(甲酸盐，105mg，48％产率)。LC-MS：tR：1.38分钟；[M+H]+1042.4。
Figure BDA0002508295540001002
化合物13：在0℃下，将含11(40mg，41μmol，1当量)的CH2Cl2(1.0mL)的搅拌溶液用纯三氟乙酸(250μL)逐滴处理。使所得混合物升温到室温，随后使其在室温下搅拌15分钟。将混合物在减压下浓缩到干燥，以得到粗伯胺。将粗胺再悬浮于DMF(1.0mL)中，随后用N,N-二异丙基乙胺(72μL，0.41mmol，10.0当量)、生物素(15mg，62μmol，1.5当量)和HATU(31mg，82μmol，2.0当量)处理。将所得亮黄色混合物维持在室温下2小时，随后立即装载到C18-硅胶柱上，用含0.1％甲酸的水中的0-70％CH3CN洗脱。将含有所期望的产物的部分合并并且在减压下部分蒸发以去除CH3CN，随后冷冻并冻干，以得到呈黄色固体状的所期望的产物(甲酸盐，27mg，60％产率)。LC-MS：tR：1.38分钟；[M+H]+1052.4。
Figure BDA0002508295540001011
化合物14：在0℃下，将含12(40mg，37μmol，1当量)的CH2Cl2(1.0mL)的搅拌溶液用纯三氟乙酸(250μL)逐滴处理。使所得混合物升温到室温，随后使其在室温下搅拌55分钟。将混合物在减压下浓缩到干燥，以得到粗伯胺。将粗胺再悬浮于DMF(1.0mL)中，随后随后用N,N-二异丙基乙胺(64μL，0.37mmol，10.0当量)和3-(3-甲基-3H-双吖丙啶-3-基)丙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-酯(10mg，44μmol，1.2当量)处理。将所得亮黄色混合物维持在室温下16小时，随后立即装载到C18-硅胶柱上，用含0.1％甲酸的水中的0-70％CH3CN洗脱。将含有所期望的产物的部分合并并且在减压下部分蒸发以去除CH3CN，随后冷冻并冻干，以得到呈黄色固体状的所期望的产物(甲酸盐，22mg，54％产率)。LC-MS:tR:1.37min；[M+H]+1052.4.
Figure BDA0002508295540001021
化合物15：根据以上通用程序B，使用Nε-叔丁氧基羰基-L-赖氨酸(175mg，0.71mmol，1当量)、生物素N-羟基丁二酰亚胺酯(252mg，0.74mmol，1.05当量)和2(500mg，0.85mmol，1.2当量)制备化合物15。在反应完成之后(如通过LC-MS分析确定)，反应混合物用EtOAc(150mL)稀释并且用4×40mL若干份水洗涤。有机相经Na2SO4干燥，过滤固体并且浓缩滤液，以得到呈黄色胶状的粗产物。将粗产物用乙醚:戊烷(1:1，10mL)湿磨一次，随后将所得固体溶解于甲醇(5mL)中并冷却到-50℃。添加乙醚(20mL)，随后通过过滤收集所得固体，以得到呈黄色固体状的15(380mg，43％产率)。LC-MS：tR：1.40分钟；[M+H]+1042.1。
Figure BDA0002508295540001031
化合物16：与化合物15类似地制备化合物16，不同之处在于使用Nε-叔丁氧基羰基-D-赖氨酸(900mg，1.90mmol，1当量)代替Nε-叔丁氧基羰基-L-赖氨酸作为起始氨基酸。获得呈黄色固体状的化合物16(1.03g，52％产率)。LC-MS：tR：1.40分钟；[M+H]+1042.1。
Figure BDA0002508295540001041
化合物17：在0℃下，用三氟乙酸(0.25mL)处理含15(55mg，53μmol，1当量)的CH2Cl2(1.0mL)的溶液。使所得混合物历经15分钟升温到室温。此后，在减压下将混合物浓缩到干燥。将所得粗胺溶解于DMF(2.0mL)中，随后用含4-叠氮苯甲酸的甲基叔丁基醚(0.53mL，0.11mmol，2.0当量)的0.2M溶液、HATU(40mg，0.11mmol，2.0当量)和N,N-二异丙基乙胺(37μL，0.21mmol，4.0当量)处理。使所得混合物在室温下搅拌整夜，随后部分浓缩以去除甲基叔丁基醚。所得产物溶液(在DMF中)通过C18-硅胶上的柱色谱直接纯化，用含0.1％甲酸的水中的0-100％CH3CN洗脱。将含有所期望的产物的部分合并并且部分蒸发以去除CH3CN，随后在-78℃下冷冻并冻干，以得到呈黄色固体状的17(甲酸盐，35mg，58％产率)。LC-MS：tR：1.41分钟；[M+H]+1087.4。
Figure BDA0002508295540001051
化合物18：在0℃下，用三氟乙酸(0.25mL)处理含16(55mg，53μmol，1当量)的CH2Cl2(1.0mL)的溶液。使所得混合物历经15分钟升温到室温。此后，在减压下将混合物浓缩到干燥。将所得粗胺溶解于DMF(2.0mL)中，随后用含4-叠氮苯甲酸的甲基叔丁基醚(0.53mL，0.11mmol，2.0当量)的0.2M溶液、HATU(40mg，0.11mmol，2.0当量)和N,N-二异丙基乙胺(37μL，0.21mmol，4.0当量)处理。使所得混合物在室温下搅拌整夜，随后部分浓缩以去除甲基叔丁基醚。所得产物溶液(在DMF中)通过C18-硅胶上的柱色谱直接纯化，用含0.1％甲酸的水中的0-100％CH3CN洗脱。将含有所期望的产物的部分合并并且部分蒸发以去除CH3CN，随后在-78℃下冷冻并冻干，以得到呈黄色固体状的18(甲酸盐，38mg，63％产率)。LC-MS：tR：1.41分钟；[M+H]+1087.4。
Figure BDA0002508295540001061
化合物19：在0℃下，用三氟乙酸(0.25mL)处理含15(55mg，53μmol，1当量)的CH2Cl2(1.0mL)的溶液。使所得混合物历经15分钟升温到室温。此后，在减压下将混合物浓缩到干燥。将所得粗胺溶解于DMF(2.0mL)中，随后用4-[3-(三氟甲基)-3H-双吖丙啶-3-基]苯甲酸(24mL，0.11mmol，2.0当量)、HATU(40mg，0.11mmol，2.0当量)和N,N-二异丙基乙胺(37μL，0.21mmol，4.0当量)处理。使所得混合物在室温下搅拌整夜，随后所得产物溶液(在DMF中)通过C18-硅胶上的柱色谱直接纯化，用含0.1％甲酸的水中的0-100％CH3CN洗脱。将含有所期望的产物的部分合并并且部分蒸发以去除CH3CN，随后在-78℃下冷冻并冻干，以得到呈黄色固体状的19(甲酸盐，15mg，24％产率)。LC-MS：tR：1.48分钟[M+H]+1155.6。
Figure BDA0002508295540001071
化合物20：在0℃下，用三氟乙酸(0.25mL)处理含15(55mg，53μmol，1当量)的CH2Cl2(1.0mL)的溶液。使所得混合物历经15分钟升温到室温。此后，在减压下将混合物浓缩到干燥。将所得粗胺溶解于DMF(2.0mL)中，随后用4-苯甲酰苯甲酸(24mL，0.11mmol，2.0当量)、HATU(40mg，0.11mmol，2.0当量)和N,N-二异丙基乙胺(37μL，0.21mmol，4.0当量)处理。使所得混合物在室温下搅拌整夜，随后所得产物溶液(在DMF中)通过C18-硅胶上的柱色谱直接纯化，用含0.1％甲酸的水中的0-100％CH3CN洗脱。将含有所期望的产物的部分合并并且部分蒸发以去除CH3CN，随后在-78℃下冷冻并冻干，以得到呈黄色固体状的20(甲酸盐，32mg，52％产率)。LC-MS：tR：1.43分钟[M+H]+1151.7。
Figure BDA0002508295540001081
化合物21：根据以上通用程序A，由2(37mg，63μmol)和4-叠氮基-2,3,5,6-四氟苯甲酸制备化合物21。在室温下搅拌3小时之后，粗产物混合物通过C18-硅胶上的反相色谱纯化，用含0.1％甲酸的水中的0-100％CH3CN洗脱。将化合物21分离为亮黄色固体(甲酸盐，26mg，52％产率)。LC-MS：tR：1.51分钟；[M+H]+806.6。
Figure BDA0002508295540001082
化合物22：根据以上通用程序A，由2(37mg，63μmol)和3-叠氮基-5-(叠氮基甲基)苯甲酸制备化合物22。在室温下搅拌3小时之后，粗产物混合物通过C18-硅胶上的反相色谱纯化，用含0.1％甲酸的水中的0-100％CH3CN洗脱。将化合物22分离为亮黄色固体(甲酸盐，26mg，52％产率)。LC-MS：tR：1.51分钟；[M+H]+789.5。
实例4：I-1(ARK-139)对映异构体的SFC分离和活性异构体的绝对立体化学测定
对外消旋I-1(ARK-139)进行SFC手性分离(ChiralPak AD柱，70％A/30％B的等度洗脱，A相为超临界CO2，B相为MeOH，60g/分钟的总流动速率，循环时间3分钟)，并且分离并收集两个峰。
Figure BDA0002508295540001091
Figure BDA0002508295540001092
I-1的两种对映异构体的分离允许制备表5和实例3的化合物和本文所公开的其它HAP化合物中的每一者的非外消旋形式。在一些实施例中，本发明因此提供在HAP立构中心处对映体增浓的此类化合物。
4-(2-氯-4-氟苯基)-6-(((1-(2-(2-(2-羟乙氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-2-(吡啶-4-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸(R)-甲基酯(上文I-1b)。黄色油状。1H NMR:(400MHz,CDCl3)δ8.68(q,J＝1.6,3.2Hz,2H),8.54(br s,1H),7.87(s,1H),7.70(q,J＝1.6,3.2Hz,2H),7.31(dd,J＝6.0,2.4Hz,1H),7.13(dd,J＝2.4,6.0Hz,1H),6.95-6.90(dt,J＝4.2,8.4Hz,1H),6.21(s,1H),4.98(d,J＝1.0,2H),4.83(s,2H),4.59(t,J＝4.8Hz,2H),3.90(t,J＝4.8Hz,2H),3.71(t,J＝4.8Hz,2H),3.65-3.60(m,7H),3.56(t,t,J＝4.8Hz,1H),2.70(br s,1H)。LCMS，计算C27H30ClFN6O6(M+H)＝589.02，得到＝589.4。手性LCMS中的滞留时间：1.74分钟，旋光度：[α]D 25+57.4(c 0.7,MeOH)。
4-(2-氯-4-氟苯基)-6-(((1-(2-(2-(2-羟乙氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)-2-(吡啶-4-基)-1,4-二氢嘧啶-5-甲酸(S)-甲基酯(上文I-1a)。h黄色油状。1H NMR:(400MHz,CDCl3)δ8.68(q,J＝1.6,3.2Hz,2H),8.54(br s,1H),7.87(s,1H),7.70(q,J＝1.6,3.2Hz,2H),7.31(dd,J＝6.0,2.4Hz,1H),7.13(dd,J＝2.4,6.0Hz,1H),6.95-6.90(dt,J＝4.2,8.4Hz,1H),6.21(s,1H),4.98(s,2H),4.83(s,2H),4.59(t,J＝4.8Hz,2H),3.90(t,J＝4.8Hz,2H),3.71(t,J＝4.8Hz,2H),3.65-3.60(m,7H),3.56(t,t,J＝4.8Hz,1H),2.62(br s,1H)。LCMS，计算C27H30ClFN6O6(M+H)＝589.02，得到＝589.4。手性LCMS中的滞留时间：1.93分钟，旋光度：[α]D 25-60.7(c 0.7,MeOH)。
SFC分离条件
Figure BDA0002508295540001101
进一步实验(SPR)展示ARK-702(I-1a)在10μM处不与适体21结合。另一方面，ARK-701(I-1b)确实结合并且因此是唯一的活性异构体。绝对立体化学如下文所示来测定并且使用SFC确认。
Figure BDA0002508295540001111
实例5：SEC/MS分析的程序
在线SEC-LCMS已用于研究I-1(ARK-139)与适体21RNA的结合。
RNA浓度为1μM并且在适当缓冲液(TRIS-HCl 20mM pH 8.0，MgCl2 3mM，KCl100mM)中的配体浓度在0.1μM到10μM范围内。
RNA/配体混合物在室温下以96孔板形式培育20分钟，随后将此装载到与装配有可重复使用SEC柱的色谱系统连接的自动取样器中，以便从非结合组分快速分离靶标/配体络合物。通过UV检测监测SEC洗脱液中的RNA/配体络合物，并且自动化阀门系统将RNA峰引导到反相色谱柱以便将任何配体离解、脱盐和洗脱到ESI-MS系统中以便识别。
所有液相色谱组分都是HP1200模块。质谱仪是以正电喷雾(ES+)TOF-MS模式操作的沃特世LCT普雷米尔仪器(premier instrument)。在0.25秒内获得的质量范围为80-1000m/z。SEC柱为50×4.6mm聚羟乙基柱。SEC流动相是50mM磷酸盐缓冲液，以及200mMNaCl，pH＝7.0。LC柱是2.1×50mm C18菲罗门柱。梯度LC流动相A为含0.1％甲酸的水，并且B为具有0.1％甲酸的乙腈/水。运行时间为7.9分钟。
关于SEC/LCMS的更多信息，参见例如布鲁姆,K.F.(Blom,K.F.)等人,组合化学杂志(J.Comb.Chem.)1999,1,82-90。
结果
测量I-1与适体21的结合。此验的SEC/LCMS条件为：[I-1]＝5μM，[RNA]＝1μM，缓冲液＝Tris-HCl 20mM，KCl 100mM，3mM MgCl2。
表6：I-1与适体21的结合
ARK-000139浓度(μM) 峰面积SEC-LCMS 峰面积LCMS 结合％
0.1 26.81 36.99 72.5
0.5 75.34 206.33 36.5
1 151.55 451.51 33.6
3 372.39 1665.87 22.4
10 471.84 5305.54 8.9
重复实验并且在2个实验之间展示良好的再现性。饱和开始在1与3μM之间。SEC/LCMS还用于测量I-1与适体21-E的结合。根据SPR数据和所公布的文献，I-1并不结合适体21-E。SEC/LCMS代表用于评估亲和力的有前景的均质法。
实例6：PEARL-seq光探针分析
通用方法
序列
在本文所描述的分析中采用以下序列。
表7：核酸序列
Figure BDA0002508295540001121
Figure BDA0002508295540001131
表8：伊鲁米那索引序列
索引标识 序列
1 CGTGAT
2 ACATCG
3 GCCTAA
4 TGGTCA
5 CACTGT
6 ATTGGC
7 GATCTG
8 TCAAGT
9 CTGATC
10 AAGCTA
11 GTAGCC
12 TACAAG
13 TTGACT
14 GGAACT
15 TGACAT
16 GGACGG
18 GCGGAC
19 TTTCAC
20 GGCCAC
21 CGAAAC
22 CGTACG
23 CCACTC
25 ATCAGT
27 AGGAAT
RNA折叠
将2到5M在不含核酸酶的水中的RNA溶液加热到95℃维持3分钟，并且随后在冰上冷却2分钟。用1/2体积的3倍RNA折叠缓冲液(60mM TrisHCl pH 8，300mM KCl，9mM MgCl2)稀释此溶液并且在37℃下培育20分钟。在每个实验中，紧接在使用RNA之前进行折叠。在RNA分子的混合物在体外使用的情况下，将RNA分开折叠并且随后在探测实验之前合并。
逆转录剥离凝胶分析
交联
在37℃下，将折叠RNA(1μM)在缓冲液(20mM TrisHCl pH 8，100mM KCl，3mMMgCl2)与2.5％DMSO的总计25μL中与光亲和性探针(10μM)一起培育30分钟以允许结合达到平衡。随后在UV交联剂(飞世尔科技公司(Fisher Scientific))中用长波UV光(约365nm)照射样品30分钟。
逆转录
将10μM逆转录引子的3.75μL等分试样添加到交联RNA样品中，其随后在65℃下培育5分钟并且随后在冰上冷却。随后将样品稀释到60μL的最终体积和1倍Protoscript-II缓冲液(新英格兰生物实验室(New England Biolabs))、0.5mM dNTP、10mM DTT、0.4U/μL RNA酶抑制剂(新英格兰生物实验室)和10U/μL Protoscript-II(新英格兰生物实验室)的最终缓冲液浓度。将反应物在45℃下培育2小时、65℃下培育20分钟，并且随后在4℃下培育。
cDNA的分离
RNA是通过添加4.8μL 2.5M NaOH并且在95℃下加热5分钟来水解。通过添加0.9μL乙酸来淬灭反应。cDNA是通过添加6.6μL 3M乙酸钠(pH 5)和181μL乙醇、冷却到-80℃持续1小时并且随后在4℃下在20,500xg下离心30分钟来沉淀。cDNA团块用500μL 70％乙醇洗涤两次，并且随后风干5分钟。
聚丙烯酰胺凝胶分析
将cDNA团块再悬浮于12μL的载有1倍TBE-脲样品的缓冲液(伯乐公司(Bio-Rad))中并且加热到95℃持续5分钟。随后在120V下在预铸8.6×6.7cm TBE-脲10％PAGE凝胶(伯乐公司)上运行样品直到下部溴酚蓝染料到达凝胶的底部。在室温下用在1倍TBE缓冲液中的1倍SYBR-戈尔德(英杰公司)遮光染色凝胶20分钟。凝胶荧光在Azure c600仪器上成像。
交联RNA的LC-MS分析
产生交联RNA
在37℃下，在存在或不存在光亲和性探针(20μM)的情况下，将折叠RNA(1.33μM)在缓冲液(20mM TrisHCl pH 8，100mM KCl，3mM MgCl2)与2％DMSO的总计100μL中培育30分钟以允许结合达到平衡。随后在UV交联剂(飞世尔科技公司)中用长波UV光(约365nm)照射样品30分钟。
随后RNA通过添加10μL 3M乙酸钠(pH 5)和275μL乙醇，冷却到-80℃持续1小时，并且随后在4℃下在20,500xg下离心30分钟来沉淀。RNA团块用500μL 70％乙醇洗涤，风干5分钟，并且随后再悬浮于120μL水中。
LC-MS分析
将50μL RNA样品注射到透明的2.6μm寡聚X-T柱(50×2.1mm，60℃)，并且梯度和流动速率如下：95％A/5％B到75％A/25％B持续5分钟，流动速率：400μL/分钟；75％A/25％B到30％A/70％B持续1分钟，流动速率：400μL/分钟；100％D持续1分钟，流动速率：500μL/分钟；95％A/5％B持续2分钟，流动速率：500μL/分钟(A：含1％HFIPA(六氟异丙醇)、0.1％DIEA(二异丙基乙胺)、1μM EDTA(乙二胺四乙酸)的H2O；B：含0.075％HFIPA、0.0375％DIEA、1μMEDTA的65/35MeCN/H2O；D：40/40/20％MeOH/MeCN/H2O)；LCMS仪器为赛默菲尼根公司的，并且与Xcaliber耦合的ProMass反卷积软件用于所有数据处理。
进行ARK-547交联RNA的下一代测序分析
产生交联RNA
将含9.5μL的折叠RNA(2.6μM)的缓冲液(20mM TrisHCl pH 8，100mM KCl，3mMMgCl2)的样品添加到含1mM ARK-547的DMSO的0.5μL等分试样中。将反应物在37℃下培育10发展，在UV交联剂(飞世尔科技公司)中用长波UV光(约365nm)照射30分钟，并且随后保持在冰上。
连接子连接
将交联RNA的样品稀释到20μL的最终体积和1倍T4 RNA连接酶缓冲液(新英格兰生物实验室)、5U/μL T4 RNA连接酶2、截短KQ(新英格兰生物实验室)、16.5％PEG-8000和0.5μM通用miRNA克隆连接子(新英格兰生物实验室)的最终反应条件。将反应物在热循环仪中培育2.5小时，在16℃下5分钟与在25℃下3分钟之间循环。随后使用来自制造商的标准协议使用Agencourt AMPure XP珠粒(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))来纯化RNA。RNA用20μL不含核酸酶的水洗脱。
逆转录
将洗脱RNA样品的10μL等分试样与2μL PEARLv2_RT引子的1μL等分试样混合，加热到65℃持续5分钟，并且随后在冰上冷却。将2.5倍诱变逆转录缓冲液(125mM TrisHCl pH8，187.5mM KCl，25mM DTT，1.25mM dNTP)的8μL样品添加到样品中，并且将其加热到42℃维持2分钟，随后添加1μL SuperScript II酶(赛默)，并且随后在42℃下培育3小时和70℃维持15分钟。
为了去除过量引子，将样品与4.5μL ExoSAP-IT混合，在37℃下培育15分钟，并且随后用1μL 0.5M EDTA pH 8淬灭。随后通过添加2.08μL 2.5M NaOH使RNA降解，在95℃下培育5分钟，并且用3.25μL 10％乙酸淬灭。使用来自制造商的标准协议通过AgencourtAMPure XP珠粒(贝克曼库尔特公司)来纯化剩余cDNA，并且在30μL不含核酸酶的水中洗脱。通过在260nm下的吸光度测定浓度。
第二衔接子连接
使用环化连接酶ssDNA连接酶系统(Epicentre)进行第二衔接子连接。使纯cDNA的0.8pmol等分试样达到20μL的最终体积并且83.5μM PEARLv2_2nd_衔接子寡聚、1倍环化连接酶缓冲液、50μM ATP、2.5mM MnCl2和5U/μL酶的最终浓度。反应在60℃下培育2小时，并且随后在80℃下培育10分钟。使用来自制造商的标准协议通过Agencourt AMPure XP珠粒(贝克曼库尔特公司)来纯化衔接子连接的cDNA，并且在30μL不含核酸酶的水中洗脱。
聚合酶链反应
使用Q5高保真度DNA聚合酶(新英格兰生物实验室)对衔接子连接的cDNA进行PCR扩增以安置伊鲁米那衔接子序列。使衔接子连接的cDNA的5μL等分试样达到50μL的最终体积和0.2μM PEARLv2_for_pri引子、0.2μM PEARLv2_rev_pri引子和1倍Q5主混合物的最终浓度。聚合酶链反应在以下情况下进行：加热到98℃持续30秒；98℃持续10秒、60℃持续30秒和72℃持续30秒的5个循环；98℃持续10秒和72℃持续30秒的15个循环；72℃持续2分钟。通过正向引子将不同伊鲁米那条码安置于每个PCR产物中。使用来自制造商的标准协议使用Agencourt AMPure XP珠粒(贝克曼库尔特公司)来纯化PCR产物，并且在30μL不含核酸酶的水中洗脱。
下一代测序
使用Denovix dsDNA荧光定量试剂盒(丹诺尔(Denovix))测量不同PCR产物的浓度并且在相等浓度下与20％PhiX加标进行复合。使用标准制造商协议在具有150bp成对端读段的伊鲁米那MiSeq上进行测序。
从确定的RNA混合物中捕获适体21
产生交联RNA
制备折叠RNA样品，其含有1μM以下各者中的每一者：Myc_HP_PA、适体21、FMN、MYC_3WJ-HP_N3G和含前Q1 RNA的折叠缓冲液(20mM TrisHCl pH 8，100mM KCl，3mM MgCl2)。将此溶液的95μL样品添加到DMSO中的0.2mM ARK-670(探针)或ARK-139(对照物)的5μL等分试样中。将反应在37℃下培育30分钟，在UV交联剂(飞世尔科技公司)中用长波UV光(约365nm)照射30分钟，并且随后在冰上冷却。随后通过根据制造商产品协议使样品通过IllustraMicroSpin G-25离心柱(通用电气医疗集团(GE Healthcare))去除过量探针和缓冲液。
亲和素珠粒捕获
对于每一处理，将交联RNA的75μL等分试样与0.75μL 10％Tween-20和0.45μL0.5M EDTA pH 8溶液混合。将MyOne链霉亲和素C1磁珠浆料(赛默)的50μL等分试样捕获于磁体上，用50μL的1倍结合/洗涤缓冲液(20mM TrisHCl pH 7，100mM KCl，0.1％Tween-20)洗涤两次，并且随后再悬浮于50μL的交联RNA样品中。珠粒悬浮液在室温下旋转60分钟，并且随后用100μL的1倍结合/洗涤溶液洗涤两次。为了洗脱结合的RNA，将珠粒再悬浮于50μL洗脱缓冲液(95％甲酰胺，20mM EDTA)中，加热到95℃持续5分钟，并且随后去除上清液。RNA为乙醇沉淀的，通过添加50μL水、2μL 5mg/mL肝糖、10μL 3M NaOAc pH 5和250μL乙醇，在-80℃下培育1小时，在20,000g下离心30分钟，用500μL 70％乙醇洗涤团块两次，风干所述团块，并且随后将团块再悬浮于16μL不含核酸酶的水中。
连接子连接
将洗脱珠粒的RNA样品稀释到20μL的最终体积和1倍T4 RNA连接酶缓冲液(新英格兰生物实验室)、5U/μL T4 RNA连接酶2、截短KQ(新英格兰生物实验室)、16.5％PEG-8000和0.5μM通用miRNA克隆连接子(新英格兰生物实验室)的最终反应条件。将反应物在热循环仪中培育2.5小时，在16℃下5分钟与在25℃下3分钟之间循环。随后使用来自制造商的标准协议使用Agencourt AMPure XP珠粒(贝克曼库尔特公司)来纯化RNA。RNA用11μL不含核酸酶的水洗脱。
SuperScript III的逆转录
向来自连接子连接的11μL RNA样品中添加1μL 2μM PEARLv2_RT引子和1μL 10mMdNTP混合物。将样品加热到65℃持续5分钟，并且随后在冰上冷却1分钟。随后将样品与4μL5倍第一链缓冲液(赛默)、1μL 0.1M DTT、1μL RNaseOUT(赛默)和1μL SuperScript III酶(赛默)混合。将反应在55℃下培育45分钟，70℃下培育15分钟，并且随后冷却到4℃。
为了去除过量引子，将样品与4.5μL ExoSAP-IT混合，在37℃下培育15分钟，并且随后用1μL 0.5M EDTA pH 8淬灭。随后通过添加2.08μL 2.5M NaOH使RNA降解，在95℃下培育5分钟，并且用3.25μL 10％乙酸淬灭。剩余cDNA使用来自制造商的标准协议通过Agencourt AMPure XP珠粒(贝克曼库尔特公司)来纯化，并且在15μL不含核酸酶的水中洗脱。通过在260nm下的吸光度测定浓度。
第二衔接子连接
使用环化连接酶ssDNA连接酶系统(Epicentre)进行第二衔接子连接。使纯cDNA的0.8pmol等分试样达到20μL的最终体积并且83.5μM PEARLv2_2nd_衔接子寡聚、1倍环化连接酶缓冲液、50μM ATP、2.5mM MnCl2和5U/μL酶的最终浓度。反应在60℃下培育2小时，并且随后在80℃下培育10分钟。使用来自制造商的标准协议通过Agencourt AMPure XP珠粒(贝克曼库尔特公司)来纯化衔接子连接的cDNA，并且在30μL不含核酸酶的水中洗脱。
聚合酶链反应
使用Q5高保真度DNA聚合酶(新英格兰生物实验室)对衔接子连接的cDNA进行PCR扩增以安置伊鲁米那衔接子序列。使衔接子连接的cDNA的5μL等分试样达到50μL的最终体积和0.2μM PEARLv2_for_pri引子、0.2μM PEARLv2_rev_pri引子和1倍Q5主混合物的最终浓度。聚合酶链反应在以下情况下进行：加热到98℃持续30秒；98℃持续10秒、60℃持续30秒和72℃持续30秒的5个循环；98℃持续10秒和72℃持续30秒的15个循环；72℃持续2分钟。通过正向引子将不同伊鲁米那条码安置于每个PCR产物中。使用来自制造商的标准协议使用Agencourt AMPure XP珠粒(贝克曼库尔特公司)来纯化PCR产物，并且在30μL不含核酸酶的水中洗脱。
下一代测序
使用Denovix dsDNA荧光定量试剂盒(丹诺尔)测量不同PCR产物的浓度并且在相等浓度下与20％PhiX加标进行复合。使用标准制造商协议在具有150bp成对端读段的伊鲁米那MiSeq上进行测序。
用点击-生物素化探针捕获适体21
产生交联和点击-生物素化RNA
将含1μL折叠适体21或适体21-E溶液的折叠缓冲液(20mM TrisHCl pH 8，100mMKCl，3mM MgCl2)的50μL样品添加到含0.5mM ARK-729、ARK-2058、ARK-816或ARK-2059的DMSO或仅DMSO对照的0.5μL等分试样中。溶液在37℃下培育1小时，并且随后在UV交联剂(飞世尔科技公司)中用长波UV光(约365nm)照射30分钟。向此溶液中添加0.5μL 10mM DBCO-生物素(点击化学工具(Click Chemistry Tools)，目录号A105)和2μL 0.5M EDTA pH 8，并且随后将所述溶液在65℃下培育2小时。RNA为乙醇沉淀的，通过添加35μL水、2μL 5mg/mL肝糖、10μL 3M NaOAc pH 5和250μL乙醇，在-80℃下培育1小时，在20000xg下离心30分钟，用500μL 70％乙醇洗涤团块两次，并且随后风干所述团块。
链霉亲和素珠粒捕获
将RNA团块再溶解于50μL的1倍结合/洗涤缓冲液(20mM TrisHCl pH 7，100mMKCl，0.1％Tween-20)中。将MyOne链霉亲和素C1磁珠浆料(赛默)的50μL等分试样捕获于磁体上，用50μL的1倍结合/洗涤缓冲液洗涤两次，并且随后再悬浮于50μL的交联RNA样品中。珠粒悬浮液在室温下旋转30分钟，并且随后用100μL的1倍结合/洗涤溶液洗涤两次。
关于珠粒脱磷酸作用
将具有捕获的RNA的磁珠再悬浮于含有1倍FastAP缓冲液和0.08U/μL FastAP酶(赛默)的50μL溶液中，并且在1200rpm搅动下在37℃下培育浆料15分钟。随后将1倍PNK缓冲液、1mM DTT和0.25U/μL T4 PNK(新英格兰生物实验室)的150μL溶液添加到混合物中并且在1200rpm搅动下在37℃下培育浆料20分钟。随后用400μL的1倍结合/洗涤溶液洗涤珠粒三次。
第一连接子连接
用400μL连接子洗涤缓冲液(50mM三HCl pH 8，5mM MgCl2)洗涤珠粒两次，并且随后再悬浮于含有2μM的PEARLv3_1st_连接子寡聚、1倍RNA连接酶1缓冲液、1mM ATP、2.9％DMSO、16％PEG8000和2.7U/μL RNA连接酶1(新英格兰生物实验室，目录号M0437)的27.5μL连接反应混合物中。在1200rpm搅动下在22℃下培育浆料75分钟，并且随后用100μL的1倍结合/洗涤缓冲液洗涤珠粒两次。
逆转录
用200μL的1倍第一链缓冲液(赛默)洗涤珠粒两次，并且随后再悬浮于含有14.75μL水、1.25μL 10mM dNTP和0.25μL 10μM PEARLv3_RT寡聚的溶液中。将浆料加热到65℃持续5分钟，在冰上冷藏，并且随后添加含有5μL的5倍第一链缓冲液(赛默)、1.25μL 100mM DTT、1.25μL RNaseOUT(赛默)和1.25μL SuperScript III(赛默)的溶液。混合浆料，在50℃下培育50分钟，加热到85℃持续5分钟，并且随后在冰上冷藏。
为了洗脱cDNA，将2.5μL 2.5M氢氧化钠添加到浆料中，并且将其加热到95℃持续5分钟，在冰上冷藏，并且随后添加3.6μL 1.74M乙酸溶液以淬灭pH。从珠粒上去除上清液，用不含核酸酶的水来达到50μL的最终体积，并且随后使用来自制造商的标准协议使用Agencourt AMPure XP珠粒(贝克曼库尔特公司)来纯化并在15μL不含核酸酶的水中洗脱。
第二衔接子连接
使AMPure洗脱的cDNA的14μL等分试样达到最终浓度为1倍环化连接酶缓冲液、80nM PEARLv3_2nd_衔接子寡聚、50μM ATP、2.5mM MnCl2和5U/μL环化连接酶ssDNA连接酶(EpiCentre)的20μL反应混合物，并且在60℃下培育2小时并随后在80℃下培育10分钟。使用来自制造商的标准协议使用Agencourt AMPure XP珠粒(贝克曼库尔特公司)来纯化连接cDNA，并且在25μL不含核酸酶的水中洗脱。
聚合酶链反应
使用Q5高保真度DNA聚合酶(新英格兰生物实验室)对衔接子连接的cDNA进行PCR扩增以安置伊鲁米那衔接子序列。使衔接子连接的cDNA的5μL等分试样达到50μL的最终体积和0.2μM PEARLv3_for_pri引子、0.2μM PEARLv3_rev_pri引子和1倍Q5主混合物的最终浓度。聚合酶链反应在以下情况下进行：加热到98℃持续30秒；98℃持续10秒、60℃持续30秒和72℃持续30秒的5个循环；98℃持续10秒和72℃持续30秒的15个循环；72℃持续2分钟。通过正向引子将不同伊鲁米那条码安置于每个PCR产物中。使用来自制造商的标准协议使用Agencourt AMPure XP珠粒(贝克曼库尔特公司)来纯化PCR产物，并且在30μL不含核酸酶的水中洗脱。
下一代测序
使用Denovix dsDNA荧光定量试剂盒(丹诺尔)测量不同PCR产物的浓度并且在相等浓度下与20％PhiX加标进行复合。使用标准制造商协议在具有150bp成对端读段的伊鲁米那MiSeq上进行测序。
从PolyA+RNA提取物中捕获适体21
从细胞中分离PolyA+RNA
根据制造商产品标准协议使用ReliaPrep mini-prep试剂盒(普洛麦格公司(Promega))从5×106个HepG2细胞的团块提取总RNA。根据使用450μL裂解缓冲液和100μL珠粒的制造商标准协议使用磁性mRNA分离试剂盒(新英格兰生物实验室，目录号S1550)从454ng/μL的总RNA的50μL样品中分离polyA+RNA部分。
产生交联和点击-生物素化RNA
将折叠适体21RNA样品以1nM适体21和3ng/μL polyA+RNA的最终浓度加标到polyA+RNA提取物样品中。随后将此RNA混合物的50μL样品添加到含100μM ARK-816或ARK-2059的DMSO或DMSO对照的0.5μL等分试样中，并将混合物在37℃下培育20分钟。随后用50μL的1倍折叠缓冲液稀释溶液，并且随后在UV交联剂(飞世尔科技公司)中用长波UV光(约365nm)照射30分钟。向此溶液中添加1μL 5mM DBCO-生物素(点击化学工具，目录号A105)和1μL 0.5MEDTA pH 8，并且随后将所述溶液在65℃下培育2小时。RNA为乙醇沉淀的，通过添加35μL水、2μL 5mg/mL肝糖、10μL 3M NaOAc pH 5和250μL乙醇，在-80℃下培育1小时，在20,000g下离心30分钟，用500μL 70％乙醇洗涤团块两次，并且随后风干所述团块。
片段化RNA
RNA样品使用Ambion片段化试剂盒(赛默)来片段化。将RNA团块再悬浮于50μL的1倍片段化缓冲液中，在70℃下培育15分钟，并且随后通过添加5μL停止溶液来淬灭。样品为乙醇沉淀的，通过添加50μL水、10μL 3M NaOAc pH 5、2μL 5mg/mL肝糖和280μL乙醇，在-80℃下培育1小时，在20,000g下离心30分钟，用500μL 70％乙醇洗涤团块两次，并且随后风干所述团块。
亲和素珠粒富集和测序文库制备
亲和素珠粒捕获、脱磷酸作用、第一连接子连接、逆转录、第二衔接子连接和聚合酶链反应是按照以上“用点击-生物素化探针捕获适体21”的章节来进行。
测序文库的大小选择
为了去除引子二聚体和大小选择测序文库，PCR产物在3％琼脂糖凝胶上用1倍SYBR-戈尔德来运行。切割275bp到400bp的区域并且根据制造商推荐协议使用Zymoclean凝胶DNA回收试剂盒(兹莫研究(Zymo Research))提取DNA并且洗脱到12μL不含核酸酶的水中。
下一代测序
使用标准制造商协议在具有150bp配对端读段的单个伊鲁米那HiSeq 4000通道上进行测序。
PEARL-seq信息
基因组参考
所有分析参考GRCh38人类基因组组装并且GENCODE释放28个转录注释，添加适体21(AGGGGTAGGCCAGGCAGCCAACTAGCGAGAGCTTAAATCTCTGAGCCCGAGAGGGTTCAGTGCTGCTTATGTGGACGGCTTGAT；SEQ.ID:25)。
读段拼接
为了确保仅高品质、一致的读段对用于定义突变和逆转录酶停滞，读段首先用成对端读段合并(PEAR)进行拼接(https://dx.doi.org/10.1093％2Fbioinformatics％2Fbtt593)，需要至少10个核苷酸(nt)的最小组装长度。
单转录读段比对(SHAPEware)
对于所有SHAPEware分析，读段分别使用Trimmomatic(http://dx.doi.org/10.1093/bioinformatics/btu170)和bwa-mem(https://arxiv.org/abs/1303.3997)如先前所描述的来进行衔接子修整比对。
SHAPE反应性计算(SHAPEware)
使用贝氏读段计数(bam-readcount)(https://github.com/genome/bam-readcount)将突变(取代、插入和缺失)制成表。随后筛选突变以仅保留可以明确地连接到给定转录位置的那些突变(不明确的突变可以由多个位置产生)。基于与未经处理的样品相比的经SHAPE处理的样品中的过量突变定义SHAPE反应性，将其归一化为未折叠对照：
Figure BDA0002508295540001221
Figure BDA0002508295540001222
随后，如戴根(Deigan)等人(美国科学院院报(PNAS)2009年1月6日,106(1)97-102)所描述，在每个转录物内进一步归一化反应性。
宽转录物组读段比对(PEARL-seq)
随后用具有至少5个nt的重叠和最多20％错配的Cutadapt(http://dx.doi.org/10.14806/ej.17.1.200)处理拼接读段，以同时1)在适当的衔接子情况(ATATAGGN6AGATCGG)(SEQ.ID:35)情况下，定义独特的6个nt独特分子标识符(uniquemolecular identifier，UMI)，和2)修整掉衔接子以允许更精确的定义片段末端。将UMI随附到读段名称，并且使用具有至多10％的错配的STAR校准器(http://dx.doi.org/10.1093/bioinformatics/bts635)针对基因组和转录组参考(加上适体21)映射读段。随后使用具有默认参数的UMI-工具(http://dx.doi.org/10.1101/gr.209601.116)的方向邻接方法(Directional Adjacency method)使具有相同或几乎相同UMI的读段组收缩。因此，从数据中去除PCR重复以避免可能引入偏置或差异的潜在假象。
RT停滞位点的定义
探针与转录物之间的相互作用的位点由逆转录酶(RT)停滞位点定义。RT停滞位点式基于修整读数的5'端的映射位置定义。对于如适体21的短定义的转录物，由具有3'端映射到精确转录端的读段定义高置信度RT停滞位点。针对适体21中的每个位置绘制高置信度停滞位点的频率。
峰寻找(PEARL-seq)
基于与仅弹头对照相比的PEARL-seq探针中的停滞位点的显著富集来定义小分子转录物相互作用的真实位点。基于RT停滞位点的单核苷酸分辨率，这些峰预期相当窄。因此，我们开发一种最佳化峰寻找方法以检测这些窄峰，并且因此当与仅弹头对照相比时识别富集于探针中的RT位点的位点。简单来说，修整独特地映射读段以仅保留其5'的大部分核苷酸。随后使用Deeptools(http://dx.doi.org/10.1093/nar/gkw257)结合自定义脚本在整个基因组中计数跨越10个nt箱的这些5'端。使用本杰明-霍赫贝格多重假设校正(Benjamini-Hochberg multiple hypothesis correction)，通过对R(edgeR)管线(https://doi.org/doi:10.18129/B9.bioc.edgeR)中数字基因表达数据(Digital GeneExpression Data)的经验分析，对每个具有可检测读段5'端的箱进行显著富集测试。具有探针不受控制的正富集和FDR<0.01的峰被视为含有对应于探针-转录物相互作用的探针诱导的RT停滞事件。
实例7：适体21的表面等离子共振分析
表面等离子体共振(SPR)可以用于筛选配体以及钩和点击构筑体以与所关注的靶RNA结合。SPR尤其适用于实时监测生物分子相互作用。通常，将靶物种和不相关对照固定到传感器芯片上，随后使分析物(化合物/片段)在表面上流过。化合物与靶物种的结合引起SPR信号增加(缔合阶段)。使用缓冲液洗去结合的化合物引起SPR信号降低(解离阶段)。在不同化合物浓度下执行所记录的传感图的拟合以得到适当的相互作用模型。所述方法允许选取动力学参数(ka，kd→KD)。要求/限制包含ka/kd值在合理范围内；并且靶标大小不得过大(<100kDa)。它是筛选片段和特征分析或验证命中的极佳方法。可以使用BC4000以初步筛选(高达4,000数据点(data pts)/周)。Biacore T200适用于命中特征分析和验证。
通过使用SPR已实现可待因结合的适体进化并且确定了适体结合常数。温因,N.M.(Win,N.M.)等人,核酸研究2006,34(19),5670-5682。参见例如常,A.L.(Chang,A.L.)等人,分析化学2014,86,3273-3278。
在PEARL-seq情况下，SPR允许监测“钩”与DNA/RNA适体的结合。将靶物种固定到传感器芯片上，分析物(即钩)在表面上流过(缔合阶段)，DNA/RNA适体在表面上流过(平台阶段)，竞争化合物在表面上洗涤(解离阶段)，由此产生结合数据。
传感器芯片表面制备
在25℃下在MASS-2(西拉感测器(Sierra Sensors))上进行实验。用PBS平衡高容量胺芯片。用含10mM HCl和10mM NaOH的1M NaCl的交替注射来调节芯片。使用0.4M 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(西拉)和0.1M N-羟基丁二酰亚胺(西拉)的1:1体积比，以10μL/分钟的流动速率激活胺芯片表面的羧甲基化葡聚糖7分钟。以10μl/分钟的流动速率将中性亲和素(70μg/mL，赛默飞世尔)注射到激活表面上10分钟。通过以10μl/分钟的流动速率注射1M乙醇胺，pH 8.5(西拉)7分钟来阻断过量激活基团。含10mM NaOH的1M NaCl以10μl/分钟持续7分钟的最终注射用于去除任何未与芯片结合的材料。固定反应通常产生约12,000个中性亲和素的共振单元(RU)。通道中的至少一个样点未注入RNA并用作背景对照。不相关RNA也用作背景对照。
RNA制备
在不含RNA酶的水中制备生物素-适体21的1μM样品，加热到95℃持续3分钟，在冰上冷却4分钟，用相等体积的2倍折叠缓冲液(40mM Tris-HCl，pH 8.0，6mM MgCl2，200mMKCl)稀释，并且在37℃下培育30分钟。RNA的最终浓度为0.5μM。
RNA表面捕获
用20mM Tris-HCl(pH 8.0)，3mM MgCl2，100mM KCl(捕获缓冲液)将MASS-2灌注2次。将RNA以10μl/分钟的流动速率在中性亲和素表面上注射7分钟。捕获水平通常达到适体21的共振单元的约3500-4500。
化合物测试
将500μM的起始浓度下的化合物在100％DMSO中稀释2倍。化合物与缓冲液1:100的稀释产生含化合物溶液的20mM Tris-HCl(pH 8.0)，3mM MgCl2，100mM KCl，1％DMSO。
用20mM Tris-HCl(pH 8.0)，3mM MgCl2，100mM KCl，1％DMSO(运行缓冲液)将MASS-2灌注2次。在测试化合物3之前，使用运行缓冲液的注射使传感器表面平衡。将在0.6％-1.8％DMSO范围内的注射DMSO校正溶液以30μl/分钟的流动速率注射到表面上30μl以产生用于数据分析的DMSO校正曲线。在240秒的解离时间下以10μl/分钟的流动速率将化合物(120μL)注射到RNA表面上。
数据分析
使用西拉分析仪软件(Sierra Analyzer Software)(西拉传感器)进行数据处理和分析。进行双参考方法以处理所有数据集，并且应用DMSO校正曲线以考虑样品与运行缓冲液之间的体折射率变化的任何差异。将双参考数据拟合到1:1的结合模型以用于动力学分析。在这些条件下所计算的KD为约0.8nM。
实例8：前Q1 RNA光探针的制备
Figure BDA0002508295540001241
前Q1核糖开关的使用和用于其的小分子配体的制备描述于罗斯,A.(Roth,A.)等人,自然·结构与分子生物学2007,14(4),308-317，其特此以引用的方式并入。
化合物24：在室温下，向含23(500mg，1.19mmol，1当量)和(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸第三丁酯(354mg，1.43mmol，1.2当量)的甲醇(14.0mL)的悬浮液中添加硫酸钠(14mg，0.09mmol，0.08当量)。将所得悬浮液在室温下搅拌2小时。随后将硼氢化钠(135mg，3.57mmol，3.0当量)以小份添加到反应混合物中，随后室温下搅拌维持额外4小时。将反应混合物用乙酸乙酯(250mL)稀释，随后依次用50mL若干份水(三次)和饱和NaCl水溶液洗涤。产物溶液经Na2SO4干燥，过滤，并在减压下浓缩滤液。通过使用C18-硅胶上的反相色谱(含42-45％CH3CN的10mM NH4HCO3/水)来纯化所获得的粗材料，以得到呈灰白色固体状的24(302mg，39％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):10.61(s,1H),10.32(br s,1H),7.38(s,1H),7.31-7.28(m,12H),7.24-7.19(m,3H),6.82(t,J＝5.6Hz,1H),6.31(d,J＝2Hz,1H),3.56(s,2H),3.46-3.35(m,11H),3.08-3.03(m,2H),1.36(s,9H)。MS(ESI-MS)：m/z计算C37H44N6O5[MH]+653.34；得到653.14。
Figure BDA0002508295540001251
化合物25(I-23)：在室温下，用HCl(583μL，0.73mmol，23当量)的1.25M CH3OH溶液逐滴处理含24(21mg，32μmol，1当量)的CH3OH(1.0mL)的搅拌溶液。使所得混合物在室温下搅拌24小时，随后通过过滤收集沉淀的固体。所得粗固体依次用10mL若干份戊烷(两次)和乙醚(两次)湿磨，以得到呈白色固体状的中间伯胺。将伯胺(10mg，32μmol，1当量)再悬浮于DMF(1.0mL)中，随后用N,N-二异丙基乙胺(22μL，0.13mmol，4.0当量)和3-(3-甲基-3H-双吖丙啶-3-基)丙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-酯(7.6mg，34μmol，1.05当量)处理。将所得混合物维持在室温下16小时，随后立即装载到C18-硅胶柱上，用含0.1％甲酸的水中的0-70％CH3CN洗脱。将含有所期望的产物的部分合并并且在减压下部分蒸发以去除CH3CN，随后冷冻并冻干，以得到呈白色固体状的所期望的产物I-23(甲酸盐，9mg，60％产率)。
实例9：示例性光探针化合物的合成
Figure BDA0002508295540001261
化合物26：在0℃下，向含3-氨基-4-甲基苯甲酸(4.00g，26.5mmol，1当量)的乙酸(80mL)的溶液中添加2,6-二氟-3-羟基苯甲醛(5.01g，31.7mmol，1.2当量)。将反应缓慢升温到室温并在室温下搅拌3小时。再次将反应混合物冷却到0℃。以小份添加NaCNBH3(3.32g，52.9mmol，2.0当量)。使反应混合物升温到室温，随后在室温下搅拌16小时。将所得反应混合物倒入冰冷水(500mL)中。通过过滤收集所得沉淀物并且用水洗涤(3×25mL)。将所获得的固体在高真空下干燥，以得到呈白色固体状的26(6.00g，62％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.48(br s,1H),9.74(s,1H),7.22(d,J＝1.2Hz,1H),7.13(dd,J＝7.6,1.6Hz,1H),7.05(d,J＝8.0Hz,1H),6.86-6.83(m,2H),5.38(t,J＝5.6Hz,1H),4.36(d,J＝5.2Hz,2H),2.11(s,3H)。MS(ESI-MS)：m/z计算C15H13F2NO3 +＝294.09，得到294.16。
Figure BDA0002508295540001262
化合物27：在室温下，根据通用程序A，由26(2.00g，6.82mmol)和含(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸甲酯盐酸盐的DMF(20mL)来合成化合物27。在室温下搅拌3小时之后，将反应混合物用水稀释并通过过滤收集所得固体。通过硅胶(40％EtOAc/己烷)上的快速柱色谱来纯化粗产物，以得到呈浅粉红固体状的27(1.60g，34％产率)。MS(ESI-MS)：m/z计算C26H24F2N2O4 +＝467.17，得到467.22。
Figure BDA0002508295540001263
化合物28：在室温下，向含27(1.60g，3.93mmol，1当量)的THF:MeOH:水(4:2:1，11.2mL)的搅拌溶液中添加LiOH·H2O(0.43g，10.3mmol，3.0当量)。将反应混合物在室温下搅拌3小时，随后在真空下蒸发。将所获得的粗物质用水稀释并用乙醚洗涤。分离水层，使用1N HCl酸化并用乙酸乙酯萃取(4×100mL)。合并的有机层用盐水溶液(150mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。通过硅胶(7％MeOH/DCM)上的柱色谱来纯化所获得的粗材料，以得到呈灰白色固体状的28(1.55g，100％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.79(brs,1H),9.76(s,1H),7.26-7.13(m,3H),7.07-7.03(m,1H),6.96-6.78(m,3H),6.63(d,J＝8.8Hz,1H),6.58-6.52(m,1H),5.39-5.38(m,1H),5.13-4.42(m,3H),4.32-4.30(m,2H),3.18-3.11(m,2H),2.10(d,J＝8.4Hz,3H)。MS(ESI-MS)：m/z计算C25H22F2N2O4 +＝453.16，得到453.27。
Figure BDA0002508295540001271
化合物29：在室温下，根据通用程序A，由26(100mg，351μmol)和含(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酰胺的DMF(2mL)来合成化合物29(ARK-852)。使所得深色混合物在室温下搅拌60分钟，随后通过C18硅胶上的反相快速柱色谱(C18-硅胶，用含0.1％甲酸的水中的0-100％乙腈洗脱)来纯化，以得到呈灰白色固体状的29(甲酸盐，21mg，12％产率)。MS(ESI-MS)：tR＝1.54分钟；m/z计算C30H27F2N3O3 +＝498.1，得到520.1([M+Na]+)。
Figure BDA0002508295540001272
化合物30：通过通用程序A，由26(3.00g，10.2mmol)和(S)-4-苯基苯丙氨酸甲酯盐酸盐来制备化合物30。在室温下搅拌4小时之后，将反应混合物倒入冰冷水(250mL)中。通过过滤收集所得固体并且通过硅胶(30％EtOAc/己烷)上的柱色谱来纯化，以得到呈白色固体状的30(4.20g，77％产率)。MS(ESI-MS)：m/z计算C31H28F2N2O4 +＝531.04，得到531.27。
Figure BDA0002508295540001281
化合物31：与上文28类似地由30(4.20g，7.91mmol)制备化合物31。通过硅胶(含7％MeOH的CH2Cl2)上的柱色谱来纯化粗产物，以得到呈白色固体状的31(1.70g，42％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.77(br s,1H),9.76(s,1H),8.42(s,1H),7.60-7.54(m,4H),7.40-7.33(m,5H),7.08-7.01(m,3H),6.86-6.84(m,2H),5.21-5.19(m,1H),4.56(s,1H),4.33(s,2H),3.18-3.10(m,2H),2.07(s,3H)。MS(ESI-MS)：m/z计算C30H26F2N2O4 +517.19，得到517.07。
Figure BDA0002508295540001282
化合物32：在室温下，根据通用程序A，由26(100mg，351μmol)和含(S)-4-苯基苯丙酰胺的DMF(2mL)来合成化合物32(ARK-850)。使所得深色混合物在室温下搅拌30分钟，随后分配于饱和NaHCO3水溶液(30mL)与乙酸乙酯(30mL)之间。用30mL EtOAc萃取水相，随后用30mL水和30mL饱和NaCl水溶液洗涤合并的萃取物。产物溶液经MgSO4干燥，过滤并浓缩，以得到呈棕色油状的粗产物。通过C18硅胶上的反相快速柱色谱(含0.1％甲酸的水中的0-100％CH3CN)来纯化粗产物。将含有32的部分合并并且部分蒸发以去除CH3CN，随后将所得悬浮液分配于饱和NaHCO3水溶液(30mL)与EtOAc(30mL)之间。用30mL EtOAc萃取水相，随后用30mL水和30mL饱和NaCl水溶液洗涤合并的萃取物。产物溶液经MgSO4干燥，过滤并浓缩，以得到呈灰白色泡沫状的32(62mg，40％产率)。MS(ESI-MS)：tR＝1.67分钟；m/z计算C30H27F2N3O3 +＝516.1，得到499.1([M+H-NH3]+。
Figure BDA0002508295540001291
化合物33：根据通用程序A，由28(30mg，66μmol)和NH2-PEG1-CO2 tBu来合成化合物33。在室温下搅拌反应混合物1小时，随后通过柱色谱(C18硅胶，用含0.1％甲酸的水中的0-100％CH3CN洗脱)来纯化，以得到呈无色膜状的33(40mg，98％产率)。MS(ESI-MS)：m/z计算C34H40F2N3O6 +＝624.3，得到624.3。
化合物34：根据通用程序A，由28(30mg，66μmol)和NH2-PEG2-CO2 tBu来合成化合物34。在室温下搅拌反应混合物1小时，随后通过柱色谱(C18硅胶，用含0.1％甲酸的水中的0-100％CH3CN洗脱)来纯化，以得到呈无色膜状的34(41mg，93％产率)。MS(ESI-MS)：m/z计算C36H44F2N3O7 +＝668.3，得到668.3。
化合物35：根据通用程序A，由28(30mg，66μmol)和NH2-PEG4-CO2 tBu来合成化合物35。在室温下搅拌反应混合物1小时，随后通过柱色谱(C18硅胶，用含0.1％甲酸的水中的0-100％CH3CN洗脱)来纯化，以得到呈无色膜状的35(47mg，94％产率)。MS(ESI-MS)：m/z计算C40H52F2N3O9 +＝756.4，得到756.4。
化合物36：根据通用程序A，由28(30mg，66μmol)和NH2-PEG1-NHBoc来合成化合物36。在室温下搅拌反应混合物1小时，随后通过柱色谱(C18硅胶，用含0.1％甲酸的水中的0-100％CH3CN洗脱)来纯化，以得到呈无色膜状的36(35mg，82％产率)。MS(ESI-MS)：m/z计算C34H41F2N4O6 +＝639.3，得到639.3。
化合物37：根据通用程序A，由28(100mg，221μmol)和NH2-PEG2-NHBoc来合成化合物37。在室温下搅拌反应混合物1小时，随后通过柱色谱(C18硅胶，用含0.1％甲酸的水中的0-100％CH3CN洗脱)来纯化，以得到呈无色膜状的37(126mg，84％产率)。MS(ESI-MS)：m/z计算C36H45F2N4O7 +＝683.3，得到683.3。
化合物38：根据通用程序A，由28(30mg，66μmol)and NH2-PEG4-NHBoc来合成化合物33。在室温下搅拌反应混合物1小时，随后通过柱色谱(C18硅胶，用含0.1％甲酸的水中的0-100％CH3CN洗脱)来纯化，以得到呈无色膜状的38(37mg，72％产率)。MS(ESI-MS)：m/z计算C40H53F2N4O9 +＝771.4，得到771.4。
Figure BDA0002508295540001301
通用程序C-由Boc-丁酯或叔丁酯保护的配体合成光探针：用纯三氟乙酸(2mL)处理所述Boc-丁酯或叔丁酯保护的配体(1当量)。使混合物在室温下搅拌5分钟，随后在减压下浓缩到干燥。随后将残余物再悬浮于DMF(2mL)中，接着用DIEA(10当量)、HATU(2.0当量)和光激活弹头(以游离胺、胺盐酸盐或羧酸形式)处理。在室温下搅拌所得混合物直到LC-MS分析指示反应完成，随后通过反相快速柱色谱来纯化光探针。将含有所期望的产物的部分合并且浓缩以去除CH3CN，随后冷冻并冻干，以得到呈白色固体状的最终光探针。
Figure BDA0002508295540001302
化合物39：根据通用程序C，由33(33mg，53μmol)和2-(3-(2-叠氮基乙基)-3H-双吖丙啶-3-基)乙-1-胺来合成化合物39(I-24)。参见潘,S.(Pan,S.)；蒋,S.(Jang,S.)；王,D.(Wang,D.)；刘,S.(Liew,S.)；李,Z.(Li,Z.)；李,J.(Lee,J.)；姚,S.Q.(Yao,S.Q.)应用化学国际版,2017,39,11816-11821。在室温下搅拌1小时之后，通过C18硅胶上的快速柱色谱来纯化混合物，以得到呈白色固体状的39(17mg，46％产率)。MS(ESI-MS)：m/z计算C35H40F2N9O5 +＝704.3，得到704.3。
化合物40：根据通用程序C，由34(22mg，33μmol)和2-(3-(2-叠氮基乙基)-3H-双吖丙啶-3-基)乙-1-胺来合成化合物40(I-25)。在室温下搅拌1小时之后，通过C18硅胶上的快速柱色谱来纯化混合物，以得到呈白色固体状的40(15mg，62％产率)。MS(ESI-MS)：m/z计算C37H44F2N9O6 +＝748.3，得到748.3。
化合物41：根据通用程序C，由35(32mg，43μmol)和2-(3-(2-叠氮基乙基)-3H-双吖丙啶-3-基)乙-1-胺来合成化合物41(I-26)。在室温下搅拌1小时之后，通过C18硅胶上的快速柱色谱来纯化混合物，以得到呈白色固体状的41(16mg，45％产率)。MS(ESI-MS)：m/z计算C41H52F2N9O8 +＝836.4，得到836.4。
Figure BDA0002508295540001311
化合物42：根据通用程序C，由33(33mg，53μmol)和4-叠氮苯胺盐酸盐来合成化合物42(I-27)。在室温下搅拌1小时之后，通过C18硅胶上的快速柱色谱来纯化混合物，以得到呈白色固体状的42(14mg，39％产率)。MS(ESI-MS)：m/z计算C36H36F2N7O5 +＝684.3，得到684.3。
化合物43：根据通用程序C，由34(22mg，33μmol)和4-叠氮苯胺盐酸盐来合成化合物43(I-28)。在室温下搅拌1小时之后，通过C18硅胶上的快速柱色谱来纯化混合物，以得到呈白色固体状的43(11mg，43％产率)。MS(ESI-MS)：m/z计算C38H40F2N7O6 +＝728.4，得到728.4。
化合物44：根据通用程序C，由35(32mg，43μmol)和4-叠氮苯胺盐酸盐来合成化合物44(I-29)。在室温下搅拌1小时之后，通过C18硅胶上的快速柱色谱来纯化混合物，以得到呈白色固体状的44(17mg，49％产率)。MS(ESI-MS)：m/z计算C42H48F2N7O8 +＝816.4，得到816.4。
Figure BDA0002508295540001321
化合物45：根据通用程序C，由36(11mg，17μmol)和4-叠氮苯甲酸来合成化合物45(I-30)。在室温下搅拌1小时之后，通过C18硅胶上的快速柱色谱来纯化混合物，以得到呈白色固体状的45(10mg，85％产率)。MS(ESI-MS)：m/z计算C36H36F2N7O5 +＝684.3，得到684.3。
化合物46：根据通用程序C，由37(14mg，21μmol)和4-叠氮苯甲酸来合成化合物46(I-31)。在室温下搅拌1小时之后，通过C18硅胶上的快速柱色谱来纯化混合物，以得到呈白色固体状的46(11mg，71％产率)。MS(ESI-MS)：m/z计算C38H40F2N7O6 +＝728.4，得到728.4。
化合物47：根据通用程序C，由38(21mg，27μmol)和4-叠氮苯甲酸来合成化合物47(I-32)。在室温下搅拌1小时之后，通过C18硅胶上的快速柱色谱来纯化混合物，以得到呈白色固体状的47(12mg，54％产率)。MS(ESI-MS)：m/z计算C42H48F2N7O8 +＝816.4，计算816.4。
Figure BDA0002508295540001322
化合物48：根据通用程序C，由37(126mg，184μmol)和3-叠氮基-5-(叠氮基甲基)苯甲酸来合成化合物48(I-33)。在室温下搅拌16小时之后，通过C18硅胶上的快速柱色谱来纯化混合物，以得到呈白色固体状的48(26mg，18％产率)。MS(ESI-MS)：m/z计算C39H41F2N10O6 +＝783.4，得到783.4。
Figure BDA0002508295540001331
化合物49：根据通用程序A，由31(30mg，58μmol)和NH2-PEG1-NHBoc来合成化合物49。在室温下搅拌反应混合物1小时，随后通过柱色谱(C18硅胶，用含0.1％甲酸的水中的0-100％CH3CN洗脱)来纯化，以得到呈无色膜状的49(27mg，65％产率)。MS(ESI-MS)：m/z计算C39H45F2N4O6 +＝703.3，得到703.3。
化合物50：根据通用程序A，由31(30mg，58μmol)和NH2-PEG2-NHBoc来合成化合物50。在室温下搅拌反应混合物1小时，随后通过柱色谱(C18硅胶，用含0.1％甲酸的水中的0-100％CH3CN洗脱)来纯化，以得到呈无色膜状的50(31mg，69％产率)。MS(ESI-MS)：m/z计算C41H49F2N4O7 +＝747.3，得到747.3。
化合物51：根据通用程序A，由31(30mg，58μmol)和NH2-PEG4-NHBoc来合成化合物51。在室温下搅拌反应混合物1小时，随后通过柱色谱(C18硅胶，用含0.1％甲酸的水中的0-100％CH3CN洗脱)来纯化，以得到呈无色膜状的51(41mg，84％产率)。MS(ESI-MS)：m/z计算C45H57F2N4O9 +＝835.3，得到835.3。
Figure BDA0002508295540001332
化合物52：根据通用程序C，由49(25mg，36μmol)和4-叠氮苯甲酸来合成化合物52(I-34)。在室温下搅拌1小时之后，通过C18硅胶上的快速柱色谱来纯化混合物，以得到呈白色固体状的52(9mg，34％产率)。MS(ESI-MS)：m/z计算C41H40F2N7O5 +＝748.3，得到748.3。
化合物53：根据通用程序C，由50(30mg，40μmol)和4-叠氮苯甲酸来合成化合物53(I-35)。在室温下搅拌1小时之后，通过C18硅胶上的快速柱色谱来纯化混合物，以得到呈白色固体状的53(6mg，19％产率)。MS(ESI-MS)：m/z计算C43H44F2N7O6 +＝792.3，得到792.3。
化合物54：根据通用程序C，由51(31mg，37μmol)和4-叠氮苯甲酸来合成化合物54(I-36)。在室温下搅拌1小时之后，通过C18硅胶上的快速柱色谱来纯化混合物，以得到呈白色固体状的54(23mg，71％产率)。MS(ESI-MS)：m/z计算C47H52F2N7O8 +＝880.4，得到880.4。
尽管我们已经描述多个本发明实施例，但显而易见，可以改变我们的基础实例以提供利用本发明的化合物和方法的其它实施例。因此，应了解，本发明范围应该由所附权利要求书而不是所举例表示的特定实施例来界定。

Claims (40)

1.一种式I化合物，
Figure FDA0002508295530000011
或其药学上可接受的盐；其中：
配体是小分子RNA结合子；
T1是二价系链基团；并且
Rmod是光激活基团。
2.一种式II化合物，
Figure FDA0002508295530000012
或其药学上可接受的盐；其中：
配体是小分子RNA结合子；
T1是二价系链基团；
T2是共价键或二价系链基团；
Rmod是光激活基团；并且
RCG是点击就绪基团或拉下基团。
3.一种式III化合物，
Figure FDA0002508295530000013
或其药学上可接受的盐；其中：
配体是小分子RNA结合子；
T1是三价系链基团；
T2是二价系链基团；
Rmod是光激活基团；并且
RCG是点击就绪基团或拉下基团。
4.一种式II-a化合物，
Figure FDA0002508295530000021
或其药学上可接受的盐；其中：
配体是小分子RNA结合子；
T1是共价键或二价系链基团；
T2是共价键或二价系链基团；
Rmod是光激活基团；并且
RCG是点击就绪基团或拉下基团。
5.一种式II-b或II-c化合物，
Figure FDA0002508295530000022
或其药学上可接受的盐；其中：
配体是小分子RNA结合子；
T1是二价系链基团；
Rmod是光激活基团；并且
RCG是点击就绪基团或拉下基团。
6.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的化合物，其中配体是选自：杂芳基二氢嘧啶(HAP)、大环内酯、生物碱、氨基糖苷、四环素、SMN2配体、截短侧耳素、茶碱或其类似物、瑞博希或其类似物、经取代的蒽、经取代的三蝶烯、噁唑烷酮，或CPNQ或其类似物；其中配体可以任选地经一或多个取代基取代。
7.根据权利要求1到6中任一权利要求所述的化合物，其中配体是选自：任选地经取代的杂芳基二氢嘧啶(HAP)、红霉素、阿奇霉素、黄连素、巴马亭、巴龙霉素、新霉素、卡那霉素、多西环素、土霉素、截短侧耳素、茶碱或其类似物、瑞博希或其类似物、LMI070(NVS-SM1)、经取代的三蝶烯、利奈唑胺、特地唑胺，或CPNQ或其类似物；其中配体可以任选地经1、2、3或4个取代基取代。
8.根据权利要求1到7中任一权利要求所述的化合物，其中T1是选自：C1-20二价直链或支链烃链，其中所述链的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个亚甲基单元独立地并且任选地经天然或非天然氨基酸、-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)-、-C(O)N(R)-、-(R)NC(O)-、-OC(O)N(R)-、-(R)NC(O)O-、-N(R)C(O)N(R)-、-S-、-SO-、-SO2-、-SO2N(R)-、-(R)NSO2-、-C(S)-、-C(S)O-、-OC(S)-、-C(S)N(R)-、-(R)NC(S)-、-(R)NC(S)N(R)-或-Cy-置换；并且所述链的1-20个亚甲基单元独立地并且任选地经-OCH2CH2-置换；
其中每个-Cy-独立地为：任选地经取代的二价3-8元饱和或部分不饱和单环碳环；任选地经取代的亚苯基；具有1-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的4-8元饱和或部分不饱和单环杂环；具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5-6元单环杂芳香族环；具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8-10元双环或桥联双环饱和或部分不饱和杂环；或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8-10元双环或桥联双环杂芳香族环；并且
每个R独立地为氢或为选自以下的任选地经取代的基团：C1-6脂族基；3-8元饱和或部分不饱和单环碳环；苯基；8-10元双环芳香族碳环；具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-8元饱和或部分不饱和单环杂环；具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳香族环；或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元双环杂芳香族环。
9.根据权利要求8所述的化合物，其中T1是选自C1-10二价直链或支链烃链，其中所述链的1、2、3、4或5个亚甲基单元独立地并且任选地经天然或非天然氨基酸、-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)-、-C(O)N(R)-、-(R)NC(O)-、-OC(O)N(R)-、-(R)NC(O)O-、-N(R)C(O)N(R)-、-S-、-SO-、-SO2-、-SO2N(R)-、-(R)NSO2-、-C(S)-、-C(S)O-、-OC(S)-、-C(S)N(R)-、-(R)NC(S)-、-(R)NC(S)N(R)-或-Cy-置换；并且所述链的1、2、3、4或5个亚甲基单元独立地并且任选地经-OCH2CH2-置换。
10.根据权利要求2到4中任一权利要求所述的化合物，其中T2是选自C1-20二价直链或支链烃链，其中所述链的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个亚甲基单元独立地并且任选地经天然或非天然氨基酸、-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)-、-C(O)N(R)-、-(R)NC(O)-、-OC(O)N(R)-、-(R)NC(O)O-、-N(R)C(O)N(R)-、-S-、-SO-、-SO2-、-SO2N(R)-、-(R)NSO2-、-C(S)-、-C(S)O-、-OC(S)-、-C(S)N(R)-、-(R)NC(S)-、-(R)NC(S)N(R)-或-Cy-置换；并且所述链的1-20个亚甲基单元独立地并且任选地被-OCH2CH2-置换；
其中每个-Cy-独立地为：任选地经取代的二价3-8元饱和或部分不饱和单环碳环；任选地经取代的亚苯基；具有1-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的4-8元饱和或部分不饱和单环杂环；具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5-6元单环杂芳香族环；具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8-10元双环或桥联双环饱和或部分不饱和杂环；或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8-10元双环或桥联双环杂芳香族环；并且
每个R独立地为氢或为选自以下的任选地经取代的基团：C1-6脂族基；3-8元饱和或部分不饱和单环碳环；苯基；8-10元双环芳香族碳环；具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-8元饱和或部分不饱和单环杂环；具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳香族环；或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元双环杂芳香族环。
11.根据权利要求1到10中任一权利要求所述的化合物，其中Rmod是选自一旦用紫外线(UV)辐射照射，就产生自由基、芳基或杂芳基碳阳离子、氮烯或碳烯中间体的官能团；并且其中一旦照射，Rmod就能够与配体结合的靶RNA反应以与所述靶RNA产生共价键。
12.根据权利要求1到10中任一权利要求所述的化合物，其中Rmod是选自：任选地经取代的苯基或8-10元双环芳香族碳环叠氮化物或5-8元杂芳基或8-10元双环杂芳基叠氮化物；任选地经取代的苯甲酰基叠氮化物或5-8元杂芳酰基叠氮化物或8-10元杂芳酰基叠氮化物，其中环原子中的1-3个原子是选自氮、硫或氧；任选地经取代的苯基或8-10元双环芳香族碳环重氮盐；任选地经取代的5-8元杂芳基或8-10元双环杂芳基重氮盐，其中环原子中的1-3个原子是选自氮、硫或氧；任选地经取代的C2-6脂肪族重氮官能团；任选地经取代的C2-6脂肪族双吖丙啶；或任选地经取代的二苯基或8-10元二杂芳基酮，其中环原子中的1-3个原子是选自氮、硫或氧；任选地经取代的二氢芘；任选地经取代的螺噁嗪；任选地经取代的蒽；任选地经取代的俘精酸酐；或任选地经取代的螺吡喃。
13.根据权利要求1到12中任一权利要求所述的化合物，其中Rmod是选自：
Figure FDA0002508295530000051
Figure FDA0002508295530000052
Figure FDA0002508295530000061
其中Y-为药学上可接受的阴离子。
14.一种式X-a化合物，
Figure FDA0002508295530000062
或其互变异构体或药学上可接受的盐，其中：
Ar1为任选地经取代的苯基或具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5-6元单环杂芳香族环；
Ar2为具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5-6元单环杂芳香族环，或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选经取代的8-10元双环杂芳香族环；
X是选自二价C1-3亚烷基链，其中所述链的1-2个亚甲基单元独立地并且任选地经-O-、-NR6-、-S-、-C(O)-、-CO2-、-CS-、-C(NR6)-、-S(O)-或-S(O)2-置换；
R1是选自：-C(O)R6、-CO2R、-C(O)NR2、-C1-6脂族基、-CN、-(CH2)1-3OR、-(CH2)1-3NHR、-N(R)C(O)OR6、-N(R6)C(O)R、-OC(O)R、-OR、-NHR6或-N(R)C(O)NHR；
如果R3不存在，那么R2为任选地包括点击就绪基团的光激活基团；
R3不存在或为点击就绪基团或拉下基团；
每个R6独立地为氢或为任选地经1、2、3、4、5或6个氘或卤素原子取代的C1-6烷基；
每个R独立地为氢或为选自以下的任选地经取代的基团：C1-6脂族基；3-8元饱和或部分不饱和单环碳环；苯基；8-10元双环芳香族碳环；具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-8元饱和或部分不饱和单环杂环；具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳香族环；或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元双环杂芳香族环；
L1是C1-20二价、三价或四价直链或支链烃链，其中所述链的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个亚甲基单元独立地并且任选地经天然或非天然氨基酸、-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)-、-C(O)N(R)-、-(R)NC(O)-、-OC(O)N(R)-、-(R)NC(O)O-、-N(R)C(O)N(R)-、-S-、-SO-、-SO2-、-SO2N(R)-、-(R)NSO2-、-C(S)-、-C(S)O-、-OC(S)-、-C(S)N(R)-、-(R)NC(S)-、-(R)NC(S)N(R)-或-Cy-置换；并且所述链的1-20个亚甲基单元独立地并且任选地经-OCH2CH2-置换；
每个-Cy-独立地为：任选地经取代的二价3-8元饱和或部分不饱和单环碳环；任选地经取代的亚苯基；具有1-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的4-8元饱和或部分不饱和单环杂环；具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5-6元单环杂芳香族环；具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8-10元双环或桥联双环饱和或部分不饱和杂环；或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8-10元双环或桥联双环杂芳香族环；并且
n为0或1。
15.一种式X-b化合物，
Figure FDA0002508295530000071
或其互变异构体或药学上可接受的盐，其中：
Ar1为任选地经取代的苯基或具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5-6元单环杂芳香族环；
Ar2为具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5-6元单环杂芳香族环，或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选经取代的8-10元双环杂芳香族环；
其中Ar1或Ar2中的一者经一个R2取代；
X是选自二价C1-3亚烷基链，其中所述链的1-2个亚甲基单元独立地并且任选地经-O-、-NR6-、-S-、-C(O)-、-CO2-、-CS-、-C(NR6)-、-S(O)-或-S(O)2-置换；
R1是选自：-C(O)R6、-CO2R、-C(O)NR2、-C1-6脂族基、-CN、-(CH2)1-3OR、-(CH2)1-3NHR、-N(R)C(O)OR6、-N(R6)C(O)R、-OC(O)R、-OR、-NHR6或-N(R)C(O)NHR；
如果R3不存在，那么R2为任选地包括点击就绪基团的光激活基团；
R3不存在或为点击就绪基团或拉下基团；
每个R6独立地为氢或为任选地经1、2、3、4、5或6个氘或卤素原子取代的C1-6烷基；
每个R独立地为氢或为选自以下的任选地经取代的基团：C1-6脂族基；3-8元饱和或部分不饱和单环碳环；苯基；8-10元双环芳香族碳环；具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-8元饱和或部分不饱和单环杂环；具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳香族环；或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元双环杂芳香族环；
L1是C1-20二价或三价直链或支链烃链，其中所述链的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个亚甲基单元独立地并且任选地经天然或非天然氨基酸、-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)-、-C(O)N(R)-、-(R)NC(O)-、-OC(O)N(R)-、-(R)NC(O)O-、-N(R)C(O)N(R)-、-S-、-SO-、-SO2-、-SO2N(R)-、-(R)NSO2-、-C(S)-、-C(S)O-、-OC(S)-、-C(S)N(R)-、-(R)NC(S)-、-(R)NC(S)N(R)-或-Cy-置换；并且所述链的1-20个亚甲基单元独立地并且任选地经-OCH2CH2-置换；
每个-Cy-独立地为：任选地经取代的二价3-8元饱和或部分不饱和单环碳环；任选地经取代的亚苯基；具有1-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的4-8元饱和或部分不饱和单环杂环；具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5-6元单环杂芳香族环；具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8-10元双环或桥联双环饱和或部分不饱和杂环；或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8-10元双环或桥联双环杂芳香族环；并且
n为0或1。
16.根据权利要求14或15所述的化合物，其中R2是选自任选地经取代的苯基或8-10元双环芳香族碳环叠氮化物或5-8元杂芳基或8-10元双环杂芳基叠氮化物；任选地经取代的苯甲酰基叠氮化物或5-8元杂芳酰基叠氮化物或8-10元杂芳酰基叠氮化物，其中环原子中的1-3个原子是选自氮、硫或氧；任选地经取代的苯基或8-10元双环芳香族碳环重氮盐；任选地经取代的5-8元杂芳基或8-10元双环杂芳基重氮盐，其中环原子中的1-3个原子是选自氮、硫或氧；任选地经取代的C2-6脂肪族重氮官能团；任选地经取代的C2-6脂肪族双吖丙啶；或任选地经取代的二苯基或8-10元二杂芳基酮，其中环原子中的1-3个原子是选自氮、硫或氧；任选地经取代的二氢芘；任选地经取代的螺噁嗪；任选地经取代的蒽；任选地经取代的俘精酸酐；任选地经取代的螺吡喃；任选地经取代的α-吡喃酮或任选地经取代的嘧啶酮。
17.根据权利要求14到16中任一权利要求所述的化合物，其中R2是选自：
Figure FDA0002508295530000091
Figure FDA0002508295530000092
Figure FDA0002508295530000093
其中Y-为药学上可接受的阴离子。
18.根据权利要求14到17中任一权利要求所述的化合物，其中R3为叠氮化物、炔烃、4-二苯并环辛炔醇(DIBO)、gem-二氟化环辛炔(DIFO或DFO)、二芳基氮杂环辛炔酮(BARAC)、二环壬炔(BCN)、应变环辛炔、肟、氧杂降冰片二烯或生物素。
19.根据权利要求14到17中任一权利要求所述的化合物，其中所述化合物具有式XIII：
Figure FDA0002508295530000101
或其互变异构体或药学上可接受的盐。
20.根据权利要求14或16到18中任一权利要求所述的方法，其中所述化合物具有式XIV：
Figure FDA0002508295530000102
或其互变异构体或药学上可接受的盐，其中X、L1、R1、R2、R3、R6、R、-Cy-和n中的每一者如上文所定义并且如在本文的实施例中单独和以组合形式所描述。
21.根据权利要求14或16到18中任一权利要求所述的方法，其中所述化合物具有式XV：
Figure FDA0002508295530000103
或其互变异构体或药学上可接受的盐。
22.根据权利要求14或16到18中任一权利要求所述的化合物，其中所述化合物具有式XVI、XVII、XVIII或XIX：
Figure FDA0002508295530000111
或其互变异构体或药学上可接受的盐。
23.一种选自表5中的那些化合物中的一个的化合物或其互变异构体或药学上可接受的盐。
24.一种式XXV化合物，
Figure FDA0002508295530000112
或其药学上可接受的盐，其中：
Ar1为任选地经取代的苯基或具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5-6元单环杂芳香族环；
Ar3为任选地经取代的苯基；具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5-6元单环杂芳香族环；任选地经取代的8-12元双环芳香族环或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8-10元双环杂芳香族环；
X是选自二价C1-3亚烷基链，其中所述链的1-2个亚甲基单元独立地并且任选地经-O-、-NR6-、-S-、-C(O)-、-CO2-、-CS-、-C(NR6)-、-S(O)-或-S(O)2-置换；
X2是选自二价C1-3亚烷基链，其中所述链的1-2个亚甲基单元独立地并且任选地经-O-、-NR6-、-S-、-C(O)-、-CO2-、-CS-、-C(NR6)-、-S(O)-或-S(O)2-置换；
如果R3不存在，那么R2为任选地包括点击就绪基团的光激活基团；
R3不存在或为点击就绪基团或拉下基团；
每个R4独立地为：R、卤素、-CN、-NO2、-OR、-SR、-NR2、-S(O)2R、-S(O)2NR2、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2、-N(R)S(O)2R或-N(R)S(O)2NR2；或R4的两个例子可以与其所连接的原子一起形成C4-8部分不饱和碳环；
每个R5独立地为：R、卤素、-CN、-NO2、-OR、-SR、-NR2、-S(O)2R、-S(O)2NR2、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2、-N(R)S(O)2R或-N(R)S(O)2NR2；或R5的两个例子可以一起形成＝O或＝S；
每个R6独立地为氢或为任选地经1、2、3、4、5或6个氘或卤素原子取代的C1-6烷基；
每个R独立地为氢或为选自以下的任选地经取代的基团：C1-6脂族基；3-8元饱和或部分不饱和单环碳环；苯基；8-10元双环芳香族碳环；具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-8元饱和或部分不饱和单环杂环；具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳香族环；或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元双环杂芳香族环；
L2为C1-20任选地经取代的二价或三价直链或支链烃链，其中所述链的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个亚甲基单元独立地并且任选地经天然或非天然氨基酸、-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)-、-C(O)N(R)-、-(R)NC(O)-、-OC(O)N(R)-、-(R)NC(O)O-、-N(R)C(O)N(R)-、-S-、-SO-、-SO2-、-SO2N(R)-、-(R)NSO2-、-C(S)-、-C(S)O-、-OC(S)-、-C(S)N(R)-、-(R)NC(S)-、-(R)NC(S)N(R)-或-Cy-置换；并且所述链的1-20个亚甲基单元独立地并且任选地经-OCH2CH2-置换；
每个-Cy-独立地为：任选地经取代的二价3-8元饱和或部分不饱和单环碳环；任选地经取代的亚苯基；具有1-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的4-8元饱和或部分不饱和单环杂环；具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5-6元单环杂芳香族环；具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8-10元双环或桥联双环饱和或部分不饱和杂环；或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8-10元双环或桥联双环杂芳香族环；
m为0、1、2、3或4；并且
p为0、1、2、3或4。
25.一种式XXVI化合物，
Figure FDA0002508295530000131
或其药学上可接受的盐，其中：
Ar1为任选地经取代的苯基或具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5-6元单环杂芳香族环；
Ar3为任选地经取代的苯基；具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5-6元单环杂芳香族环；任选地经取代的8-12元双环芳香族环或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8-10元双环杂芳香族环；
X是选自二价C1-3亚烷基链，其中所述链的1-2个亚甲基单元独立地并且任选地经-O-、-NR6-、-S-、-C(O)-、-CO2-、-CS-、-C(NR6)-、-S(O)-或-S(O)2-置换；
X2是选自二价C1-3亚烷基链，其中所述链的1-2个亚甲基单元独立地并且任选地经-O-、-NR6-、-S-、-C(O)-、-CO2-、-CS-、-C(NR6)-、-S(O)-或-S(O)2-置换；
如果R3不存在，那么R2为任选地包括点击就绪基团的光激活基团；
R3不存在或为点击就绪基团或拉下基团；
每个R4独立地为：R、卤素、-CN、-NO2、-OR、-SR、-NR2、-S(O)2R、-S(O)2NR2、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2、-N(R)S(O)2R或-N(R)S(O)2NR2；或R4的两个例子可以与其所连接的原子一起形成C4-8部分不饱和碳环；
每个R5独立地为：R、卤素、-CN、-NO2、-OR、-SR、-NR2、-S(O)2R、-S(O)2NR2、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2、-N(R)S(O)2R或-N(R)S(O)2NR2；或R5的两个例子可以一起形成＝O或＝S；
每个R6独立地为氢或为任选地经1、2、3、4、5或6个氘或卤素原子取代的C1-6烷基；
每个R7独立地为：R、卤素、-CN、-NO2、-OR、-SR、-NR2、-S(O)2R、-S(O)2NR2、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2、-N(R)S(O)2R或-N(R)S(O)2NR2；或R4的两个例子可以与其所连接的原子一起形成C4-8部分不饱和碳环；
每个R独立地为氢或为选自以下的任选地经取代的基团：C1-6脂族基；3-8元饱和或部分不饱和单环碳环；苯基；8-10元双环芳香族碳环；具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-8元饱和或部分不饱和单环杂环；具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳香族环；或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元双环杂芳香族环；
L2为C1-20任选地经取代的二价或三价直链或支链烃链，其中所述链的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个亚甲基单元独立地并且任选地经天然或非天然氨基酸、-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)-、-C(O)N(R)-、-(R)NC(O)-、-OC(O)N(R)-、-(R)NC(O)O-、-N(R)C(O)N(R)-、-S-、-SO-、-SO2-、-SO2N(R)-、-(R)NSO2-、-C(S)-、-C(S)O-、-OC(S)-、-C(S)N(R)-、-(R)NC(S)-、-(R)NC(S)N(R)-或-Cy-置换；并且所述链的1-20个亚甲基单元独立地并且任选地经-OCH2CH2-置换；
每个-Cy-独立地为：任选地经取代的二价3-8元饱和或部分不饱和单环碳环；任选地经取代的亚苯基；具有1-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的4-8元饱和或部分不饱和单环杂环；具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5-6元单环杂芳香族环；具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8-10元双环或桥联双环饱和或部分不饱和杂环；或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8-10元双环或桥联双环杂芳香族环；
m为0、1、2、3或4；并且
p为0、1、2、3或4。
26.根据权利要求24或25所述的化合物，其中Ar1为任选地经1、2、3或4个选自以下的取代基取代的苯基：卤素、-C1-6脂族基、-CN、-OR、-NR2、-CO2R、-C(O)R、-SR或-C(O)NR2。
27.根据权利要求24到26中任一权利要求所述的化合物，其中Ar3为任选地经1、2、3或4个选自以下的取代基取代的苯基：卤素、-C1-6脂族基、-CN、-OR、-NR2、-CO2R、-C(O)R、-SR或-C(O)NR2。
28.根据权利要求24到27中任一权利要求所述的化合物，其中X是二价C1-3亚烷基链，其中所述链的1-2个亚甲基单元独立地并且任选地经-O-、-NR6-、-S-、-C(O)-、-CO2-、-CS-、-C(NR6)-、-S(O)-或-S(O)2-置换。
29.根据权利要求24到28中任一权利要求所述的化合物，其中X2为二价C1-2亚烷基链，其中所述链的一个亚甲基单元任选地经-O-、-NR6-、-S-、-C(O)-、-CO2-、-CS-、-C(NR6)-、-S(O)-或-S(O)2-置换。
30.根据权利要求24到29中任一权利要求所述的化合物，其中R4为：氢；C1-6脂族基；3-8元饱和或部分不饱和单环碳环；苯基；8-10元双环芳香族碳环；具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-8元饱和或部分不饱和单环杂环；具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳香族环；具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元双环杂芳香族环；卤素；-CN；-NO2；-OR；-SR；-NR2；-S(O)2R；-S(O)2NR2；-S(O)R；-C(O)R；-C(O)OR；-C(O)NR2；-OC(O)R或-N(R)C(O)R。
31.根据权利要求24到30中任一权利要求所述的化合物，其中R5为：氢；C1-6脂族基；3-8元饱和或部分不饱和单环碳环；苯基；8-10元双环芳香族碳环；具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-8元饱和或部分不饱和单环杂环；具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳香族环；具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元双环杂芳香族环；卤素；-CN；-NO2；-OR；-SR；-NR2；-S(O)2R；-S(O)2NR2；-S(O)R；-C(O)R；-C(O)OR；-C(O)NR2；-OC(O)R或-N(R)C(O)R。
32.根据权利要求24到31中任一权利要求所述的化合物，其中L2为C1-20任选地经取代的二价或三价直链或支链烃链，其中所述链的1、2、3、4或5个亚甲基单元独立地并且任选地经-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)-、-C(O)N(R)-、-(R)NC(O)-、-S-、-SO-、-SO2-、-C(S)-或-Cy-置换；并且所述链的1-20个亚甲基单元独立地并且任选地经-OCH2CH2-置换。
33.根据权利要求24到32中任一权利要求所述的化合物，其中R2是选自：
Figure FDA0002508295530000161
Figure FDA0002508295530000162
Figure FDA0002508295530000163
其中Y-为药学上可接受的阴离子。
34.根据权利要求24到33中任一权利要求所述的化合物，其中R3为C1-6烷基叠氮化物、C1-6炔烃或半抗原。
35.根据权利要求24所述的化合物，其中所述化合物具有式XXIX、XXX、XXXI、XXXII或XXXIII：
Figure FDA0002508295530000171
或其药学上可接受的盐。
36.根据权利要求25所述的化合物，其中所述化合物具有式XXXVIII、XXXIX、XL、XLI或XLII：
Figure FDA0002508295530000181
或其药学上可接受的盐。
37.根据权利要求25所述的化合物，其中R7为：氢；C1-6脂族基；3-8元饱和或部分不饱和单环碳环；苯基；8-10元双环芳香族碳环；具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-8元饱和或部分不饱和单环杂环；具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳香族环；具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元双环杂芳香族环；卤素；-CN；-NO2；-OR；-SR；-NR2；-S(O)2R；-S(O)2NR2；-S(O)R；-C(O)R；-C(O)OR；-C(O)NR2；-OC(O)R或-N(R)C(O)R。
38.一种RNA偶联物，其包括靶RNA和根据权利要求1到37中任一权利要求所述的化合物，其中Rmod或R2与所述靶RNA形成共价键。
39.一种确定靶核酸中核苷酸的三维结构、所关注的配体的结合位点或可接近性的方法，其包括：使所述靶核酸与根据权利要求1到37中任一权利要求所述的化合物或其药学上可接受的盐接触；照射所述化合物；确定所述核酸的核苷酸是否发生共价修饰；和任选地导出核苷酸修饰模式、三维结构、配体结合位点或关于所述核酸的其它结构信息。
40.一种制备核酸偶联物的方法，其包括：使靶核酸与根据权利要求1到37中任一权利要求所述的化合物或其药学上可接受的盐接触；照射所述化合物；和任选地通过亲和力分析、拉下方法分离所得核酸偶联物。
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