CN111378666B

CN111378666B - 一种靶向GDNF基因启动子II区内增强子II的dsRNA及其应用

Info

Publication number: CN111378666B
Application number: CN202010259258.9A
Authority: CN
Inventors: 张宝乐; 高殿帅; 韩笑; 刘捷; 高擎
Original assignee: Xuzhou Medical University
Current assignee: Xuzhou Medical University
Priority date: 2020-04-03
Filing date: 2020-04-03
Publication date: 2020-10-23
Anticipated expiration: 2040-04-03
Also published as: CN111378666A

Abstract

本发明公开了一种靶向GDNF基因启动子II区内增强子II的dsRNA及其应用。一种靶向GDNF基因启动子II区内增强子II的dsRNA，正向序列如SEQ ID NO.1所示，反向序列如SEQ ID NO.2所示。本发明所述的dsRNA可在制备抑制星形胶质母细胞瘤的药物和制备抑制星形胶质母细胞瘤迁移和侵袭的药物中应用。该dsRNA能特异性地显著降低人U251星形胶质母细胞瘤细胞中GDNF基因的转录水平，根据其序列包装的慢病毒Lenti‑E还显著降低了U251细胞的细胞增殖、迁移和侵袭能力，但对人正常原代星形胶质细胞HA没有影响；说明该dsRNA具有一定治疗胶质母细胞瘤的临床应用价值。

Description

一种靶向GDNF基因启动子II区内增强子II的dsRNA及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域,涉及一种靶向GDNF基因启动子II区内增强子II的dsRNA及其应用。

背景技术

胶质母细胞瘤(GBM)是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤[1,2]，多为侵袭性生长，易复发难根治，病人的中位生存期仅有14-16个月[3,4]。目前对于GBM的发病机制尚不完全清楚。近来的研究发现，GBM的发生发展与许多细胞因子的表达异常有关，其中胶质细胞系源性神经营养因子(glial cell-line derived neurotrophic factor,GDNF)被认为是与GBM尤其是星形胶质细胞(Astrocyte,AST)起源的GBM最密切的细胞因子之一[5-7]。在成人脑组织中GDNF主要由星形胶质细胞分泌[8,9]，且广泛低表达于不同的脑区[10,11]。不同脑区分泌的GDNF对多巴胺能、运动、感觉等多种神经元具有促成熟和分化、营养和保护等作用[12,13]。GDNF表达下调或缺失可引起帕金森、老年痴呆等多种神经退行性疾病[14]。可见，GDNF是脑内重要的生理性营养因子和促分化因子，维持其表达稳定对于多种神经元正常功能的发挥具有重要意义。然而，近来的研究发现GDNF在人脑GBM尤其是AST起源的GBM中异常表达，其表达量比正常脑组织高出约5-6倍[15,16]。高表达的GDNF主要来自于GBM细胞，并以自分泌及旁分泌的形式参与GBM细胞的增殖、侵袭、迁移以及GBM内血管的新生过程[17-19]。进一步的研究发现，敲减GDNF可有效地抑制GBM的发展进程[20]。由此可见，在不影响或较少影响AST正常分泌GDNF的前提下，特异性地抑制GBM细胞GDNF的表达具有治疗GBM的潜在临床价值。然而，如何实现以上策略，至今尚不明确。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种靶向GDNF基因启动子II区内增强子II的dsRNA。

本发明的另一目的是提供该dsRNA的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种靶向GDNF基因启动子II区内增强子II的dsRNA，正向序列如SEQ ID NO.1所示，反向序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明所述的dsRNA在制备抑制星形胶质母细胞瘤的药物中的应用。

本发明所述的dsRNA在制备抑制星形胶质母细胞瘤迁移和侵袭的药物中的应用。

靶向GDNF基因启动子II区内增强子II的shRNA，正义链序列如SEQ ID NO.15所示,反义链序列如SEQ ID NO.16所示。

所述的shRNA在制备抑制星形胶质母细胞瘤的药物中的应用。

所述的shRNA在制备抑制星形胶质母细胞瘤迁移和侵袭的药物中的应用。

含有本发明所述的shRNA的慢病毒pGCL-GFP载体。

本发明所述的慢病毒pGCL-GFP载体在制备抑制星形胶质母细胞瘤的药物中的应用。

所述的慢病毒pGCL-GFP载体在制备抑制星形胶质母细胞瘤迁移和侵袭的药物中的应用。

含有本发明所述的慢病毒pGCL-GFP载体包装的重组慢病毒。

本发明所述的重组慢病毒在制备抑制星形胶质母细胞瘤的药物中的应用。

所述的重组慢病毒在制备抑制星形胶质母细胞瘤迁移和侵袭的药物中的应用。

有益效果：

我们设计了靶向GDNF基因启动子II区内不同顺式作用元件的dsRNAs，筛选到一个靶向GDNF基因启动子II区增强子II的dsRNA，该dsRNA显著降低了GDNF基因的转录水平。我们根据该dsRNA的靶向序列包装了对应的慢病毒Lenti-E，并感染人正常星形胶质细胞HA和U251星形胶质母细胞瘤细胞，并利用real-time PCR和western blot技术检测了dsRNA对HA细胞和U251细胞中GDNF基因表达水平的影响，结果显示：Lenti-E显著降低了U251细胞中GDNF基因mRNA和蛋白的表达水平(P<0.05)，而未显著改变HA细胞中GDNF基因mRNA和蛋白的表达水平(P>0.05)，提示Lenti-E可能具有治疗胶质母细胞瘤的临床应用价值。利用CCK8、流式细胞术检测了dsRNA对HA和U251细胞增殖能力的影响，结果显示Lenti-E显著降低了U251细胞的细胞活性(P<0.01)，且在显著升高G1期细胞比例(P<0.05)的同时，显著降低了S期细胞比例(P<0.05)，在HA细胞中，感染Lenti-E未显著影响细胞活性和细胞周期的运行(P>0.05)。利用划痕实验和Transwell检测dsRNA对HA和U251细胞迁移和侵袭能力的影响，结果显示感染Lenti-E病毒后，显著降低了U251细胞的迁移和侵袭能力(P<0.05)，而未显著影响HA细胞的迁移和侵袭(P>0.05)。

附图说明

图1靶向GDNF启动子II区不同顺式作用元件的dsRNA对U251细胞和HA细胞中GDNF基因mRNA和蛋白表达的影响。在指数生长期将U251和HA细胞接种到12孔板中，融合度达50％后，用20nM靶向GDNF启动子的dsRNA和NC-dsRNA转染U251细胞，用10MOI lentivirus-dsRNAs-GDNF和lentivirus-NC感染U251和HA细胞。(A)人GDNF基因启动子II区示意图，其中方框代表CpG岛，深灰色线代表增强子II，浅灰色线代表沉默子II，+1代表转录起始位点，短黑线代表对应的6个dsRNA的靶位点位置。(B)Real-time PCR检测dsRNAs转染48h后U251细胞中GDNF mRNA的表达水平。(C，D)荧光显微镜观察发现大多数U251细胞在感染病毒72h后继续生长并发出绿色荧光(100×)。(E，F)Real-time PCR和western blot显示，在U251细胞中感染Lenti-S显著增加了GDNF mRNA和蛋白的表达水平(P<0.01)，而感染Lenti-E后GDNFmRNA和蛋白的表达水平显著降低(P<0.05)。(G，H)Real-time PCR和western blot显示，在HA细胞中感染Lenti-S显著增加了GDNF mRNA和蛋白的表达水平(P<0.01)，而感染Lenti-E后GDNF mRNA和蛋白的表达水平未显著改变(P>0.05)。ACTB作为内参基因。所有数据均来自三次独立重复实验，以均数±标准差表示。^*P<0.05,^**P<0.01。S：沉默子，E：增强子。

图2荧光显微镜检测HA细胞中dsRNA慢病毒的感染效率。感染72h后，在明场(A)和荧光(B)下观察到的HA细胞的代表性照片。结果表明，感染后几乎所有HA细胞均继续生长并发出绿色荧光(100×)。

图3靶向GDNF启动子II区不同顺式作用元件的dsRNA对U251和HA细胞增殖的影响。将96孔或6孔板中的U251和HA细胞感染Lenti-S，Lenti-E和Lenti-NC 72h后，利用CCK-8检测U251细胞(A)和HA细胞(B)的细胞活力；利用流式细胞仪检测U251细胞(C)和HA细胞(D)的细胞周期。所有数据均来自三次独立重复实验，以均数±标准差表示。^*P<0.05,^**P<0.01。

图4靶向GDNF启动子II区不同顺式作用元件的dsRNA对U251和HA细胞迁移和侵袭的影响。(A，B)划痕实验检测U251细胞的迁移能力。划痕0、24和48h后的代表性显微照片。通过以下公式量化迁移率：迁移率＝[1-(n h划痕的平均宽度-0h划痕的平均宽度)/0h划痕的平均宽度]×100％。(C，D)划痕实验检测HA细胞的迁移能力。划痕后0、24和48h后的代表性显微照片。(E，F)Transwell检测U251细胞的侵袭能力。在Transwell上室中孵育24h后，计数7个显微视野中浸润的U251细胞。(G，H)Transwell检测HA细胞的侵袭能力。Bar＝200μm。所有数据均来自三次独立重复实验，以均数±标准差表示。^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.001

图5外源添加GDNF对U251细胞迁移的影响。划痕实验检测50ng/ml GDNF对感染Lenti-NC的U251细胞迁移能力的影响。在受伤0、24和48h后的代表性显微照片。通过以下公式量化迁移率：迁移率＝[1-(n h划痕的平均宽度-0h划痕的平均宽度)/0h划痕的平均宽度]×100％。Bar＝200μm。所有数据均来自三次独立重复实验，以均数±标准差表示。^*P<0.05,^**P<0.01

具体实施方式

实施例1

1.1细胞培养

人U251星形胶质母细胞瘤细胞株购自ATCC细胞库，根据其细胞形态以及短串联重复序列进行了鉴定。人原代星形胶质细胞(human astrocytes,HA)购自ScienCell公司。将U251和HA细胞分别培养于含有10％胎牛血清的改良的Eagle's培养基(美国Gibco公司)和含有2％胎牛血清和星形胶质细胞生长补充因子的星形胶质细胞培养基(AM，ScienCell)中，内加青霉素100U/ml，链霉素100U/ml，置于37℃，5％CO₂饱和湿度培养箱内培养。

1.2靶向GDNF基因启动子II区不同顺式作用元件dsRNA的合成和转染

设计并化学合成6个靶向GDNF基因启动子II区内增强子II或沉默子II的含21个核苷酸的dsRNA(GenBank登录号：AF053749)和对照NC-dsRNA(表1)。BLAST分析排除这些dsRNA与其他人类基因具有显著序列同源性的可能性。根据

RNAiMAX试剂手册(Invitrogen)进行dsRNA的转染。简而言之，在转染前24h，将处于指数期的U251细胞接种到24孔板中。当细胞达到40-50％融合时，使用20nM靶向GDNF基因启动子II区的dsRNA和NC-dsRNA/FAM-NC-dsRNA转染U251细胞。孵育8h后，洗涤细胞去除转染试剂，并在48h后，收集它们用于后续实验。

表1 dsRNA序列信息

1.3靶向GDNF基因启动子II区不同顺式作用元件dsRNA重组慢病毒的构建和感染

在明确化学合成的靶向GDNF基因启动子II区的dsRNA对GDNF mRNA表达的作用后，我们构建并合成了GDNF-Enhancer(-1085)-dsRNA1和GDNF-Silencer(-265)-dsRNA2对应的shRNAs(表2)并将其克隆至慢病毒pGCL-GFP载体，使用Lentivector表达系统包装重组慢病毒。浓缩并收集病毒上清液后，通过real-time PCR检测病毒滴度。将U251和HA细胞以1×10⁴细胞/孔的密度接种在24孔板中。24h后，在存在polybrene(8μg/ml)的情况下，用1μl浓缩慢病毒感染U251和HA细胞。感染72h后，收集细胞用于以下实验。

表2 shRNA序列信息

1.4 RNA提取和Real-time PCR

采用TRIzol(Invitrogen公司)一步法从细胞中提取总RNA，操作过程按照说明书进行。紫外分光光度仪测定总RNA浓度及纯度。按Prime Script^TMII逆转录试剂盒(Takara)说明行逆转录反应合成cDNA第一链，反应体系如下：2μg RNA模板，Oligo(dT)引物(50μM)和random引物(50μM)各1μl、dNTP混合液1μl，然后用RNase Free dH2O补充至总体积10μl。混合液在65℃保温5min后，冰上迅速冷却。然后在上述变性后的反应液中加入4μl5×reaction buffer、0.5μl RNase inhibitor(40U/μl)、1μl Prime Script II RNase(200U/μl)、4.5μl无核酶水。反应条件如下：42℃40min，95℃5min。使用前将合成的cDNA于-20℃保存。

靶基因GDNF及内参β-actin(ACTB)扩增的上下游引物设计见表3。利用SYBRPremix Ex Taq^TMII试剂盒(Takara)在反应体系(20μl)下进行实时定量PCR：SYBR PremixEx Taq^TMII10μl、上下游引物(10μmol/L)各0.5μl、cDNA模板1μl和无核酶水8μl。通过

480荧光定量PCR系统(Roche)进行实时荧光定量分析。反应条件设置如下：95℃预变性30s；95℃变性20s，60℃退火15s；72℃延伸15s，扩增40个循环。通过熔解曲线分析PCR产物特异性。每个样品以ACTB基因的mRNA表达作为内参照，通过相对定量(2^-ΔΔCT)法计算目的基因在各样品中相对mRNA的表达水平。

表3 Real-time PCR引物信息

1.5 Western Blot

利用NP-40细胞裂解缓冲液提取各组细胞的总蛋白。BCA蛋白检测试剂盒(HyClone-Pierce)测定各样品总蛋白质浓度，并调节浓度一致。通过10％SDS-PAGE分离蛋白质样品，并转移到PVDF膜(Millipore)上。用封闭液(含5％脱脂牛奶的TBST溶液)室温封闭1h后，加入1：100稀释的兔抗人GDNF的单克隆抗体(abcam,ab176564)或1:5000稀释的鼠源ACTB单克隆抗体(proteintech,66009-1-Ig)。4℃孵育过夜。加Peroxidase-Labeled抗兔或抗鼠IgG第二抗体(1：5000稀释，KPL)室温孵育PVDF膜2h。TBST洗膜3次，采用GENVIEW公司的ECL化学发光试剂盒进行显色，ClinxChemiScope 6000X化学发光仪拍照。ACTB作为内参蛋白。

2.结果

为了探明靶向GDNF基因启动子Ⅱ区内各顺式作用元件的dsRNA对该基因转录调控的影响，我们针对GDNF基因启动子Ⅱ区中的增强子Ⅱ和沉默子Ⅱ序列分别设计、合成了3个dsRNA(图1A)，转染U251胶质母细胞瘤细胞48h后，利用real-time PCR技术检测了GDNF基因的转录水平。结果显示，靶向沉默子Ⅱ的dsRNAs不同程度的升高了GDNF基因的转录水平，其中S-dsRNA2组升高了1.43倍(P<0.01)；而靶向增强子Ⅱ的dsRNAs显著降低了GDNF基因的转录水平，其中E-dsRNA1组下降了72％(P<0.01)(图1B)。

为了便于后续功能性实验的研究，我们根据S-dsRNA2和E-dsRNA1的靶向序列包装了对应的慢病毒，分别简称为Lenti-S和Lenti-E，并感染U251细胞。病毒感染72h后，利用荧光显微镜观察其生长与感染情况，并利用real-time PCR和western blot技术检测了U251细胞中GDNF基因的表达水平。结果显示，病毒感染72h，细胞生长未见显著异常，且感染率>95％(图1C,D)。慢病毒Lenti-S显著升高了GDNF基因mRNA和蛋白的表达水平(P<0.01)，而Lenti-E则显著降低了GDNF基因mRNA和蛋白的表达水平(P<0.05)，与其对应的dsRNA作用效果一致(图1E,F)。为了进一步明确Lenti-S和Lenti-E对HA细胞中GDNF基因表达是否具有相似的作用。我们用荧光显微镜观察Lenti-S和Lenti-E病毒感染72h后HA细胞的生长情况，并利用real-time PCR和western blot技术检测了HA细胞中GDNF基因的表达水平。结果显示，病毒感染72h后，HA细胞生长未见显著异常，且感染率>95％(图2)。慢病毒Lenti-S显著升高了GDNF基因mRNA和蛋白的表达水平(P<0.05)，而Lenti-E未显著改变GDNF基因mRNA和蛋白的表达水平(P>0.05)(图1G,H)，提示Lenti-E可能具有治疗胶质母细胞瘤的临床应用价值。

实施例2

1.1细胞活性检测

将U251细胞和HA细胞以2×10³/ml的细胞浓度接种于96孔板，每孔100μl。待细胞生长至50％汇合度时，感染Lenti-S、Lenti-E和Lenti-NC慢病毒，感染72h后，根据CCK8试剂盒(Dojindo Molecular Technologies)的说明书处理细胞，利用Biotek酶标仪读取450nm的吸光值。

1.2细胞周期检测

将U251细胞和HA细胞以每瓶(5–8)×10⁵的密度接种在25cm²培养瓶中。感染Lenti-S、Lenti-E和Lenti-NC慢病毒72h后，使用0.25％的胰酶消化细胞，用PBS洗涤两次，在预冷的70％(v/v)乙醇中固定过夜，并在4℃下用100μg/ml碘化丙啶(PI)染色1h。使用流式细胞仪(FACScan)检测细胞内DNA的含量。

2.结果

为了明确靶向GDNF基因启动子Ⅱ区不同顺式作用元件的dsRNA对胶质母细胞瘤细胞和正常星形胶质细胞增殖能力的影响，我们首先利用CCK8技术检测了感染Lenti-S和Lenti-E病毒72h后U251细胞和HA细胞的细胞活性。结果显示：慢病毒Lenti-S显著升高了U251细胞的细胞活性(P<0.05)；Lenti-E则显著降低了U251细胞的细胞活性(P<0.01)，但两者对HA细胞未见显著性影响(P>0.05)(图3A，B)。进一步的细胞周期检测发现，在U251细胞中，感染Lenti-E病毒显著升高G1期细胞比例(P<0.05)的同时，显著降低了S期细胞比例(P<0.05)，而感染Lenti-S病毒稍微升高了G2/M期的比例，但差异不显著(P>0.05)(图3C)。在HA细胞中，感染Lenti-E和Lenti-S均未显著影响细胞周期的运行(P>0.05)(图3D)。

实施例3

1.1划痕实验

利用靶向GDNF基因启动子II区的慢病毒感染处于对数生长期的U251细胞和HA细胞，72h后，接种于12孔板中继续培养，至汇合度大于95％。利用10μl无菌枪头对各孔细胞进行水平划线，PBS冲洗后，更换为新鲜的无血清DMEM培养基继续培养。在划痕后0、24和48h分别拍摄显微照片，并用Image-Pro Plus 6.0软件测量划痕宽度。

1.2 Transwell检测

利用靶向GDNF基因启动子II区的慢病毒感染处于对数生长期的U251细胞和HA细胞，72h后，接种于含新鲜的无血清DMEM培养基的transwell上室，下室里加入含10％FBS的DMEM培养基，孵育24h后，取出transwell小室，用棉签蘸取PBS擦去上室底壁细胞，再用200μl的无菌枪头吸取PBS轻轻吹洗上室底壁，将小室轻轻放入PBS中洗涤，放在室温下晾干。4％多聚甲醛固定30min后，结晶紫染液10min，倒置荧光显微镜下拍照记录。

2.结果

为了进一步明确靶向GDNF基因启动子Ⅱ区不同顺式作用元件的dsRNA对胶质母细胞瘤细胞浸润性生长的作用，我们利用划痕和Transwell技术检测了感染Lenti-S和Lenti-E慢病毒对U251细胞的侵袭和迁移能力的影响。结果显示：与NC组相比，感染Lenti-S病毒后显著促进了U251细胞的迁移(图4A,B)和侵袭能力(图4E,F)(P<0.01)，与添加50ng/ml GDNF的作用相似(图5)；而感染Lenti-E病毒后，显著降低了U251细胞的迁移(图4A,B)和侵袭能力(图4E,F)(P<0.05)。随后，利用Transwell技术检测了Lenti-S和Lenti-E对HA细胞迁移和侵袭能力的影响，结果显示感染Lenti-S和Lenti-E病毒后都未显著影响HA细胞的迁移(图4C,D)和侵袭能力(P>0.05)(图4G,H)。

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序列表

<110> 徐州医科大学

<120> 一种靶向GDNF基因启动子II区内增强子II的dsRNA及其应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gacuucagcc agcagauauu u 21

<210> 2

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaauaucugc uggcugaagu c 21

<210> 3

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agggcacguc acggagugag a 21

<210> 4

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ucucacuccg ugacgugccc u 21

<210> 5

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<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgcggcgucu ccgcgcucuc a 21

<210> 6

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<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ugagagcgcg gagacgccgc g 21

<210> 7

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<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ugacguggug ucucguucgg a 21

<210> 8

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<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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uccgaacgag acaccacguc a 21

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<212> RNA

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cagcagcauc agacaaacca g 21

<210> 10

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cugguuuguc ugaugcugcu g 21

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<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

caucagacaa accagucucg u 21

<210> 12

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

acgagacugg uuugucugau g 21

<210> 13

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

uucuccgaac gugucacguu u 21

<210> 14

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

acgugacacg uucggagaau u 21

<210> 15

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tgacttcagc cagcagatat ttctcgagaa atatctgctg gctgaagtct tttttc 56

<210> 16

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tcgagaaaaa agacttcagc cagcagatat ttctcgagaa atatctgctg gctgaagtca 60

<210> 17

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tcagcagcat cagacaaacc agctcgagct ggtttgtctg atgctgctgt tttttc 56

<210> 18

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tcgagaaaaa acagcagcat cagacaaacc agctcgagct ggtttgtctg atgctgctga 60

Claims

1.一种靶向GDNF基因启动子II区内增强子II的dsRNA，其特征在于正向序列如SEQ IDNO.1所示，反向序列如SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述的dsRNA在制备抑制星形胶质母细胞瘤的药物中的应用。

3.权利要求1所述的dsRNA在制备抑制星形胶质母细胞瘤迁移和侵袭的药物中的应用。

4.一种靶向GDNF基因启动子II区内增强子II的shRNA，其特征在于正义链序列如SEQID NO.15所示,反义链序列如SEQ ID NO.16所示。

5.权利要求4所述的shRNA在制备抑制星形胶质母细胞瘤的药物中的应用。

6.权利要求4所述的shRNA在制备抑制星形胶质母细胞瘤迁移和侵袭的药物中的应用。

7.一种慢病毒载体,其特征在于是将权利要求4所述的shRNA克隆至慢病毒pGCL-GFP载体所得。

8.权利要求7所述的慢病毒载体在制备抑制星形胶质母细胞瘤的药物中的应用。

9.权利要求7所述的慢病毒载体在制备抑制星形胶质母细胞瘤迁移和侵袭的药物中的应用。

10.一种重组慢病毒，其特征在于是由权利要求7所述的慢病毒载体包装所得。

11.权利要求10所述的重组慢病毒在制备抑制星形胶质母细胞瘤的药物中的应用。

12.权利要求10所述的重组慢病毒在制备抑制星形胶质母细胞瘤迁移和侵袭的药物中的应用。