KR101394538B1 - Ｔｇｆｂｉ 유전자 변이 각막이상증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 그의 스크리닝 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비타민 D3를 유효성분으로 포함하는 TGFBI 유전자 변이 각막이상증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 비타민 D 수용체(vitamin D receptor, VDR)를 통해 정상세포 및 GCD2 세포(바람직하게는, 각막 섬유아세포 또는 각막 상피세포)의 TGFBIp의 발현을 mRNA 또는 단백질 레벨에서 억제하여 세포내 축적된 변이 TGFBI 단백질의 축적을 효율적으로 예방 또는 억제할 수 있으므로 TGFBI 유전자 변이 각막이상증의 예방 및 치료에 매우 효과적이다.

Description

ＴＧＦＢＩ 유전자 변이 각막이상증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 그의 스크리닝 방법{Pharmaceutical Compositions for Preventing or Treating Corneal Dystrophies Associated with TGFBI Gene Mutation and Screening Methods Using the Same}

본 발명은 TGFBI 유전자 변이 각막이상증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 그의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

제2형 과립형 각막이상증(Granular Corneal dystrophy type 2, GCD2)은 형질전환 성장인자--유도된 유전자(transforming growth factor-beta-induced gene, TGFBI)의 돌연변이(아르기닌의 히스티딘으로의 돌연변이; R124H 돌연변이)를 유전시키는 상염색체 우성 질환이다. TGFBI 유전자는 축적된 단백질인, 과립형 침착(granular deposits) 내 히알린 및 격자형 침착(lattic deposits) 내 아밀로이드로 구성된 각막 침착(corneal deposits)의 주요 구성성분인 돌연변이 형질전환--유도된 유전자 단백질(TGFBIp)을 인코딩한다¹. 사람이 나이듦에 따라, 각막 침착은 시력(visual acuity)의 심각한 장애를 초래하고 PTK(phototherapeutic keratectomy), DALK(deep anterior lamellar keratoplasty) 및 PKP(penetrating keratoplasty)을 포함하는 많은 수술들²이 혼탁(opacity)을 해결하기 위해 개발되어 왔다. 하지만, 상술한 외과 과정들이 우수한 시력 교정을 달성하였을 지라도, GCD2는 유전 질환이기 때문에 각막은 결과적으로 수년 또는 수십년 후에 재발한다. 따라서, 이미 존재하는 각막 침착의 진행 및 새로이 형성된 각막 침착의 형성(synthesis)을 예방하기 위한 연구들은 상기 유전성 각막이상증들(corneal dystrophies)을 치료하기 위한 가장 중요한 단계이다.

비타민 D3는 지방-용해성 스테로이드 호르몬의 하나로, 주로 피부로부터 합성되고, 일부는 음식물로부터 섭취된다. 비타민 D3의 활성 형태인 1,25(OH)₂D₃(1,25-dihydroxyvitamin D3)는 인체 내에 대부분의 곳에서(ubiquitously) 존재하는 핵내 스테로이드 수용체인 비타민 D 수용체(vitamin D receptor, VDR)를 통해 생리학적 기능을 수행한다. 비타민 D3가 VDR에 결합한 후, VDR은 레티노이드-x 수용체-(RXR-)와 호모다이머 또는 헤테로 다이머를 형성하고 상기 복합체는 목표 유전자의 전사 레벨을 조절한다^{3 , 4}. 인간의 정상 눈에서 VDR에 대한 면역조직화학적 염색 분석을 통해, VDR이 모양체(ciliary body), 망막(retina), 수정체(lens) 뿐 아니라 각막 상피세포 및 각막 내피세포에서 정상적으로 발현된다는 것이 확인되었다⁵. 최근에, Yin 등은 비타민 D3 전구체인 25(OH)D3(25-hydrioxyvitamin D) 또는 1,25(OH)₂D₃, 그리고 상기 분자들의 전환 효소인 1-하이드록실라제를 가토 눈의 전방(anterior chamber)에서 동정하였음을 보고하였다⁶.

비타민 D3는 건강한 눈을 위해 다양한 기능을 수행한다. 비타민 D3는 슈도모나스 애루지노사가 콜로니화된 인간 각막상피세포에서 전-염증성 사이토카인인 인터루이킨(IL)-1, IL-6 및 IL-8의 레벨을 감소시켰으며⁷, 상피투과 저항성(transepithelial resistance)의 증가를 통한 상피 장벽 기능(epithelial barrier function)을 향상시켰다. 또한, 비타민 D3는 인간 각막상피세포에서 이눌린 투과성(inuline permeability)을 감소시켰고, 오클루딘(occludin) 레벨을 증가시켰다⁶. 생체 내 연구에서도, 비타민 D3는 각막 봉합(corneal suture)에 의해 유도된 랑게르한스 세포 이동의 감소⁸, 형질전환 쥐의 레티노블라스토마에서 신생혈관형성(anti-neovascularization) 억제 효과⁹ 및 노화된 (aged) 마우스에서 추체(cone)-매개 망막 기능의 향상된 효과¹⁰를 나타냈다. 하지만, TGFBI-관계된 각막이상증에 대한 비타민 D3의 잠재적인 치료 효과는 아직까지 확립되지 않았다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 유전성 난치성 질환인 TGFBI 유전자 변이 각막이상증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물의 개발을 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 비타민 D3를 투여한 경우, 비타민 D 수용체(vitamin D receptor, VDR)를 통해 정상세포 및 GCD2 세포(바람직하게는, 각막 섬유아세포 또는 각막 상피세포)의 TGFBIp의 발현을 mRNA 또는 단백질 레벨에서 억제하여 세포내 축적된 변이 TGFBI 단백질의 축적을 효율적으로 예방할 수 있다는 것을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 TGFBI 유전자 변이 각막이상증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 TGFBI 유전자 변이 각막이상증 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 비타민 D3를 유효성분으로 포함하는 TGFBI(TGF-β-induced gene) 유전자 변이 각막이상증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 유전성 난치성 질환인 TGFBI 유전자 변이 각막이상증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물의 개발을 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 비타민 D3를 투여한 경우, 비타민 D 수용체(vitamin D receptor, VDR)를 통해 정상세포 및 GCD2 세포(바람직하게는, 각막 섬유아세포 또는 각막 상피세포)의 TGFBIp의 발현을 mRNA 또는 단백질 레벨에서 억제하여 세포내 축적된 변이 TGFBI 단백질의 축적을 효율적으로 예방할 수 있다는 것을 발견하였다.

TGFBI 유전자는, 분비 신호 및 인테그린의 리간드 인식 부위로서 작용하는 Arg-Gly-Asp(RGD) 모티브를 포함하는 683개의 아미노산으로 구성된 단백질을 인코딩하는 유전자인데, 이 유전자에 변이가 생겨 변이 TGFBI 단백질이 생성되는 경우 다양한 타입의 각막이상증이 발병하게 된다. TGFBI 단백질은 인테그린과 상호작용하여 세포 부착 및 이동을 매개하는 세포 외 기질(ECM) 요소이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 TGFBI 유전자 변이 각막이상증은 변이 TGFBI 단백질이 각막에 축적되어 발생한다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 상기 TGFBI 유전자 변이로 인한 각막이상증은 유전자 변이 종류/위치에 따라 아벨리노(Avellino type) 각막이상증, 라이스-뷔클러(Reis-Bucklers type) 각막이상증, 격자(lattice type) 각막이상증, 과립(granular type) 각막이상증, 티엘-벵케(Thiel-Behnke type) 각막이상증, 상피기저막(epithelial basement membrane) 각막이상증 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 TGFBI 유전자 변이 각막이상증은 아벨리노(Avellino type) 각막이상증이다.

상술한 각막이상증들은 TGFBI 단백질의 아미노산 서열 중 변이가 생긴 위치에 따라 다양한 표현형을 나타내는 관계로 상기와 같이 분류된 것이지만, 단백질의 형태(conformation) 변화로 인해 변이 TGFBI 단백질이 정상적으로 분비 또는 분해되지 못하여 각막에 축적되어 발생하는 질병이라는 점에서 그 발병 원인이 동일하다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, TGFBI 유전자 변이 각막 이상증을 일으키는 상기 변이 TGFBI 단백질은 정상 TGFBI 단백질의 아미노산 서열과 비교하여 R124H, R124C, R555W, R555Q, I522N, N544S, M619K, F547S, A546D, V625D, G623D, V505D, P551Q, L558P, V624M, H626P, L173P, H572R, T538P, H572del, L527R, L569R, H626R, R124L, T125del, E126del 및 R124S로 선택되는 하나 이상의 아미노산 변이를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 아미노산 변이에 있어서, 상기 R124H는 정상 TGFBI 단백질을 구성하는 아미노산 중 124번째 아르기닌이 히스티딘으로 변이가 일어난 것을 의미하고, 상기 R124C는 124번째 아르기닌이 시스티딘으로 변이가 일어난 것을 말하며, 상기 R555W는 555번째 아르기닌이 트립토판으로 변이된 것을 말한다. 나머지도 상기 설명한 것과 동일한 규칙으로 각 아미노산의 변이를 나타낸다. 또한, 상기 H572del는 572번째 히스티딘이 결여된 것을, 상기 T125del는 125번째 트레오닌이 결여된 것을 의미한다. 상기 아미노산의 변이 이외에도 지금까지 총 38개의 다른 TGFBI 유전자 변이가 보고되고 있으며, 이들 모두는 변이 TGFBI 단백질이 각막에 축적되는 유전적 소인의 안과적 난치성 질환이라는 점에서 발병원인이 공통된다.

본 발명의 TGFBI 유전자 변이 각막이상증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 변이형 TGFBI 단백질의 발현을 전사 레벨(mRNA)에서 효과적으로 억제하여, 단백질 레벨도 효과적으로 억제함으로써 TGFBI 유전자 변이 각막이상증을 예방 또는 치료한다는 점에 그 특징이 있다. 따라서, 본 발명의 약제학적 조성물은, TGFBI 유전자 변이 각막이상증의 표현형 또는 유전자 내 변이가 발생한 위치를 불문하고, 변이형 TGFBI 단백질이 발현되고 각막에 축적되어 발병하는 것이라면 제한 없이 그 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있다. 마찬가지로, 지금까지 보고된 총 38개의 TGFBI 유전자 변이 이외에 장래에 보고될 새로운 TGFBI 유전자 변이로 인한 각막이상증이라고 하여도, 그것이 변이 TGFBI 단백질이 발현되고 각막에 축적되어 발병하는 것인 한, 본 발명의 대상 질병의 범위에 속한다고 할 것이다.

본 발명의 약제학적 조성물에서 유효성분으로 이용되는 비타민 D3는 전사 수준에서의 조절을 통하여 TGFBIp 발현을 억제하는 기능을 가진다. 본 발명자들은 비타민 D3가 정상세포 및 각막이상증 환자(바람직하게는, GCD2 환자)의 세포에서 TGFBIp의 발현을 mRNA 및 단백질 발현 레벨에서 효과적으로 억제한다는 것을 확인하였다(참고: 도 1).

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 비타민 D3는 돌연변이 형질전환--유도된 단백질(TGFBIp)의 발현을 mRNA 레벨 및 단백질 레벨에서 하향-조절(down-regulation)한다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물에 의한 TGFBIp의 하향-조절은 비타민 D 수용체(VDR)를 통해 이루어진다. 본 발명자들은 비타민 D3에 의한 TGFBIp의 하향-조절에 있어서 VDR의 존재가 필수적으로 필요하다는 사실을 발견하였다(참고: 도 3). VDR을 억제하는 경우(바람직하게는, VDR shRNA), 비타민 D3를 처리하여도 TGFBIp의 발현을 억제하지 못하였다. 따라서, 비타민 D3의 활성을 위해 VDR의 발현이 필수적으로 필요하며, 사람의 각막섬유아세포와 각막상피세포에는 VDR이 발현된다.

본 발명에서 용어 "shRNA(small hairpin RNA 또는 short hairpin RNA)"는 견고한 헤어핀 턴을 만드는 RNA의 서열을 나타내며, 이는 RNA 간섭을 통해 유전자 발현을 억제시키는 데 이용될 수 있다. 통상적으로, shRNA는 세포 도입용 벡터를 이용하며 shRNA를 발현할 수 있는 U6 프로모터를 주로 이용한다. 이러한 벡터는 항상 딸세포로 전달되어 유전자 사일런싱이 유전될 수 있도록 한다. shRNA 헤어핀 구조는 세포 내 기작(machinery)인 siRNA로 분해되어 RNA-유도 사일런싱 복합체(RNA-induced silencing complex)에 결합된다. 상술한 복합체는 이에 결합된 siRNA에 상응하는(matched) mRNA에 결합하여 분해시킨다. shRNA는 RNA 폴리머라제 III에 의해 전사되며, 포유동물 세포에서 shRNA 생산은 세포가 shRNA를 바이러스 공격으로 인식하여 방어 수단을 찾는 것처럼 인터페론 반응을 야기시킬 수도 있다. 또한, shRNA는 식물 및 다른 시스템에서도 이용될 수 있으며 U6 프로모터가 반드시 필요한 것은 아니다. 식물의 경우에는 매우 강력한 연속적인 발현 능력을 보유한 전통적인 프로모터인 CaMV(cauliflower mosaic virus) 35S 프로모터가 이용될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여 모두 가능하며, 비경구 투여는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등을 포함한다. 바람직하게는, 안구에 직접 본 발명의 약제학적 조성물을 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율, 병용되는 약물, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 비타민 D3를 기준으로 1일 당 0.0001 ng/kg(체중) 내지 10 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 TGFBI 유전자 변이 각막이상증 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다: (a) 각막세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및 (b) 세포 내 비타민 D 수용체(vitamin D receptor, VDR) 및 TGFBIp의 발현을 분석하는 단계, 상기 시험물질이 비타민 D 수용체를 통해 TGFBIp의 발현을 억제시키면 TGFBI 유전자 변이 각막이상증 예방 또는 치료제로 판단한다.

본 발명의 TGFBI 유전자 변이 각막 이상증 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법은 상술한 약제학적 조성물과 대상 질병을 공통으로 하기 때문에, 상기 약제학적 조성물과의 관계에서 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명자들은 TGFBIp의 발현을 억제하는 활성성분으로서, 비타민 D3가 비타민 D 수용체를 통해 TGFBI 유전자 변이 각막이상증의 각막 혼탁을 유발하는 주요 구성성분인 TGFBIp의 발현을 강력하게 억제한다는 사실을 최초로 밝혀내었다. 또한, 비타민 D3의 처리는 TGF- 시그널링에 중요한 Smad3의 인산화를 현저하게 억제하였는데(참고: 도 2 및 도 5), 이는 비타민 D3가 TGF- 신호 경로의 억제를 유도하여 TGFBIp의 발현을 감소시킨다는 것을 의미한다. 따라서, 비타민 D3가 TGFBI 유전자 변이 각막이상증 예방 또는 치료제의 후보물질로서의 가능성이 있으며, 이의 활성에 중요한 비타민 D 수용체를 통해 TGFBI 유전자 변이 각막이상증 예방 또는 치료제의 후보물질 스크리닝 방법으로의 적용 가능성을 제안한다.

본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 상기 단계 (b)는 비타민 D 수용체의 양 또는 활성(예를 들어, 비타민 D3와의 결합 친화도 증가)을 분석하고 이의 결과로서 TGFBIp의 발현을 분석하는 단계로, 세포 내 VDR의 양 또는 활성 분석은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 수행될 수 있으며, 예컨대 분광분석법, 색도분석법, MTT 분석법, 커플 분석법, 형광분석법, 열량측정법, 화학발광법, 웨스턴 블롯팅, 광산란법, 방사능 분석법 및 크로마토그래피 분석법 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 비타민 D3를 유효성분으로 포함하는 TGFBI 유전자 변이 각막이상증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

(b) 본 발명의 약제학적 조성물은 비타민 D 수용체(vitamin D receptor, VDR)를 통해 정상세포 및 GCD2 세포(바람직하게는, 각막 섬유아세포 또는 각막 상피세포)의 TGFBIp의 발현을 mRNA 및 단백질 레벨에서 억제하여 세포내 축적된 변이 TGFBI 단백질의 축적을 효율적으로 예방 또는 억제할 수 있으므로 TGFBI 유전자 변이 각막이상증의 예방 및 치료에 매우 효과적이다.

도 1은 정상 HCF 및 GCD2 HCF에서 형질전환 성장인자 β-유도된 유전자 단백질(TGFBIp)의 발현 상에 비타민 D3의 농도- 및 시간-의존적 억제 효과를 보여주는 결과이다. 세포에 비타민 D3를 지정된 농도로 12시간 동안 처리하거나(도 1A 및 도 1B) 또는 다양한 시간 동안 10^-7 M 또는 10^-8 M의 비타민 D3를 처리하였다(도 1C 및 도 1D). TGFBIp의 발현은 웨스턴 블랏팅으로 분석하였다. TGFBI mRNA 레벨은 RT-PCR로 분석하였다(도 1E). 결과들(평균값 ± SD)은 각 실험에서 3개의 독립적인 반복 실험들 중 대표적인 예이다. ^*대조군과 비교하여 p < 0.05; 및 ^**대조군과 비교하여 p < 0.01.
도 2는 정상 각막 섬유아세포에서 TGF-β-유도된 형질전환 성장인자 β-유도된 단백질(TGFBIp) 및 Smad3 인산화 상에 비타민 D3의 억제 효과를 보여주는 결과이다. 세포에 지정된 농도의 비타민 D3를 12시간 동안 전처리하고 이후 TGF-1(2 ng/ml)을 6시간 동안 처리하였다. TGFBIp의 발현 및 Smad3 인산화를 웨스턴 블랏팅으로 분석하였다. 결과들(평균값 ± SD)은 각 실험에서 3개의 독립적인 반복 실험들 중 대표적인 예이다(도 2B 및 도 2C). ^*TGF-β1과 비교하여 p < 0.05.
도 3은 비타민 D3가 비타민 D 수용체를 통해 TGFBIp의 발현을 억제한다는 것을 보여주는 결과이다. 도 3A는 정상 인간 각막 섬유아세포(HCF) 및 GCD2 HCF에서 비타민 D 수용체(VDR)의 공초점 현미경의 면역형광이미지를 보여준다. 세포가 고정된 후 항-VDR 항체로 면역염색되었다. 도 3B는 VDR 넉-다운이 비타민 D3-유도된 TGFBIp의 하향-조절을 약화시킨다는 것을 나타내는 결과이다. 도 3C는 VDR의 넉-다운을 확인한 결과이다. 정상 HCF에 VDR shRNA 및 shRNA 대조군을 트랜스펙션시켰다. 도 3D는 상기 형질전환된 세포에 비타민 D3를 12시간 동안 처리하거나 또는 처리하지 않고 반응시킨 후 TGFBIp의 발현을 조사한 결과이다. 결과들(평균값 ± SD)은 각 실험에서 3개의 독립적인 반복 실험들 중 대표적인 예이다(도 3D). ^*대조군과 비교하여 p < 0.05.
도 4는 비타민 D3가 세포 증식을 억제하지 않는다는 것을 보여주는 결과이다(각 실험 회수; n=3). 세포 증식 연구는 다양한 농도의 비타민 D3가 48시간 동안 처리된 인간 각막 섬유아세포주(HCF) 및 동형 제2형 과립형 각막이상증(GCD2) HCF에서 실시하였다. 세포 생존율은 대조군 시료의 세포 생존율에 대한 백분율로 표시된다. 모든 p값은 대조군과 비교하여 > 0.05였다.
도 5는 인간 각막 상피세포주에서 TGFBIp의 발현 상에 비타민 D3의 억제 효과를 보여주는 결과이다. 세포가 지정된 농도의 비타민 D3와 12시간 동안 반응되었으며(도 5A 및 도 5B), 비타민 D3는 TGFBIp의 발현을 농도-의존적으로 억제하였다(도 5C). TGFBI mRNA 레벨은 RT-PCR로 분석하였다. 도 5D, 세포에 지정된 농도의 비타민 D3를 12시간 동안 전처리한 후, TGF-β1(2 ng/ml)을 6시간 동안 처리하였다. TGFBIp의 발현 및 Smad3 인산화는 웨스턴 블랏팅으로 분석하였다. 결과들(평균값 ± SD)은 각 실험에서 3개의 독립적인 반복 실험들 중 대표적인 예이다(도 5B). ^*TGF-β1 단독과 비교하여 p < 0.05.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시 예

실험방법

시약

비타민 D3, 1α,25-디하이드록시비타민 D3(1,25(OH)₂D₃)는 Sigma-Aldrich(St Louis, MO)로부터 구매하여 100% 에탄올에 용해시켰다. 배지 내 에탄올의 최종 농도는 0.1%였으며, 0.1% 에탄올이 운반체 대조군(vehicle control)으로서 사용되었다. 비타민 D3 저장 용액은 80에 저장하고 사용 전에 다양한 농도(10^-11 M부터 10^-7 M까지)의 비타민 D3가 각 실험시에 매번 희석되었다. 재조합 TGF-β1은 R&D Systems(Minneapolis, MI)로부터 구매하였다.

세포주 및 배양

세포는 10% 우태아혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM(Dulbeccos modified Eagles medium)에서 95% 공기 및 5% CO₂를 포함하는 습도 유진된 배양기에서 37℃로 배양되었다. 인간 각막 섬유아세포주는 James V. Jester 박사(University of California, Irvine, CA)에 의해 제공되었다¹¹. SV40-불멸화된 인간 각막 상피세포주(HCE)¹²는 교토부립의과대학(Kyoto Prefectural University of Medicine; Kamigyo, Kyoto, Japan)의 Shigeru Kinoshita 박사에 의해 제공되었다. GCD2 동형접합자(homozygous) 각막 섬유아세포는 공지된 방법¹³을 이용하여 얻었다. 간략하게는, 각막이식술(keratoplasty)을 위한 각막 이식편(corneal button)의 제거 후 GCD2 환자의 원형절제된(trephined) 각막 이식편을 수거하여 초기 패시지 세포(패시지 2)가 세포주를 위해 구축되었다. GCD2 각막 섬유아세포주는 인간 텔로머라제(hTERT)의 활성 서브유니트를 인코딩하는 자가-불활성화된 렌티 바이러스 컨스트럭트(LVP105; GenTarget)를 이용하여 제조하였다. GCD2는 TGFBI 유전자의 R124H 돌연변이 확인용 DNA 분석을 통해 진단되었다. 공여자 비밀성(donor confidentiality)은 헬싱키 선언에 부합하도록 유지되었으며 본 연구의 수행은 연세대학교 세브란스 임상연구심의위원회(Severance Hospital IRB Committee (4-2010-0013), Yonsei University)에 의해 승인되었다.

렌티 바이러스 입자의 감염

제조사의 프로토콜에 따라 VDR shRNA(Cat. No. sc-106692-V; Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA) 또는 대조군 shRNA(Cat. No. sc-108065, Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA)을 타겟팅하는 shRNA을 발현하는 렌티 바이러스를 정상 각막 섬유아세포에 감염시켰다. 안정적인 세포주는 3 ㎍/ml의 퓨로마이신(Invitrogen, San Diego, CA)에 의해 선택되었으며 배지는 2일에 한번씩 신선하게 교체하였다. VDR의 감소(knockdown)는 웨스턴 블랏 분석을 통해 모니터링되었다.

단백질 추출 및 면역블롯팅 분석

세포는 50 mM Tris-HCl(pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% 데옥시콜레이트(deoxycholate) 및 0.1% SDS를 포함하는 RIPA 완충액(방사성면역침전어세이 완충액), 프로테아제 억제제 칵테일(Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail Tablet, Cat. no. 1836170; Roche, Indianapolis, IN) 및 포스파타제 억제제들(PhosSTOP, Cat. no. 04906845001; Roche, Indianapolis, IN)로 용해시켰다. 세포내 단백질을 4-12% Tris-글라이신 SDS 폴리아크릴아마이드 젤(Cat. No. KG75105; Komabiotech, Seoul, Korea)에서 전기영동시켜 PVDF(Immobilon polyvinylidine difluoride) 막(Millipore Corp., Bedford, MA)으로 옮겼다. 0.1% Tween-20을 포함하는 Tris-완충화된 염 용액(TBS-T) 내 5% 탈지유로 상온에서 1시간 동안 블랏킹시킨 후, TBS-T로 세 번에 걸쳐서 세척하고 단일클론 항-TGFBIp(1:300 희석; 김인산 교수, 경북대, 한국), β-액틴(1:5000 희석; Cat. No. A-5441; Sigma-Aldrich), Smad3 및 pSmad3(1:1000 희석; Cat. No. # 9312, # 9320; Cell Signaling Technology, Beverly, MA) 및 VDR(1:500 희석; Cat. No. C-20; Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA)와 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 이후 TBS-T로 세 번에 걸쳐서 세척한 후, HRP-컨쥬게이션된 2차 항체[항-마우스 IgG(1:5000 희석; Cat. No. NA931V) 또는 항-래빗 IgG(1:5000 희석; Cat. No. NA934V, Amersham Pharmacia Biotechnology, Piscataway, NJ)와 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 단백질 밴드들의 강도는 상응하는 β-액틴 단백질 밴드들에 대한 강도와 비교하여 정량하여 표준화시켰다.

역-전사 PCR ( Reverse - transcriptasepolymerase chain reaction ) 분석

총 RNA는 TRIZOL 시약(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)을 이용하여 정제하였다. mRNAs(2 )과 올리고-dT 프라이머를 이용하여 cDNA를 제조한 후, 2 ㎕의 합성된 cDNA가 PCR 반응을 위한 템플레이트로 이용되었다. 인간 TGFBI 및 -액틴을 증폭하기 위한 PCR 프라이머들이 이용되었다¹⁴.

DNA 증폭은 RT-PCR 시스템(2X FR premix, Biomedic Technologies, Seoul, Korea)을 이용하여 실시하였다. PCR은 다음과 같이 실시하였다: (a) 전변성 단계, 95℃에서 5분; (b) 30 사이클의 증폭 단계로, 한 사이클 당 (i) 변성 단계, 95℃에서 30초, (ii) 어닐링 단계, 57℃에서 30초 및 (iii) 연장 단계, 72℃에서 30초; 및 (c) 최종 연장 단계, 72℃에서 5분. RT-PCR 산물들은 EtBr(ethidium bromide)을 포함하는 1.0% 아가로오스 젤에서 전기영동되어 시각화시켰다.

면역형광 및 공초점 현미경

글래스 커버슬립에서 배양된 세포를 PBS로 10분 동안 세척하였다. 이후 세포를 투과화시켜 메탄올로 20에서 5분 동안 고정화시켰다. 고정된 세포를 PBS에 녹여진 10% 소혈청 알부민으로 30분 동안 블랏킹시킨 후, 블랏킹 완충액에 포함된 항-VDR 항체(1:200 희석; Cat. No. C-20; Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA)로 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. PBS로 세 번에 걸쳐서 세척한 후, 상기 세포를 Dylight-488(green)-표지된 항-래빗 IgG(1:200 희석; Vector Laboratories, Burlingame, CA)로 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, 세포를 PBS로 세 번에 걸쳐서 세척하고 Vectashield(Vector Laboratories, Burlingame, CA)로 마운팅시켰다. VDR 이미지는 Leica TCS SP5 공초점 현미경(Leica, Wetzlar, Germany)으로 얻었다.

세포생존율 어세이

세포 생존율(Cell viability)은 MTT 어세이로 측정하였다. 다양한 농도의 비타민 D3와 48시간 동안 반응시킨 후, 5 mg/ml MTT(thiazolyl blue tetrazolium bromide; Cat. No. M5655; Sigma-Aldrich) 저장 용액을 0.5 mg/ml의 농도가 되도록 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가되었다. 이후 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후, 세포는 100% DMSO(dimethyl sulfoxide)에 용해시켰다. ELISA 판독기(VERSAmax; Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 이용하여 570 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

통계 분석

통계 분석은 Graph Pad Prism version 4.0(Graph Pad Software Inc, San Diego, CA)로 실시하였다. 시료의 평균값들을 일원배치분산분석(one-way analysis of variance)으로 비교한 후 본페로니 다중비교분석(Bonferroni multiple comparison test)을 실시하였다. P값(< 0.05)이 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

실험결과

비타민 D3 는 각막 섬유아세포에서 TGFBI 단백질 및 mRNA 발현을 억제한다

비타민 D3가 TGFBI 단백질 발현에 어떠한 영향을 미치는 지 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 비타민 D3 처리된 정상인 섬유아세포 및 GCD2 섬유아세포로부터 얻어진 세포 용해물을 이용하여 웨스턴 블랏 분석을 실시하였다. 비타민 D3는 농도-의존적(도 1A 및 도 1B) 및 시간-의존적(도 1C 및 도 1D)으로 TGFBIp의 발현을 감소시켰다. 다음으로, 본 발명자들은 비타민 D3의 상기 억제 효과가 TGFBI mRNA 발현 상에 어떠한 영향을 미치는 지 조사하였다. RT-PCR 분석 결과, 본 발명자들은 비타민 D3의 12시간 처리는 농도-의존적으로 TGFBI mRNA 발현을 감소시킨다는 것을 확인하였다(도 1E). 상술한 결과들은 비타민 D3의 억제 효과가 전사 레벨에서 기능한다는 것을 의미한다.

각막 섬유아세포에서 TGF -1-유도된 TGFBIp 발현 및 Smad3 인산화에 대한 비타민 D3 의 억제 효과

본 발명자들은 이전에 TGF-β 처리된 정상 1차 인간 각막 섬유아세포에서 TGFBIp 발현을 상향-조절시킨다는 것을 보고¹⁴하였기 때문에, HCF 세포에 TGF-β1(2 ng/ml)의 6시간 처리는 대조군과 비교하여 TGFBIp의 발현을 현저하게 증가시켰으며, 비타민 D3의 12시간 전처리는 상기 증가 효과를 농도-의존적으로 차단하였다(도 2A 및 도 2B; 10^-7 M 처리구에서 최대 억제 효과를 나타냄).

TGFBIp는 Smad 시그널링 경로 내 다운스트림 조절자의 인산화를 통해 생물학적 기능을 나타내기 때문에¹⁵, 본 발명자들은 6시간 동안 TGF-β1(2 ng/ml)-처리된 정상 HCF 세포에서 Smad3의 인산화를 측정하였다. 웨스턴 블랏 분석 결과, Smad3 인산화는 TGF-1 처리에 의해 현저하게 유도되었다(도 2C). 한편, 비타민 D3의 12시간 전처리는 총 Smad3 레벨의 변화 없이 Smad3 인산화를 농도-의존적으로 차단하였다(도 2A 및 도 2C).

비타민 D 수용체는 각막 섬유아세포에 존재하고 비타민 D3 는 비타민 D 수용체를 통해 TGFBIp 의 발현을 하향-조절한다

각막 기질(corneal stroma)에 VDR의 존재 여부에 대한 어떠한 보고도 없었기 때문에, 본 발명자들은 면역세포화학 염색을 이용하여 VDR이 정상 HCF에 존재하는 지 여부를 우선적으로 조사하였다. 공초점 현미경 이미지들을 분석한 결과, 본 발명자들은 VDR이 정상 및 GCD2 HCF에서 정상적으로 발현한다는 것을 확인하였다(도 3A). 다음으로, 본 발명자들은 VDR이 비타민 D3의 억제 효과에 필요한지 여부를 조사하였다. 본 발명자들은 VDR에 대한 shRNA(ShVDR) 및 대조군 ShRNA에 대한 바이러스 발현 컨스트럭트로 HCF 세포를 감염시킨 후, 상기 세포에 10^-7 M 비타민 D3를 12시간 동안 처리하여 VDR 및 TGFBIp의 발현을 비교하였다. 웨스턴 블랏 분석을 통해, ShVDR 감염이 임의적 올리고를 발현하는 바이러스로 감염된 세포에서 보여지는 VDR 단백질 레벨과 비교하여 VDR 단백질 레벨을 감소시킨다는 것을 확인하였다(도 3B 및 도 3C). 비타민 D3를 처리했을 때, VDR 넉-다운 세포에서는 정상 HCF 세포에 처리된 경우와 비교하여 비타민 D3에 의한 TGFBIp의 감소 효과가 약화되었음을 확인하였다(도 3D). 상술한 결과들은 비타민 D3의 억제 효과가 VDR을 통해 이루어진다는 것을 의미한다.

비타민 D3 는 각막 섬유아세포의 세포 증식에 영향을 미치지 않는다

비타민 D3는 다양한 암세포에서 보고된 바와 같이 강력한 세포증식 억제제로 알려져 있기 때문에^{16 -18}, 본 발명자들은 정상 HCF 및 GCD2 HCF세포에서의 상기 억제 효과가 비타민 D3의 항-증식 효과에 의한 결과인지 여부를 조사하였다. 각기 다른 농도의 비타민 D3(10^-11 M부터 10^-6 M까지)과 48시간 동안 반응시킨 결과, 정상 HCF 및 GCD2 HCF 세포의 생존율은 전혀 변화가 없었다(도 4). 동일한 농도의 비타민 D3의 보다 짧은 반응시간(6시간 및 12시간)에도 세포 증식은 유의한 차이를 나타내지 않았다(결과를 보이지 않음). 또한, 비타민 D3의 48시간 처리 후 각 세포의 형태는 최대 농도의 처리구(10^-7 M)에서 조차 대조군과 비교하여 변함이 없었다(결과를 보이지 않음). 종합해 보면, 비타민 D3의 억제 효과는 세포 증식의 억제로부터 초래되지 않아 상기 결과들은 TGFBI-변이 각막이상증의 치료 시의 비타민 D3가 세포 독성 없이 치료할 수 있는 가능성을 내포한다.

비타민 D3 는 인간 각막 상피세포의 TGFBI 단백질 및 mRNA 의 발현도 억제한다

TGFBIp는 각막 상피세포 또는 섬유아세포에서 기원하며, 아직까지는 TGFBIp의 주요 기원이 어느 세포인지가 불명확하기 때문에^{19 -21}, 본 발명자들은 비타민 D3가 인간 각막 상피세포에서도 TGFBIp 발현에 영향을 미치는 지 여부를 조사하였다. 다양한 농도의 비타민 D3의 12시간 처리 후 TGFBIp 및 mRNA 발현을 조사한 결과, 비타민 D3는 각막 상피세포에서 TGFBI의 mRNA 및 단백질 레벨도 농도-의존적으로 감소시켰다(도 5A 내지 도 5C). 또한, HCF 세포의 결과와 동일하게도 비타민 D3는 TGF-β-유도된 TGFBIp 및 Smad3 인산화를 농도-의존적으로 감소시켰다(도 5D). 비타민 D3의 6시간, 12시간 및 48시간 처리에 따른 세포 증식은 대조군의 세포 증식과 비교하여 유의한 차이를 나타내지 않았다(결과를 보이지 않음). 상술한 결과들은 비타민 D3가 각막 섬유아세포 뿐 아니라 각막 상피세포에서 TGFBI mRNA 및 단백질 레벨 모두를 억제한다는 것을 의미한다.

추가논의사항

외과적인 수술이 각막 혼탁(corneal opacity)의 재발을 방지할 수는 없기 때문에, GCD2를 포함하는 유전성 TGFBI-변이 각막이상증의 치료에는 예방적인 치료방법을 강구하는 것이 매우 중요하다. 본 발명자들은 비타민 D3가 정상 HCF 세포 및 상피세포 뿐 아니라 GCD2 HCF 세포에서 TGFBI 단백질 또는 mRNA의 발현을 억제한다는 것을 관찰하였다. 본 발명자들은 VDR이 정상 및 GCD2 HCF 세포에서 정상적으로 발현되고 비타민 D3의 억제 효과가 VDR을 통해 이루어진다는 것을 최초로 증명하였다. 비타민 D3가 TGF--유도된 TGFBIp 및 Smad3 인산화를 억제하기 때문에, 본 연구는 비타민 D3의 억제 효과가 정상 HCF 세포 및 상피세포에서 TGF-β 시그널링에 영향을 미침으로써 이루어진다는 것을 증명하였다.

비타민 D3는 칼슘 및 뼈 항상성(bone homeostasis)을 유지하는 전통적인 기능²⁴ 외에도 연골세포 성장(cartilage chondrocyte growth)의 조절²², 피부의 각질세포의 성장 및 분화 조절²³을 포함하는 다양한 생물학적 기능을 수행한다. 또한, 여러 연구에서 비타민 D3가 단독 또는 다른 화학요법제(chemotherapy agents)와의 조합(conjunction) 처리를 통해 전립선암, 유방암 및 대장암을 포함하는 다양한 암에서 항암 효과를 나타낸다는 것을 보고하고 있다. 상술한 효과들은 세포 주기에서 초기 복제 단계인 G0/1기 어레스트에 의한 종양세포 증식의 억제를 통해 나타났다^{25 -27}. 조혈계 암(hematopoietic cancers)에서, 비타민 D3는 종래의 화학요법제에 잘 반응하지 않는 미성숙 종양세포를 분화시킴으로써 보조요법(adjuvant therapy)으로서의 가능성을 보여줬다^{28 , 29}. 하지만, MTT 어세이에서 세포 증식률이 가장 높은 처리 농도(10^-6 M)의 비타민 D3에서 조차 90% 이상이었기 때문에, 본 발명자들의 연구에서 비타민 D3의 TGFBIp 발현 억제 효과는 비타민 D3가 세포 증식 중지를 유도하기 때문이 아니었다. 그리고 가장 높은 처리 농도(10^-7 M)의 비타민 D3 처리 후 에도 세포의 형태적인 변화들이 전혀 관찰되지 않았다(결과를 보이지 않음). 상술한 결과들은 비타민 D3의 TGFBIp 발현 억제 효과는 비타민 D3의 항-증식 또는 분화 유도 효과, 세포 독성으로부터 야기된 것이 아니라는 것을 의미한다.

TGFBIp는 세포 증식, 분화 및 세포외 매트릭스 리모델링을 포함하는 다양한 정상 생리학적 기능들을 조절하는 분비성 세포외 매트릭스 단백질이다³⁰. TGFBIp의 발현 저하는 여러 암의 발생과 관련되어 있는 반면에^{31 , 32}, TGFBIp의 과다발현은 Alb-high3 트랜스제닉 마우스 모델에서 각막 혼탁을 유도하였다³³. GCD2 및 다른 TGFBI-연관 각막이상증에서 보여지는 각막 침착은 많은 단백질들의 비정상적 응집 복합체로, 주요 구성성분(compartment)은 돌연변이 TGFBIp이다³⁴. 따라서, TGFBIp 발현을 담당하는 TGF-β 시그널링 경로의 억제는 돌연변이 TGFBIp의 생산을 감소시키는 효과적인 방법일 것이다.

Smad 단백질을 통한 TGF-β 시그널링 트랜스덕션 경로의 기작은 잘 알려져 있다^{3 5 , 36}. TGF-β는 제I형 및 제II형 막통과(transmembrane) 세린/트레오닌 수용체들의 어셈블리를 유도하고, 이후 제II형 키나제가 제I형 수용체를 인산화시킨다. 타이로신 키나제 I은 세포내(intracellular) Smad2 및 Smad3을 인산화시키고 세포질에서 핵으로의 이동(translocation) 후에 서로 어셈블리된다. 이후, Smad4와 복합체를 형성하여 TGFBI 또는 타겟 유전자에 결합하여 유전자 발현을 조절한다. Smad3 인산화는 TGF-β 처리에 의해 현저하게 증가되고 Smad3 인산화의 증가는 각막 섬유아세포 및 상피세포 모두에서 비타민 D3 처리에 의해 농도-의존적으로 억제되었다(도 2A, 도 2C 및 도 5D). 상술한 결과들은 인간 자궁 근종(uterine leiomyoma) 세포에서 보고된 이전의 결과들³⁷과 유사하다. 비타민 D3는 인간 자궁 근종의 섬유화와 관계되어 있는 파이브로넥틴, 제1형 콜라겐 및 플라스미노겐 활성인자 억제제-1의 발현을 농도-의존적으로 억제하였고 비타민 D3는 TGF-3-유도된 Smad2 및 Smad3의 핵 내 이동, Smad2의 인산화 및 Smad4 복합체의 형성을 억제하였다. Smad 시그널링 경로는 TGF-β 시그널링 경로의 중요한 전달인자(transductor)이기 때문에, 본 발명자들의 결과는 각막 침착 형성과 관련된 TGF-β-유도된 전사 활성의 조절 상에 비타민 D3가 중요한 기능을 함을 확인시켜 주었다.

면역세포화학 염색 및 웨스턴 블롯 분석 결과는 VDR이 정상 및 GCD2 HCF 세포의 핵에서 정상적으로 발현된다는 것을 보여줬다(도 3A 및 도 3B). 비타민 D3가 몇몇 세포에서 VDR-독립적 경로를 통해 기능한다는 몇몇 보고가 있었으나^{18 , 38}, 비타민 D3는 주로 VDR을 통해 생리학적 기능을 수행한다. 본 발명자들은 VDR 넉-다운 세포를 이용하여, 비타민 D3이 인간 각막 섬유아세포에서 VDR을 통해 TGF-β 시그널링 경로에 영향을 줌을 확인하였다.

전방에서 비타민 D3의 활성 농도는 래빗 눈에서 유리체강(vitreous cavity)의 농도보다 더 낮다⁶. 래빗은 유의한 양의 자외선에 노출되지 않기 때문에 저자들은 대부분의 비타민 D3가 피부로부터 합성되는 것이 아니라 섭취로부터 얻어져 혈관으로부터 특정 트랜스포터에 의해 확산 또는 전달된다고 추론하였다. 아직까지 인간 눈에서 비타민 D3의 소스가 알려지지는 않았지만, 이전 연구 및 본 발명자들의 결과는 비타민 D3의 사용이 GCD2 환자 및 TGFBI-연관 각막이상증 환자에서 TGFBIp의 생산을 예방하기 위한 치료 형태로서의 가능성을 가진다는 것을 보여준다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명 의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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38. Brown AJ, Dusso A, Slatopolsky E. Vitamin D. The American journal of physiology. Aug 1999;277(2 Pt 2):F157-175.

Claims (8)

1. 비타민 D3를 유효성분으로 포함하는 아벨리노(Avellino type) 각막이상증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로, 상기 비타민 D3의 농도는 10^-7 M 이하의 범위인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 비타민 D3는 돌연변이 형질전환-β-유도된 유전자 단백질(TGFBIp)의 발현을 mRNA 레벨 또는 단백질 레벨에서 하향-조절(down-regulation)하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
3. 제 2 항에 있어서, 상기 하향-조절은 비타민 D 수용체(VDR)를 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 아벨리노 각막이상증은 변이 TGFBI 단백질이 각막에 축적되어 발생하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
5. 삭제
6. 다음의 단계를 포함하는 아벨리노 각막이상증 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법:
   (a) 각막세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및
   (b) 세포 내 비타민 D 수용체(vitamin D receptor, VDR) 및 TGFBIp의 발현을 분석하는 단계, 상기 시험물질이 비타민 D 수용체를 통해 TGFBIp의 발현을 억제시키면 아벨리노 각막이상증 예방 또는 치료제로 판단한다.
   
7. 제 6 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서 TGFBIp의 발현은 mRNA 레벨 또는 단백질 레벨에서 하향-조절(down-regulation)하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
   
8. 삭제

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