KR20200111384A - 파노비노스테트를 포함하는 모야모야병 치료용 약학 조성물 - Google Patents

파노비노스테트를 포함하는 모야모야병 치료용 약학 조성물 Download PDF

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KR20200111384A
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Abstract

본원은 파노비노스테트를 유효성분으로 포함하는 모야모야병 치료용 약학조성물을 개시한다. 본원에 따른 조성물은 모야모야병 환자의 ECFC의 세포사멸은 유발하지 않으면서, ECFC에서 발견되는 신생혈관생성능의 감소를 회복 또는 촉진을 가져와 모야모야병 치료제로서 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

파노비노스테트를 포함하는 모야모야병 치료용 약학 조성물 {Pharmaceutical composition comprising Panobinostat for treating moyamoya disease}
모야모야병의 치료제 관련된 기술분야이다.
모야모야병(Moyamoya disease, MMD)은 양측 두개내 동맥에 특발성으로 진행성 폐쇄가 일어나는 뇌혈관 장애로서, 특별한 원인 없이 대뇌에 혈액을 공급하는 내경동맥의 말단부나 그 분지부위에 협착과 폐색이 일어나고 뇌기저부에 이상 혈관들이 관찰되는 만성 뇌혈관 질환을 일컫는 것으로 소아 뇌졸중의 가장 흔한 원인이다. 어린이의 경우 주로 반복적인 일과성 뇌허혈 발작의 형태로 나타나고, 성인에서는 뇌출혈이 흔히 나타난다. 모야모야병은 대부분 소아기에 발생하여 발달 과정에 있는 소아의 뇌에 지속적이며 심각한 손상을 야기하여, 지능저하, 인지기능저하 및 정서적 발달에 악영향을 미친다. 따라서 장기적인 학업과 사회생활에 장애를 초래한다.
현재 모야모야병의 치료는 수술을 통한 재관류(revasculization), 항혈소판제의 사용, 아세틸살리실산이 사용되고 있으나, 효과적인 치료결과는 보고되지 않았다(Tackeun Kim et al., Moyamoya Disease: Treatment and Outcomes, J Stroke. 2016 Jan; 18(1): 21-30).
모야모야병의 병리는 자세하게 알려지지는 않았으나, 혈관내피집락형성세포(Endothelial Colony Forming Cell, ECFC)의 세포 수와 이의 혈관생성능력이 감소된 것으로 나타났다(J.H. Kim, et al, Decreased level and defective function of circulating endothelial progenitor cells in children with moyamoya disease, J Neurosci Res, 88 (2010) 510-518; J.Y. Lee, et al.,, Deregulation of Retinaldehyde Dehydrogenase 2 Leads to Defective Angiogenic Function of Endothelial Colony-Forming Cells in Pediatric Moyamoya Disease, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 35 (2015) 1670-1677.).
파노비노스테트는 기존에 다발성골수종을 포함하는 암에 대한 세포사멸을 유발하는 항암제로서 공지(대한민국 공개특허 2017-0118798)되어 있으니, 이의 모야모야병과의 관련성은 알려지지 않았다.
따라서 혈관내피집락형성세포(Endothelial Colony Forming Cell, ECFC)의 기능을 회복시킬 수 있는 약물의 개발을 통한 근본적 치료제의 개발이 필요하다.
본원은 모야모야병 환자에서 발견되는 혈관내피집락형성세포(Endothelial Colony Forming Cell, ECFC)의 신생혈관생성능의 회복이 가능한 모야모야병의 근본적인 치료제를 개발하고자 한다.
한 양태에서 본원은 파노비노스테트(Panobinostat) 또는 그 약학적으로 허용가능한 그 염을 포함하는 모야모야병 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본원에 따른 조성물은 모야모야병 환자의 혈관내피집락형성세포(Endothelial Colony Forming Cell, ECFC)의 세포사멸은 유발하지 않으면서 상기 세포의 혈관신생능을 회복시키는 것인, 모야모야병 치료의 근본적 치료제가 될 수 있다.
다른 양태에서 본원은 또한 파노비노스테트 또는 그 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 모야모야병의 혈관내피집락형성세포의 혈관신생 회복 또는 촉진용 약학 조성물을 제공한다.
일 구현예에서 상기 혈관내피집락형성세포는 파노비노스테트 또는 그 약학적으로 허용가능한 염은 혈관내피집락형성세포의 사멸은 유발하지 않으면서 상기 세포의 혈관신생능을 회복시키는 농도 최대 6nM의 농도로 처리될 수 있다.
일 구현예에서는 상기 혈관내피집락형성세포는 4nM 내지 6nM의 농도로 처리된다.
다른 양태에서 본원은 인비트로에서 혈관내피집락형성세포에 파노비노스테트를 처리하는 단계를 포함하는, 인비트로 또는 인간을 제외한 동물에서 ECFC 혈관신생능 촉진 방법을 제공한다.
일 구현예에서 상기 ECFC는 모야모야병 환자 유래이고, 상기 파노비노스테트는 4 내지 6nM의 농도로 처리되며, 혈관내피집락형성세포의 사멸은 유발하지 않으면서 상기 세포의 혈관신생능을 회복시킬 수 있다.
본원에 따른 파노비노스테트를 포함하는 모야모야병 치료용 약학조성물은 모야모야병 환자에서 발견되는 ECFC 세포의 신생혈관생성능의 결함의 회복을 통해 모야모야병의 근본적인 치료제로서 효과적으로 사용될 수 있다. 특히 본원에서는 모야모야병 유래의 ECFC에 처리 또는 투여되는 경우, ECFC의 세포사멸은 유도하지 않으면서 ECFC 세포의 원래 활성인 신생혈관생성능을 증가시키는 효과를 나타낸다(본원 도 1 등 참조).
도 1은 정상 및 MMD ECFCs에서 panobinostat의 용량 반응 평가결과이다. 세포 생존율은 panobinostat (0-100nM)의 다양한 농도를 사용하여 48시간과 72시간에 측정되었다. 그래프는 panobinostat농도가 증가함에 따라 ECFCs의 세포 생존율이 감소함을 나타내고 있다. Panobinostat의 IC10과 IC50의 값은 정상 ECFCs에서는 42.5 ± 4.17과 9.8 ± 7.07nM이었고, MMD ECFCs에서는 63.9 ± 28.18과 9.5 ± 3.72nM이었다. 이러한 결과는 모야모야 ECFC의 경우 세포사멸에 더 높은 농도가 필요하기 때문에, 세포사멸없이도 혈관신생능을 획복시킬 수 있음을 나타낸다.
도 2는 Panobinosatat은 H3와 H4의 아세틸화 수준과 ECFCs에서 RALDH2의 발현을 상향 조절하는 결과를 나타낸다. (A) 대표 western blot을 보여줌. (B) Ac-H3의 상향 조절은 정상 ECFCs에서 8nM panobinostat 및 MMD ECFCs에서 6nM 및 8nM에서 관찰된다. (C) Ac-H4는 6nM panobinostat 치료 후 정상 및 MMD ECFCs에서 상향 조절되었다. (D) 정상적인 ECFC에서 RALDH2 유전자 발현에 유의한 변화는 관찰되지 않았지만, panobinostat의 투여 량을 4, 6 및 8nM으로 증가시키면 MMD ECFCs에서 RALDH2 유전자 발현이 증가한다. * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001.
도 3은 Panobinostat은 MMD ECFCs의 RALDH promoter region 1과 2에서 Ac-H3 결합을 상승시키는 결과를 나타낸다. (A) 정상 ECFCs에서 AC-H3와 RALDH2 region 1사이의 연관성은 유의하지 않았지만 6nM panobinostat 처리로 RALDH2 region 2에서 증가된 패턴이 관찰되었다. (B) MMD ECFCs에서 RALDH region 1과 2에서 Ac-H3가 증가되는 패턴은 panobinostat 처리에 의존적이었다.
도 4는 Panobinostat은 체외에서 MMD ECFCs의 혈관형성능력을 회복시키는 결과를 나타낸다. (A) Panobinostat 처리 후 정상 및 MMD ECFCs의 tube 형성 변화를 보여주는 대표 사진이다. (B) 정상 ECFCs에서 panobinostat 4와 6nM에서 tube 형성 증가가 관찰되었지만 2와 8nM panobinostat 처리에서는 차이가 없었다. 이는 MMD ECFCs tuble 형성 능력이 증가되는 panobinostat 용량에서, 정상 ECFCs가 MMD ECFC보다 panobinostat에 tuble 형성에 있어서 덜 민감하게 작용하는 것을 나타내며, 추가적으로 정상 ECFCs에 tuble 형성이 줄어드는 부작용이 없음을 나타낸다. MMD ECFCs에서 panobinostat의 모든 처리 농도에서 tube 형성이 증가하는 것이 관찰되었고 최대 tube 형성은 6nM 처리에서 확인되었다. MMD ECFCs에 대한 평균 IC10이 9.5 ± 3.72 nM인데 이보다 더 낮은 투여량에서 (즉, 더 안전한 투여량, 세포 사멸이 거의 없는 투여량) tube 형성 능력이 향상되는 것을 확인한 결과로 안전성을 증명하는 것이다. * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001.
도 5는 Panobinostat은 생체 내에서 MMD ECFCs의 혈관 형성 기능을 회복시키는 결과를 나타낸다. 대표로 보여주는 사진은 panobinostat 처리 또는 처리하지 않은 그룹에서 정상 및 MMD ECFCs를 넣어준 matrigel plug를 공초점 현미경으로 관찰한 사진임. (A) 인간 핵 (녹색)과 CD31 (적색) 양성세포가 panobinostat 처리 후에 정상 ECFCs에서는 큰 변화가 없었다 (p = 0.5373). (B) MMD ECFCs에서는 panobinostat 처리 후에 양성세포의 수가 확연하게 증가하는 것이 관찰되었다 (p <0.0001). 면역형과법. 스케일 바: 100μm. 핵은 DAPI (청색)로 대조 염색하였다. * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001.
본원은 파노비노스테트(Panobistat)가 모야모야병 혈관내피집락형성세포(Endothelial Colony Forming Cell, ECFC)의 혈관신생능력을 향상시켜 MMD의 치료에 효과적으로 사용될 수 있다는 발견에 근거한 것이다. 특히 ECFC의 세포사멸은 유발하지 않으면서, 혈관신생능력은 향상시켜 근본적 치료가 가능하다.
이에 한 양태에서 본원은 파노비노스테트 또는 약학적으로 허용가능한 그 염을 포함하는 혈관내피집락형성세포의 혈관 신생 능력 향상을 통한, 모야모야병 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
모야모야병(Moyamoya disease, MMD)은, 양측 두개내 동맥에 특발성으로 진행성 폐쇄가 일어나는 뇌혈관 장애로서, 특별한 원인 없이 대뇌에 혈액을 공급하는 내경동맥의 말단부나 그 분지부위에 협착과 폐색이 일어나고 뇌기저부에 이상 혈관들이 관찰되는 만성 뇌혈관 질환을 말한다. 모야모야병의 병리는 자세하게 알려지지는 않았으나, 혈관내피집락형성세포(Endothelial Colony Forming Cell, ECFC)의 세포 수와 이의 혈관생성능력이 감소된 것으로 나타났다(J.H. Kim, et al, Decreased level and defective function of circulating endothelial progenitor cells in children with moyamoya disease, J Neurosci Res, 88 (2010) 510-518; J.Y. Lee, et al.,, Deregulation of Retinaldehyde Dehydrogenase 2 Leads to Defective Angiogenic Function of Endothelial Colony-Forming Cells in Pediatric Moyamoya Disease, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 35 (2015) 1670-1677.).
본원에 따른 조성물은 상기와 같은 활성이 저하된 MMD 환자의 ECFC의 혈관생성 능력을 회복시켜 모야모야병의 근본적인 치료를 가능하게 한다.
본원에 따른 조성물에 포함되는 파노비노스테트{(2E)-N-hydroxy-3-[4-({[2-(2-methyl-1H-indol-3-yl)ethyl]amino}methyl)phenyl]acrylamide}는 기존에 항암제로서 사용되는 약물로서 세포 사멸의 유도가 목적이나, 하지만, 본원에서는 모야모야병 유래의 ECFC에 처리 또는 투여되는 경우, ECFC의 세포사멸은 유도하지 않으면서 ECFC 세포의 원래 활성인 신생혈관생성능을 증가시키는 효과를 나타낸다(본원 도 1 등 참조).
이런 측면에서 본원은 또한 파노비노스테트 또는 그 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 모야모야병 환자의 ECFC의 혈관신생 회복 또는 촉진용 약학 조성물에 관한 것이다. 본원에서 회복 또는 촉진은 감소된 혈관신생능을 증가시킨다는 의미에서 서로 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 “치료”란 질환, 또는 질환으로 인한 증상 또는 상태의 억제, 제거, 경감, 완화, 개선, 및/또는 예방을 포함하는 개념이다.
본원의 조성물은 상기 언급한 유효성분이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 또는 유효성분의 용해성 및/또는 흡수성을 유지/증가시키는 화합물을 추가로 함유할 수 있다. 또한 본원의 치료제는 모야모야병의 치료 또는 예방을 위하여 단독으로, 또는 수술, 약물치료 및 생물학적반응조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본원에서 “약학적으로 허용되는”은 화합물의 생물학적 활성과 물성을 손상시키지 않는 성질을 의미한다.
본원에 따른 화합물의 약학적으로 혀용가능한 염, 또는 그 용매화물은 유기화학분야에서 통상의 지식을 가진 자가 당해 기술 분야에 공지된 지식을 이용하여 적절히 제조하거나 선택할 수 있다.
염은 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여시 통상적인 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말한다. 상기 염으로는 유기 또는 무기염이 가능하며, 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 당해 기술분야에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다. 또한 상기 염으로는 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 사용될 수 있다. 상기 유리산은 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탄산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한, 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.
본원에 따른 일 구현예에서 약학적으로 허용 가능한 염은 유효성분의 화합물이 유리산과 함께 염을 형성하는 산부가염으로 존재할 수 있다. 또한, 본원에 따른 상기 화학식 I의 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 수화물, 용매화물을 모두 포함할 수 있다.
상기 유효성분의 화합물은 화합물 내의 암모늄 양이온과 짝을 이루는 음이온에 의해 안정화 될 수 있으며, 상기 음이온은 약제학적으로 허용되면서 암모늄 양이온과 함께 짝을 이룰 수 있는 임의의 음이온일 수 있으며, 예를 들어 요오다이드(I-), 설포네이트(SO3 2-), 클로라이드(Cl-) 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본원의 조성물은 상기 언급한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제형화할 수 있다.
본원의 조성물의 투여방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니며, 공지된 투여방법을 적용할 수 있으며, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여의 경우 피부에 붙이는 패치형, 코/호흡기를 통해 투여할 수 있으며, 신속한 치료효과를 얻기 위해서는 정맥내 주사에 의한 투여가 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여 시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 매우 다양할 수 있다. 전형적인 약물의 경우 투약단위체는, 예를 들어 약 0.01 mg 내지 100 mg를 포함하나 상기 범위의 이하 및 이상의 범위를 배제하는 것은 아니다.
본원의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. “약학적 또는 치료적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 특히, 모야모야 병 유래의 ECFC의 세포사멸은 초래하지 않으면서 혈관신생 능만을 촉진시킬 수 있는 농도로 투여된다.
구체적으로, 본 발명에 따른 화합물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1㎏당 0.001ug 내지 100mg, 바람직하게는 0.01ug 내지 10mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
기타 본 명세서에서 사용된 용어와 약어들은 달리 정의되지 않는 한 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 통상적으로 이해되는 의미로서 해석될 수 있다.
다른 양태에서 본원은 인비트로 또는 동물모델을 포함한 인비보에서 ECFC에 파노비노스테트 또는 파노비노스테트 포함하는 조성물을 상기 세포에 처리하는 단계를 포함하는, ECFC 혈관신생능 촉진 또는 회복 방법에 관한 것이다.
본원에 따른 방법에 사용되는 유효성분 및 ECFC 혈관신생능 촉진 또는 회복 능에 관해서는 앞서 기술한 바를 참조할 수 있다.
일 구현예에서는 파노비노스테트는 ECFC의 세포사멸은 유발하지 않으면서 혈관신생 능을 향상시킬 수 있는 양으로 처리된다. 다른 구현예에서는 인비트로에서 수행되며, 파노비노스테트는 ECFC에 약 4nM 내지 6nM의 양으로 처리된다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실험 재료 및 방법
ECFCs 배양
MMD 환자(N = 5)와 건강한 대조군(N = 5)의 혈액샘플은 서울대학교병원 임상시험위원회(Institutional Review Board, IRB) (SNUH IRB 승인 번호 1610-108-801)에서 정보통 동의하에 모집하고 확보하였다(표 1). ECFC lineage의 형성을 위해 말초 혈액 단핵 세포(PBMNCs)는 2,300 rpm으로 25분 동안 Ficoll (Sigma, St. Louis, MO)을 통해 밀도 구배 원심 분리에 의해 분리되었고 PBS로 세 번 세척되었다. 모든 혈액 샘플은(40ml)은 수집 2시간 이내에 처리되었다. MNCs는 성장 인자가 첨가된 내피 세포 성장 배지(ECGM, PromoCell, Heidelberg, Germany)에서 미리 코팅 된 배양 접시(Collagen type I coating, BD Biosciences, Mountain View, CA)에 도말 하였다. 전형적인 내피형 조약돌 형태를 갖는 후기 ECFCs는 CD31, CD34, KDR, CD14 및 CD45와 같은 표면 마커를 사용하는 유동 세포 계측법으로 분석되었다. 분리 및 배양된 ECFCs 형태 및 세포 표면 마커의 특성화 분석 후에 사용하였다(표 2). 모든 세포 배양은 습도가 높은 대기에서 5% CO2로 37℃로 설정된 인큐베이터에서 배양되었다. 모든 실험은 passage 8 이하로 계대배양된 ECFCs를 사용하여 수행되었다.
세포생존율 분석
정상 및 MMD ECFCs의 세포 성장은 EZ-cytox (DAEIL Lab, Seoul, Korea)에 의해 제조자의 프로토콜에 따라 평가되었다. panobinostat (Selleckchem, Houston, USA)의 원액을 DMSO로 제조하였다. 세포(4×103)를 96-웰 마이크로 플레이트에 100㎕의 ECGM으로 접종하고 24시간 동안 배양하였다. 세포를 panobinostat(0-100nM 최종 농도)에 48과 72시간 노출시켰다. 세포 생존력은 분광 광도계를 사용하여 450nm에서 측정하였다. 결과는 처리되지 않은 대조군 세포와 비교하여 처리 된 세포에서 세포 생존력의 백분율로서 제시된다. GraphPad Software를 사용하여 IC10(10%저해 농도)과 IC50(50%저해 농도) 값을 계산하였다.
생체 외 tube formation 분석
정상 및 MMD ECFCs(1×105)를 6-웰 플레이트에 도말하였다. 24시간 후, panobinostat를 0, 2, 4, 6 및 8nM 농도로 세포에 첨가하였다(IC10계산을 통해 결정됨). 세포를 matrigel(코닝, MA) 50μl로 코팅된 미리 냉각된 48-웰 세포 배양 플레이트에 도말하고 37℃에서 30-45분 동안 배양하였다. 그런 다음 세포를 수확하고 1% 태아 소 혈청(FBS, Invitrogen)만을 함유하는 ECGM(보충제없이)에 재현탁했다. 세포(2×104)를 48-웰 코팅 된 플레이트에 3중으로 첨가하였다. 24시간 후, 역 현미경(Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany)을 사용하여 세포를 가시화하고 사진을 찍었다. 튜브 형성은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 숫자를 계수하여 분석하였으며, 얻어진 데이터는 결과의 평균을 나타낸다.
Western blot 분석
ECFCs에 panobinostat를 24과 48시간 처리 후 단백질 발현을 확인하였다. 이 실험에서 일차 항체는 항 히스톤 H3(아세틸 K27, 1: 1000) (Abcam, Cambridge, UK), 항 히스톤 H4(아세틸 K5 + K8 + K12 + K16, 1: 1000) (Abcam) 및 항 -ALDH1A2(RALDH2 유전자, 1: 500, Santa Cruz Biotechnology, TX, USA)를 사용하였다. 1차 항체와 함께 밤새 항온 배양한 후 membrane을 광범위하게 세척한 후 2차 항체와 함께 배양하였다. Membrane은 화학발광(Invitrogen) 시약을 추가하여 발광시켰다. Western blot의 밴드 강도는 x선 필름으로 시각화하고 Image J 소프트웨어로 정량화하였다.
Chromatin immunoprecipitation (ChiP) 분석
ChiP 분석은 Ac-H3 ChiP 분석 키트(Millipore, Burlington, MA)를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 수행하였다. 정상 및 MMD ECFC를 24시간 동안 panobinostat를 0, 2, 4 및 6nM로 처리하였다. DNA 시료는 Bioruptor sonicator (Cosmo Bio, Tokyo, Japan)를 사용하여 초음파 처리하였다. 면역 침강은 정상 토끼 IgG (Santa Cruz Biotechnology, TX, USA)와 아세틸-H3K27 항체(Abcam)로 수행하였다. Invitrogen의 Dynabeads®를 단백질 항체 상호 작용에 사용했다. 최종 DNA 용출은 Clontech (Takara Bio, CA, USA)의 ChIP 용출 키트를 통해 수행되었다. 총 ssDNA는 Clontech Elution Kit를 사용하여 정상 및 MMD ECFC에서 추출하였다. AccuPower PCR premix (BioNeer, Daejon, Korea)를 사용하여 동일한 양의 DNA를 특정 프라이머 세트 (RALDH2 영역 1 : sense 5'-GGAGAGCGCATTCTCTTGGT-3 ', antisense 5'-AGTTACTGCCTTTGCCTGCT-3', RALDH2 region 2 : sense 글리세롤 알데히드 -3- 인산 탈수소 효소 (GAPDH) 센스 5'-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3 ', 안티센스 5'-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3')를 코딩하는 유전자를 포함한다. 최종 증폭 생성물을 2% 아가로즈겔에서 전기 영동하고 정량화 하였다. PCR 밴드 밀도는 지정된 영역을 사용하여 ImageJ 소프트웨어에 의해 자동으로 계산하였다.
생체 내 matrigel plug 분석
동물실험을 위해, 7주령의 수컷 BALB/c-nude mouse가 병원체 없는 조건하에 반입되었다. 모든 동물을 대상으로 한 연구는 서울대학교병원(IACUC number: 17-0070-S1A0)의 기관 동물 케어 및 사용위원회(IACUC)의 승인을 받은 프로토콜에 따라 수행되었다. ECFCs가 70-80%의 confluency에 도달했을 때, 세포는 6nM panobinostat의 존재 또는 부재하에 처리되었다. 인큐베이션 1일 후에, 400㎕의 Matrigel (Coring)에 ECFC를 준비하였다. 그 다음, 마우스를 무작위로 5 그룹 (각 그룹에서 N = 3)으로 나눴다: 그룹 1, 단지 마트리겔; 그룹 2, Matrigel + 비 처리된 정상 ECFCs; 그룹 3, Matrigel + panobinostat 처리된 정상 ECFCs; 그룹 4, Matrigel + 무 처리 MMD ECFCs; 및 Group 5, Matrigel + panobinostat 처리 MMD ECFCs. 누드 마우스에게 Matrigel을 피하 주사하였다. ECFCs를 넣지 않은 matrigel은 음성 대조군으로 사용되었다. Matrigel 주사 후 10일째에 마우스를 희생시키고, 면역 형광 분석을 위해 플러그를 회수하였다.
Matrigel 플러그에서 준비된 조직 슬라이드로 이중 면역 형광을 수행하였다. 슬라이드를 탈파라핀 처리하고 항원 검색 용액과 함께 배양한 후 사용하였다. 항 인간 핵 (1 : 200, Millipore, Temecula) 및 항 인간 CD31 (1 : 400, Millipore) 항체를 일차 항체로 사용하였고 항 염소 IgG를 Alexa-488 및 Alexa-594 (1 : 500, Invitrogen)을 2차 항체로 사용 하였다. 4'-,6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI, Vector Laboratories, Burlingame, CA)을 포함하는 항-퇴색 용액으로 장착한 후, 플러그의 형광 신호를 공 초점 현미경(Leica Microsystems GmbH)을 통해 관찰하였다. 각 마트리겔 플러그에 대해 특정 핫스팟을 식별하였다. 고출력 필드 당 인간 핵과 CD31 이중 양성 세포의 수는 2명의 독립적인 관측자에 의해 3군데의 무작위 부분에서 3개의 무작위 장에 관찰하고 결정되었다.
통계분석
모든 값은 평균±표준 편차 또는 최소 세 번의 독립적인 실험을 통해 대조군의 백분율±표준 편차로 계산되었다. 통계 분석은 일원 분산 분석(one-way ANOVA)과 Tukey 다중 비교(multiple comparison) 테스트를 통한 다중 비교 절차에 의해 수행되었다. 두 그룹 간의 연속 변수를 비교하기 위해 Student 's t-test와 Mann-Whitney test를 사용했다. 차이는 P <0.05에서 통계적으로 유의하다고 간주되었다. GraphPad Prism 소프트웨어(La Jolla, CA, USA)를 모든 분석에 사용했다.
실시예 1. 모야모야 ECFCs에서 panobinostat의 IC 10 확인
Panobinostat에 대한 정상 및 MMD ECFC의 민감도를 평가하기 위해 세포 생존력을 측정하고 IC50및 IC10을 계산하였다. 정상 및 MMD ECFC에서의 IC50은 각각 42.5 ± 4.17 nM 및 63.9 ± 28.18 nM이었다 (표 3). 100nM까지 panobinostat으로 치료할 때 정상 및 MMD ECFC 각각 2 예에 대해 IC50을 얻을 수 없었다. IC10은 정상적인 ECFC에서는 9.8 ± 7.07 nM이었고 MMD ECFC에서는 9.5 ± 3.72 nM이었다. Panobinostat은 정상 및 MMD ECFC에서 세포 생존력의 용량 의존적인 감소를 유도했으며, 72시간에서 확인되었다(도 1). IC10 값에 기초하여, 0 내지 10nM의 투여량으로 이후 실험을 수행하였다. 이 범위는 ECFCs에서 가장 높은 수준의 아세틸화를 보였다.
실시예 2. Panobinostat에 의한 MMD ECFCs에서 Ac-H3, Ac-H4 및 RALDH2의 발현 수준의 상향 조절
히스톤아세틸화가 ECFCs에서 상향 조절되는지 여부를 확인하기 위해, 세포에 0-8nM panobinostat을 처리하였다. Ac-H3은 정상 ECFCs에서 8nM (p <0.05), MMD ECFC에서는 6nM (p <0.05) 및 8nM (p <0.001) 증가했다(도 2A 및 2B). Ac-H4의 경우 6nM, 8nM panobinostat에서 정상 (6nM, p <0.01 및 8nM, p <0.001) 및 MMD ECFC (6nM, p <0.05 및 8nM, p <0.001)(도 2A 및 2C). 흥미롭게도, 우리는 MMD ECFCs에서 4nM (p <0.001), 6nM (p <0.01) 및 8nM (p <0.001) panobinostat에서 RALDH2 단백질 발현이 강하게 증가한다는 것을 발견했다(도 2A 및 2D). 그러나, RALDH2의 발현은 정상적인 ECFC에서 유의한 영향을 받지 않았다. 종합적으로, 이들 결과는 panobinostat가 정상 ECFC에서보다 MMD ECFC에서 Ac-H3 및 RALDH2를 보다 효과적으로 상승시켰음을 입증했다.
실시예 3. RALDH2 프로모터의 MMD ECFC의 Ac-H3와 강한 관련성
우리의 이전 연구는 RALDH2 프로모터(RALDH2 프로모터 영역 1과 RALDH2 프로모터 영역 2)가 정상 ECFC에서 Ac-H3와 관련이 있는 반면, MMD ECFC는 RALDH2 프로모터 영역에서 Ac-H3 결합이 적다는 사실을 입증했다. 이 결과를 바탕으로, 2개의 프라이머 세트를 분석하였고 panobinostat의 농도가 증가함에 따라, RALDH2 promoter region의 발현 수준이 증가하는 것을 확인하였다. 정상적인 ECFC에서 RALDH2 promoter region 1은 강한 증가를 보이지 않았지만, 6nM panobinostat (p <0.05, Figure 3A)로 처리 후에만 region 2에서 약간의 유의한 증가가 있었다. MMD ECFCs는 region 1의 경우 4nM에서 6nM (모두 p <0.05)에서 region 2의 경우 2nM (p <0.05), 4nM (p <0.01) 및 6nM (p <0.05)에서 증가가 관찰되었다(도 3B). 예상대로, Ac-H3 및 Ac-H4의 수준은 현저하게 향상되어, panobinostat 처리 후 RALDH2 promoter region 1 및 2에 대한 결합을 나타낸다.
실시예 4. Panobinostat에 의한 시험 관내에서 MMD ECFCs의 tube formation촉진 효과
Panobinostat이 MMD ECFC에서 Ac-H3, Ac-H4 및 RALDH2를 증가시켰음을 보여주는 우리의 western blot 결과에 기초하여, panobinostat이 MMD ECFC의 결함 있는 튜브 형성 능력을 자극할 수 있다고 추측했다. 따라서, 우리는 ECFCs에서 체외 Matrigel 튜브 형성 분석을 실시했다. 우리는 정상 및 MMD ECFCs 모두 tube 형성을 증가시키는 것을 발견했다(도 4A 및 4B). 정상 ECFC는 4nM (p <0.001)과 6nM (p <0.01)에서 증가를 보였으나, 8nM panobinostat에서는 차이가 없었다. MMD ECFC는 또한 2에서 8nM까지 튜브 형성의 증가를 보였다(모두 p <0.001, 도 4B). 정상 및 MMD ECFC 모두에서, tube 수는 6nM의 panobinostat에서 가장 높았으며, 이는 IC10 이하의 농도였다. 흥미롭게도 MMD ECFCs의 증가율은 정상 ECFCs의 증가율보다 훨씬 더 중요한 것으로 확인이 되었다.
실시예 5. Panobinostat에 의한 생체 내에서 MMD ECFC의 결함을 회복 효과
정상적인 ECFCs에 비해 MMD ECFCs가 비정상적이며 튜브 형성 능력에 결함이 있음이 잘 알려져 있기 때문에 다음으로 우리는 생체 내 matrigel plug assay를 통한 panobinostat 치료 후 ECFCs의 혈관형성 능력을 평가했다. Panobinostat 처리 후 정상적인 ECFCs에서는 유의한 차이가 없었지만(도 5A, p = 0.5373), panobinostat 처리 MMD ECFCs에서 인간 핵과 CD31 동시 발현 세포의 수는 유의하게 증가했다(도 5B, p <0.0001). 우리는 생체 내 matrigel plug assay의 결과가 생체 외 tube 형성 결과와 일치함을 확인했다. 이 데이터는 panobinostat가 MMD ECFCs의 손상된 혈관 형성을 향상시킬 수 있다는 것을 시사한다.
[표 1] 모야모야와 정상으로부터 분리한 ECFCs 정보
Figure pat00001
[표 2] ECFCs의 표면마커 비율
Figure pat00002
[표 3] ECFCs에서 panobinostat의 IC10 and IC50 (nM)
Figure pat00003
종합하면 파노비노스테트는 정상 및 MMD ECFC 모두에서 Ac-H3 및 Ac-H4의 수준을 상승시켰고 MMD에서 훨씬 더 효과적이었다. Panobinostat에 의한 RALDH2 발현의 증가는 MMD ECFC에서만 관찰되었다. Panobinostat은 생체 외와 내에서 정상 및 MMD ECFCs 모두의 tube formation을 증가시켰지만 MMD ECFCs에서 효과가 더 컸다. 흥미롭게도, post-panobinostat 치료 후, 튜브 수는 생체 내 MMD ECFC에서 유의하게 증가했다. 이러한 결과는 파노비노스테트가 MMD 환자에게 강력한 치료제로 작용할 수 있음을 나타내는 것이다.
이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims (7)

  1. 파노비노스테트(Panobinostat) 또는 그 약학적으로 허용가능한 그 염을 포함하는 모야모야병 치료용 약학 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 모야모야병 환자의 혈관내피집락형성세포(Endothelial Colony Forming Cell, ECFC)의 세포사멸은 유발하지 않으면서, 상기 세포의 혈관신생능을 회복시키는 것인, 모야모야병 치료용 약학 조성물.
  3. 파노비노스테트 또는 그 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 모야모야병의 혈관내피집락형성세포의 혈관신생 회복 또는 촉진용 약학 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 혈관내피집락형성세포는 최대 6nM 농도의 상기 파노비노스테트 또는 그 약학적으로 허용가능한 염으로 처리되는 것인, 관신생 회복 또는 촉진용 약학 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 혈관내피집락형성세포는 4nM 내지 6nM의 농도의 상기 파노비노스테트 또는 그 약학적으로 허용가능한 염으로 처리되는 것인, 혈관신생 회복 또는 촉진용 약학 조성물.
  6. 인비트로에서 혈관내피집락형성세포에 파노비노스테트를 처리하는 단계를 포함하는, 인비트로 또는 인간을 제외한 동물에서 ECFC 혈관신생능 촉진 방법.
  7. 제 4 항에 있어서,
    상기 ECFC는 모야모야병 환자 유래이고, 상기 파노비노스테트는 4 내지 6nM의 농도로 처리되는 것인, 인비트로 또는 인간을 제외한 동물에서 ECFC 혈관신생능 촉진 방법.
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