CN111377887A - 七种来源于少花瘤枝卫矛的萜类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

七种来源于少花瘤枝卫矛的萜类化合物及其制备方法和用途，本发明涉及三个新的半日花烷型降二萜(1，3，6)和三个新的半日花烷型二萜(2，4，5)与一个已知的半日花烷型降二萜(7)的结构、制备方法及其在抗炎、治疗神经退行性疾病药物中的应用，所述的新化合物1‑6和已知化合物7，具有如下结构。本发明的七个化合物有NO抑制活性，可用于抗炎、治疗神经退行性疾病药物的开发和应用。
Figure DSA0000176754750000011

Description

七种来源于少花瘤枝卫矛的萜类化合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及少花瘤枝卫矛中萜类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
Nitric oxide(NO)是一重要的信使分子，在各种生理病理学过程中，起着关键的作用，具有神奇的生理调节功能。在炎症反应过程中，NO所发挥的作用主要是依赖于NO的浓度而决定的，过量的NO会激活炎症因子从而产生急性或慢性炎症。许多疾病，包括炎症、神经退行性疾病、癌症等，可能是NO的释放或调节不正常引起的。
炎症反应时，炎症介质或致炎物可诱导或增加局部NO的合成及释放，而NO的释放又可诱导促炎症细胞因子产生，如IL-1、TNF-α等。过量的NO可促进血管扩张，增强血管通透性和渗漏，产生细胞毒性。过多的NO的细胞毒性是非特异性的，不仅针对微生物，而且导致细胞周围组织和细胞损害。鉴于炎症与NO的密切关系，抑制NO的生成，已成为抗炎药物的靶标之一。
在中枢神经系统中，NO是神经炎症反应的一个信号。炎症反应伴随着小胶质细胞的活化，并释放大量的NO，产生神经毒性，导致神经元的退化与死亡，进而引起神经退行性疾病。因此，抑制中枢神经系统NO的产生，在治疗神经炎症的同时，对与神经炎症相关的神经退行性疾病，如阿尔兹海默症、帕金森症等有潜在的治疗作用。
植物为我们提供了结构与生物活性多样性的天然产物。为了寻找新的NO抑制剂、进而开发抗炎、以及治疗神经退行性疾病的药物，我们建立了BV-2细胞筛选模型。此细胞在脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)的刺激下，产生NO；在LPS刺激的同时，加入受试药物(化合物或植物提取物)，评价药物抑制NO活性，从而发现抗炎以及治疗神经退行性疾病的药物。
发明内容
本发明的目的在于提供少花瘤枝卫矛中三个新的半日花烷型降二萜(1，3，6)和三个新的半日花烷型二萜(2，4，5)与一个已知的半日花烷型降二萜(7)类化合物及其制备方法和应用。
本发明提供的新化合物1，3，6属于半日花烷型降二萜，新化合物2，4，5属于半日花烷型二萜，已知化合物7为半日花烷型降二萜，其具有如下结构。
Figure BSA0000176754770000021
本发明还提供了所述化合物1-7的制备方法，该方法包括如下步骤：
(1)少花瘤枝卫矛(Euonymus verrucosus var.pauciflorus)细枝用溶剂提取，回收提取液得粗提物；
(2)步骤(1)所得粗提物溶解于水中，采用与水不相混溶的有机溶剂萃取，回收溶剂得到萃取物；
(3)步骤(2)所得萃取物经硅胶柱色谱法分离，以石油醚/丙酮或石油醚/乙酸乙酯混合溶剂梯度洗脱；
(4)上述步骤(3)中所得流份经MPLC(中压液相色谱，色谱填料为ODS)分离，以甲醇/水，或乙腈/水混合溶剂为流动相梯度洗脱；
(5)上述步骤(4)中所得流份经HPLC-RI(高效液相-示差检测)色谱分离，以甲醇/水为流动相洗脱，或以乙腈/水为流动相梯度洗脱，得到化合物1-7。
本发明提供的化合物1-7的制备方法，所述少花瘤枝卫矛为卫矛科(Celastraceae)卫矛属少花瘤枝卫矛(Euonymus verrucosus var.pauciiflorus)细枝的提取物。
本发明提供的化合物1-7的制备方法，步骤(1)所述的提取方法为加热回流提取或超声提取，所用溶剂为二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、乙醇中的至少一种，药材∶溶剂的重量体积比为1∶5～1∶15。
本发明提供的化合物1-7的制备方法，步骤(2)所述的萃取方法，所用有机溶剂为石油醚、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯中的任意一种，水溶液和有机溶剂体积比1∶1～1∶2。
本发明提供的化合物1-7的制备方法，步骤(3)中，洗脱溶剂为石油醚/丙酮或石油醚/乙酸乙酯混合溶剂，其比例为100∶0～100∶40。
本发明提供的化合物1-7的制备方法，步骤(4)中，所述甲醇/水混合溶剂的比例为6∶4～9∶1，优选7∶3～8∶2，或乙腈/水混合溶剂比例为6∶4～8∶1，优选7∶3～8∶2。
本发明提供的化合物1-7的制备方法，步骤(5)中所述流动相甲醇和水混合溶剂、或乙腈和水混合溶剂的体积比例为3∶7～9∶1，优选7∶3～9∶1。
本发明提供的七个萜类化合物具有NO抑制活性。用于制备抗炎和治疗神经退行性疾病的药物。
附图说明
图1本发明化合物1的1H NMR谱；
图2本发明化合物1的13C NMR谱；
图3本发明化物1的DEPT135谱；
图4本发明化合物1的HMQC谱；
图5本发明化合物1的HMBC谱；
图6本发明化合物1的1H-1H COSY谱；
图7本发明化合物2的1H NMR谱；
图8本发明化合物2的13C NMR谱；
图9本发明化合物2的HMQC谱；
图10本发明化合物2的HMBC谱；
图11本发明化合物3的1H NMR谱；
图12本发明化合物3的13C NMR谱；
图13本发明化合物3的HMQC谱；
图14本发明化合物3的HMBC谱；
图15本发明化合物4的1H NMR谱；
图16本发明化合物4的13C NMR谱；
图17本发明化合物4的HMQC谱；
图18本发明化合物4的HMBC谱；
图19本发明化合物5的1H NMR谱；
图20本发明化合物5的13C NMR谱；
图21本发明化合物5的HMQC谱；
图22本发明化合物5的HMBC谱；
图23本发明化合物6的1H NMR谱；
图24本发明化合物6的13C NMR谱；
图25本发明化合物6的HMQC谱；
图26本发明化合物6的HMBC谱；
图27本发明化合物1-6的HMBC与1H-1H COSY相关信号图；
图28本发明化合物1-6的实验和计算ECD谱。
图29本发明化合物1-7的结构式
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
实施例1
(1)少花瘤枝卫矛细枝10.5kg用甲醇加热回流提取3次(用量3×60L)，减压回收提取液得粗提物；
(2)步骤(1)所得甲醇提取物，加水制成混悬液，用乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取物；
(3)步骤(2)经硅胶柱色谱法分离，依次以石油醚∶丙酮100∶0，100∶2，100∶4，100∶6，100∶9，100∶13，100∶30，100∶40洗脱；
(3)上述步骤(2)中所得的石油醚∶丙酮100∶2～100∶13流份经中压液相色谱(MPLC)分离，以甲醇/水6∶4～9∶1为流动相梯度洗脱；
(4)上述步骤(3)中所得甲醇/水(6∶4～9∶1)流份经HPLC-RI分离，以甲醇/水60∶40～90∶10为流动相洗脱得到新化合物1(收率0.002％)，2(收率0.004％)，3(收率0.001％)，4(收率0.003％)，5(收率0.026％)，6(收率0.006％)和7(收率0.002％)。
根据新化合物1-6的理化性质和波谱数据鉴定了其结构(化合物1-6的波谱图见图1-图26)。
化合物1的结构鉴定数据如下：
无色油状；
Figure BSA0000176754770000061
ECD(CH3CN)202(Δε-3.43)，235(Δε+1.37)nm；IR(film)vmax：3486，2924，2847，1713，1680，1563，1460，1385，1293，1188，1080，972，953，893，780cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)and13C NMR(100MHz，CDCl3)数据见表1和表2；ESIMS m/z 291[M+H]+；HRESIMS m/z 291.2321[M+H]+，calcd for C19H31O2，291.2324。化合物的HMBC相关信号见图27。该化合物的绝对构型通过运用TDDFT(时间密度泛函理论)方法进行ECD(电子圆二色谱)计算确定，将实验测出的ECD谱图与计算得到的对映异构体的ECD图谱进行比较，确定了该化合物的绝对构型为5S，6R，9S，10R，ECD图谱见图28。
化合物2的结构鉴定数据如下：
无色结晶(甲醇)；mp 131-133℃；
Figure BSA0000176754770000062
ECD(CH3CN)192(Δε-4.08)，202(Δε-2.57)，208(Δε-2.89)，231(Δε-1.08)，246(Δε-1.15)，284(Δε0.00)，321(Δε-0.07)nm；IR(film)vmax：3527，3125，3095，2955，2920，2843，1770，1616，1557，1512，1461，1327，1219，1114，1033，1000，975，889，775，642cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)and13C NMR(100MHz，CDCl3)数据见表1和表2；ESIMS m/z 317[M+H]+；HRESIMS m/z317.2117[M+H]+，calcd for C20H29O3，317.2117。该化合物的绝对构型通过ECD确定。该化合物的绝对构型通过运用TDDFT(时间密度泛函理论)方法进行ECD计算确定，将实验测出的ECD谱图与计算得到的对映异构体的ECD图谱进行比较，确定了该化合物的绝对构型为5S，6R，9S，10R，ECD图谱见图28。
化合物3的结构鉴定数据如下：
无色油状；
Figure BSA0000176754770000063
ECD(CH3CN)202(Δε-3.43)，240(Δε+1.19)nm；IR(film)vmax：3420，3082，2924，2865，2844，1708，1645，1459，1439，1386，1313，1265，1112，1031，993，953，869，779，735cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)and13C NMR(100MHz，CDCl3)数据见表1和表2；ESIMS m/z 305[M+H]+；HRESIMS m/z 305.2115[M+H]+，calcd forC19H29O3，305.2117。化合物的HMBC相关信号见图27。由于在NOESY图谱中没有明显的氢信号与H-14有相关，所以我们进行了C-14位两种构型的ECD计算，即(5S，6R，9S，10R，14R)和(5S，6R，9S，10R，14S)，结果表明两种构型的计算图谱都与实验图谱相吻合，故无法利用ECD计算的方法确定其绝对构型，最终表示为5S，6R，9S，10R，14ξ。
化合物4的结构鉴定数据如下：
无色油状；
Figure BSA0000176754770000071
ECD(CH3CN)200(Δε-4.23)，229(Δε+1.38)nm；IR(film)vmax：3380，2923，2865，2851，1714，1581，1556，1461，1380，1265，1212，1034，993，974，865，822，778cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)and13C NMR(100MHz，CDCl3)数据见表1和表2；ESIMS m/z 321[M+H]+；HRESIMS m/z 321.2433[M+H]+，calcd for C20H33O3，321.2430。化合物的HMBC相关信号见图27。该化合物的绝对构型通过ECD确定。该化合物的绝对构型通过运用TDDFT(时间密度泛函理论)方法进行ECD计算确定，将实验测出的ECD谱图与计算得到的对映异构体的ECD图谱进行比较，确定了该化合物的绝对构型为5S，6R，9S，10R，ECD图谱见图28。
化合物5的结构鉴定数据如下：
白色无定型粉末；
Figure BSA0000176754770000072
ECD(CH3CN)202(Δε-2.82)，231(Δε+1.33)nm；IR(film)vmax：3420，3082，2924，2944，1708，1645，1459，1386，1265，1218，1076，1014，993，869，779，735cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)and13C NMR(100MHz，CDCl3)数据见表1和表2；ESIMS m/z 305[M+H]+；HRESIMS m/z 305.2478[M+H]+，calcd for C20H33O2，305.2481。化合物的HMBC相关信号见图27。该化合物的绝对构型通过ECD确定。该化合物的绝对构型通过运用TDDFT(时间密度泛函理论)方法进行ECD计算确定，将实验测出的ECD谱图与计算得到的对映异构体的ECD图谱进行比较，确定了该化合物的绝对构型为5S，6R，9S，10R，ECD图谱见图28。
化合物6的结构鉴定数据如下：
无色油状；
Figure BSA0000176754770000082
ECD(CH3CN)206(Δε-0.25)nm；IR(film)vmax3482，3080，2994，2867，1707，1648，1458，1363，1248，1204，1055，1033，976，865，779，737cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)and13C NMR(100MHz，CDCl3)数据见表1和表2。ESIMS m/z267[M+H]+；HRESIMS m/z 267.1963[M+H]+，calcd for C16H27O3，267.1960。化合物的HMBC相关信号见图27。该化合物的绝对构型通过ECD确定。该化合物的绝对构型通过运用TDDFT(时间密度泛函理论)方法进行ECD计算确定，将实验测出的ECD谱图与计算得到的对映异构体的ECD图谱进行比较，确定了该化合物的绝对构型为5S，6R，9S，10R，ECD图谱见图28。
表1新化合物1-6的13C NMR数据
Figure BSA0000176754770000081
Figure BSA0000176754770000091
表2新合物1-6的1H NMR数据
Figure BSA0000176754770000092
a重叠的信号。
实施例2
(1)少花瘤枝卫矛细枝8.0kg用乙醇加提取3次(用量3×48L)，减压回收提取液得粗提物；
(2)步骤(1)所得乙醇提取物，加水制成混悬液，用乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取物；
(3)步骤(2)经硅胶柱色谱法分离，依次以石油醚∶乙酸乙酯100∶0，100∶2，100∶4，100∶6，100∶9，100∶15，100∶28，100∶42洗脱；
(3)上述步骤(2)中所得的石油醚∶乙酸乙酯100∶2～100∶15流份经中压液相色谱(MPLC)分离，以甲醇/水6∶4～9∶1为流动相梯度洗脱；
(4)上述步骤(3)中所得甲醇/水(6∶4～9∶1)流份经HPLC-RI分离，以甲醇/水60∶40～90∶10为流动相洗脱得到新化合物1(收率0.001％)，2(收率0.003％)，3(收率0.001％)，4(收率0.003％)，5(收率0.016％)，6(收率0.006％)和7(收率0.002％)。
化合物1-6的结构鉴定方法见实施例1。
实施例3
(1)少花瘤枝卫矛细枝8.0kg用丙酮加提取3次(用量3×48L)，减压回收提取液得粗提物；
(2)步骤(1)所得丙酮提取物，加水制成混悬液，用二氯甲烷萃取，得二氯甲烷萃取物；
(3)步骤(2)经硅胶柱色谱法分离，依次以石油醚∶丙酮100∶0，100∶2，100∶4，100∶6，100∶9，100∶13，100∶28，100∶40洗脱；
(3)上述步骤(2)中所得的石油醚∶丙酮100∶2～100∶13流份经中压液相色谱(MPLC)分离，以甲醇/水6∶4～9∶1为流动相梯度洗脱；
(4)上述步骤(3)中所得甲醇/水(6∶4～9∶1)流份经HPLC-RI分离，以乙腈/水60∶40～90∶10为流动相洗脱得到新化合物1(收率0.002％)，2(收率0.004％)，3(收率0.004％)，4(收率0.006％)，5(收率0.020％)，6(收率0.006％)和7(收率0.002％)。
化合物1-6的结构鉴定方法见实施例1。
实施例4
少花瘤枝卫矛中化合物1-7的NO抑制活性测试。
(1)实验原理
NO与炎症、神经退行性疾病等密切相关，具有NO抑制活性的化合物，是潜在的治疗炎症、阿尔兹海默症、帕金森症等神经退行性疾病的药物。本实验通过建立BV-2细胞模型，此细胞在LPS的刺激下，产生NO；在LPS刺激的同时，加入受试化合物，评价化合物1-7的抑制NO活性，从而发现抗炎以及治疗神经退行性疾病的潜在药物。
(2)实验方法
①小鼠小胶质细胞BV-2的培养
以DMEM高糖培养基作为基础配制成内含10％胎牛血清及1％双抗(青霉素∶链霉素＝1∶1)细胞培养液，37℃，5％CO2培养箱培养，2～3天换液一次，至细胞基本铺满培养瓶瓶底，传代或实验处理。
②化合物的配制方法
待测化合物用DMSO溶解，配成母液，浓度为30mM，储存于-20℃。临用时用DMEM培养液将其进行稀释，依次稀释为10mM、5mM、3mM、1mM、0.1mM、0.01mM。
③待测化合物的细胞毒性
将对数生长期的细胞，调细胞密度为1×105个/mL，接种于96孔板，置于37℃，5％的培养箱中，培养24小时后，加不同浓度的待测化合物，20h后，观察细胞的存活情况，并用MTT法定量检测化合物对细胞的毒性，以确定化合物的测试浓度。
④化合物的NO抑制活性
将处于对数生长期的BV-2细胞，调细胞密度接种于96孔板(5×104细胞/孔)，培养24小时，待细胞完全贴壁后，加入不同浓度的待处理化合物，预处理30min后，加入LPS至终浓度为0.2μg/mL，继续培养24小时后，取50μL细胞培养上清液，分别加入50μL Griess试剂(A液∶B液＝1∶1，A液含有1％的磺胺，5％的磷酸，B液为0.1％的α-萘乙二胺二盐酸盐，A，B液需要避光保存)，按Griess法，于550nm波长下测吸光度值，根据吸光度值和标准曲线计算各化合物对NO的抑制率。
⑤统计方法
全部资料采用SPSS(13.0)统计软件包进行检验分析。结果用平均值±标准误表示，评价整体性差异，组间均数采用One-Way ANOVA分析法进行方差齐性分析，并结合Dunnett’s test分析方法进行组间比较。多样本方差齐性检验采用Levene检验，当p＞0.05，方差是齐的，采用Dunnett’s双侧T检验多组间均数的差异，当p＜0.05，方差不齐，采用Dunnett T3检验多组间均数的差异。
⑥IC50的计算方法
将各剂量和抑制率等参数用非线性回归拟合计算化合物抑制NO的IC50值。
(3)实验结果：化合物抑制NO的IC50值见表2。
表2化合物1-7抑制NO的IC50值
Figure BSA0000176754770000121
a2-Methyl-2-thiopseudourea，sulfate(SMT)为阳性对照药物。
结果表明实施例1-3中所制备得到的化合物3-7具有NO抑制活性。

Claims (10)

1.少花瘤枝卫矛中三个新的半日花烷型降二萜(1，3，6)和三个新的半日花烷型二萜(2，4，5)与一个已知的半日花烷型降二萜(7)，其特征在于：具有如下结构。
Figure FSA0000176754760000011
2.一种权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
(1)少花瘤枝卫矛(Euonymus verrucosus var.pauciflorus)用溶剂提取，回收提取液得粗提物；
(2)步骤(1)所得粗提物溶解于水中，采用与水不相混溶的有机溶剂萃取，减压回收溶剂得到萃取物；
(3)步骤(2)所得萃取物经硅胶柱色谱法分离，以石油醚/丙酮或石油醚/乙酸乙酯混合溶剂梯度洗脱；
(4)上述步骤(3)中所得流份经MPLC(中压液相色谱，色谱填料为ODS)分离，以甲醇/水，或乙腈/水混合溶剂为流动相梯度洗脱；
(5)上述步骤(4)中所得流份经HPLC-RI(高效液相-示差检测)色谱分离，以甲醇/水为流动相洗脱，或以乙腈/水为流动相梯度洗脱，得到化合物1-7。
3.按照权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征在于：所述少花瘤枝卫矛为卫矛科(Celastraceae)卫矛属少花瘤枝卫矛(Euonymus verrucosus var.pauciflorus)细枝的提取物。
4.按照权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的提取方法为加热回流提取或超声提取1～3次，所用溶剂为石油醚、环己烷、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇中的至少一种，药材：溶剂的重量体积比为1∶5～1∶15。
5.按照权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述的萃取方法，水溶液和有机溶剂体积比1∶1～1∶2，所用的萃取溶剂为石油醚、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯中的一种。
6.按照权利要求2所述的化合物制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述洗脱溶剂石油醚/丙酮或石油醚/乙酸乙酯混合溶剂的比例为100∶0～100∶40。
7.按照权利要求2所述的化合物制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述甲醇/水混合溶剂的比例为7∶3～9∶1，或乙腈/水混合溶剂比例为6∶4～9∶1。
8.按照权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征在于：步骤(5)中所述流动相甲醇/水或乙腈/水混合溶剂为流动相，流动相中混合溶剂的比例为3∶2～9∶1得化合物1；流动相中混合溶剂的比例为3∶2～9∶1得化合物2；流动相中混合溶剂的比例为3∶2～9∶1得化合物3；流动相中混合溶剂的比例为3∶2～8∶2得化合物4；流动相中混合溶剂的比例为3∶2～9∶1得化合物5；流动相中混合溶剂的比例为7∶3～8∶2得化合物6；流动相中混合溶剂的比例为3∶2～9∶1得化合物7。
9.一种药物制剂，其包含有如权利要求1中所述的化合物或药学上可接受的盐和药学上可接受的辅料、稀释剂和载体。
10.权利要求1所述的化合物在制备预防和治疗炎症、神经退行性疾病药物中的应用。
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