CN111377900A - 异叶三宝木根中两种新二萜的制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及来源于异叶三宝木根部的两个新的天然二萜化合物的结构、制备方法及其在抗炎、治疗神经退行性疾病药物中的应用，所述的天然产物Heterophypene A(1)和Heterophypene B(2)，本发明的两个新化合物有抑制NO的活性，可用于抗炎、以及治疗神经退行性疾病药物开发和应用。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及异叶三宝木中新的萜类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
一氧化氮(nitric oxide，NO)是一类胞内信使。研究表明，神经退行性病人脑组织中催化合成NO的酶的表达水平显著提高，提示NO与神经退行性疾病密切相关。此外，在这些组织中还检测到硝化的蛋白，提示NO在这些组织中具有生物活性。在神经免疫应答中，神经元和胶质细胞(包括小胶质细胞和星形胶质细胞)内都发生了NO水平的改变。很多神经退行性疾病都伴随有神经炎症，抑制神经炎症的信号通路能延迟这些疾病的发展。因此，NO及其释放通路已逐渐成为神经退行性疾病研究领域的热点，对它们的理解能帮助我们找到合适的方案来预防、减缓或者治愈这些疾病。
中枢神经系统初级的固有免疫细胞——小胶质细胞，占据整个神经系统细胞数量大约12％，总体分布整个大脑实质。中枢神经中最主要的一道免疫防线就是小胶质细胞，同样也是中枢神经的第一道防线，正常情况下，小胶质细胞不停地清除CNS中损坏的神经、斑块及感染性物质，维护神经系统的稳定。
作为脑内主要的免疫效应细胞，小胶质细胞具有类似巨噬细胞的功能，在受到刺激时易被激活，分泌大量的炎症细胞因子。NO虽然是多种生理功能的重要调节分子，大量NO是造成神经细胞损伤死亡的重要炎症因子之一，可导致宿主细胞和邻近细胞的损伤。在多种神经毒性物质刺激下，NO生成量增加。因此，直接抑制NO的产生，可能是治疗炎症的有效手段之一。
植物为我们提供了结构与生物活性多样性的天然产物。为了寻找新的NO抑制剂、进而开发抗炎、以及治疗神经退行性疾病的药物，我们建立了BV-2细胞筛选模型。此细胞在脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)的刺激下，产生NO；在LPS刺激的同时，加入受试药物(化合物或植物提取物)，评价药物抑制NO活性，从而发现抗炎以及治疗神经退行性疾病的药物。
发明内容
本发明的目的在于提供异叶三宝木中2个新的萜类化合物及其制备方法和应用。
本发明提供的新化合物1和2属于松香烷型二萜，其具有如下结构。
本发明还提供了所述新化合物1和2的制备方法，该方法包括如下步骤：
(1)异叶三宝木(T.heterophyllus)的根部用进行提取，回收提取液得到粗提物；
(2)将步骤(1)所得粗提物溶于蒸馏水中，采用与水不相混溶的有机溶剂萃取，减压回收溶剂得到萃取物；
(3)步骤(2)所得萃取物经硅胶柱色谱法分离，以石油醚/丙酮或石油醚/乙酸乙酯混合溶剂梯度洗脱；
(4)上述步骤(3)中所得流份经MPLC(中压液相色谱，色谱填料为ODS)分离，以甲醇/水，或乙腈/水混合溶剂为流动相梯度洗脱；
(5)将步骤(4)中所得的流份经HPLC-RI(高效液相-示差检测)色谱分离，以甲醇/水为流动相洗脱，得到化合物1和2。
本发明提供的新化合物1和2的制备方法，其特征在于：所述异叶三宝木为大戟科(Euphorbiaceae)三宝木属异叶三宝木(T.heterophyllus)根部的提取物。
本发明提供的新化合物1和2的制备方法，步骤(1)中所述的提取方法为加热回流提取1～3次，所用溶剂为石油醚、环己烷、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇中的至少一种，药材∶溶剂的重量体积比为1∶5～1∶15。
本发明提供的新化合物1和2的制备方法，步骤(2)所用有机溶液为石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿中的一种，按照水溶液和有机溶剂1∶1～1∶1.25的体积比进行萃取。
本发明提供的新化合物1和2的制备方法，步骤(3)中，洗脱溶剂为石油醚/丙酮或石油醚/乙酸乙酯混合溶剂，一般洗脱比例是100∶0～100∶40。
本发明提供的新化合物1和2的制备方法，步骤(4)中所述甲醇和水混合溶剂的比例为7∶3～9∶1，或乙腈/水混合溶剂比例为6∶4～9∶1。
本发明提供的新化合物1和2的制备方法，步骤(5)中所述流动相甲醇/水或乙腈/水混合溶剂为流动相，流动相中混合溶剂的比例为3∶2～9∶1得化合物1；流动相中混合溶剂的比例为3∶2～9∶1得化合物2。
本发明提供的两个新的萜类化合物具有NO抑制活性，可用于探索制备抗炎类药物的发展。
附图说明
图1本发明化合物1的1H NMR谱；
图2本发明化合物1的13C NMR谱；
图3本发明化物1的DEPT135谱；
图4本发明化合物1的HMQC谱；
图5本发明化合物1的HMBC谱；
图6本发明化合物1的1H-1H COSY谱；
图7本发明化合物1的NOE谱；
图8本发明化合物2的1H NMR谱；
图9本发明化合物2的13C NMR谱；
图10本发明化合物2的DEPT135的谱；
图11本发明化合物2的HMQC谱；
图12本发明化合物2的HMBC谱；
图13本发明化合物1和2的HMBC与1H-1H COSY相关信号图；
图14本发明化合物1和2的实验和(或)计算ECD谱；
图15本发明化合物1和2的结构式；
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
实施例1
(1)异叶三宝木的根部8kg粉碎，用甲醇提取3次(用量3×60L)，减压蒸馏回收提取液得到粗提物。
(2)将步骤(1)所得粗提物加水制成混悬液，用石油醚萃取，得石油醚萃取物；
(3)将步骤(2)中所得萃取物经硅胶柱进行梯度洗脱，将石油醚/丙酮作为流动相进行梯度洗脱，梯度分别为100∶0，100∶2，100∶4，100∶6，100∶9，100∶14，100∶20，100∶27。
(5)将步骤(4)中所得的组分经MPLC(中压液相色谱，色谱填料为ODS)分离，以甲醇和水为流动系统进行梯度洗脱得到3-4个组分，梯度范围是7∶3～9∶1。
(6)将步骤(5)中所得的组分经HPLC-RI(高效液相-示差检测)色谱分离，以甲醇/水为流动相，在以80％～90％的甲醇水溶液为流动相洗脱得到化合物1(8.5mg)和化合物2(12mg)。
根据化合物1和2的理化性质和波谱数据鉴定了其对应结构(化合物的波谱图见图1-图12)。
Heterophypene A(1)：无色油状；
ECD(CH3CN)196(Δε-11.8)nm；IR(film)vmaxcm-1：3079，2953，2854，1728，1635，1454，1436，1381，1442，983；1HNMR(400MHz，CDCl3)and13C NMR(100MHz，CDCl3)数据见表1；ESIMS m/z 300[M+H]+；HRESIMSm/z 301.2168[M+H]+，calcd for C20H28O5，301.2168。化合物的HMBC相关信号见图5。该化合物的绝对构型通过运用TDDFT(时间密度泛函理论)方法进行ECD(电子圆二色谱)计算确定，将实验测出的ECD谱图与计算得到的对映异构体的ECD图谱进行比较，确定了该化合物的绝对构型为5R，9S，10R，13R。ECD图谱见图13。
Heterophypene B(2)：无色油状；
ECD(CH3CN)204(Δε-3.0)nm；IR(film)vmaxcm-1：3447，2924，2856，1706，1636，1455，1279，1217，912，858；1H NMR(400MHz，CDCl3)and13C NMR(100MHz，CDCl3)数据见表1。ESIMS m/z 303[M+H]+；HRESIMS m/z303.2324[M+H]+，calcd for C20H27O3，303.2324。该化合物的绝对构型通过ECD确定。化合物2具有与化合物1相同的母核与同样的相对构型，且化合物1和2的ECD光谱中的Cotton效应几乎一致，从而确定该化合物的绝对构型为确定了该化合物的绝对构型为5R，9R，10R，13R。ECD图谱见图13。
Table 1化合物1和2的1H and13C NMR数据
实施例2
(1)异叶三宝木的根部10kg粉碎，用乙醇提取3次(用量3×60L)，减压蒸馏回收提取液得到粗提物。
(2)将步骤(1)所得乙醇粗提物溶于蒸馏水中，用乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂得到萃取物。
(3)将步骤(2)中所得萃取物经硅胶柱进行梯度洗脱，用TLC确定流动体系，将石油醚和丙酮作为流动相进行梯度洗脱，梯度分别为100∶0，100∶2，100∶5，100∶8，100∶12，100∶16，100∶22，100∶30。
(4)将步骤(3)中所得的组分经MPLC(中压液相色谱，色谱填料为ODS)分离，以甲醇和水为流动系统进行梯度洗脱得到3-4个组分，梯度范围是7∶3～9∶1。
(5)将步骤(4)中所得的组分经HPLC-RI(高效液相-示差检测)色谱分离，以甲醇/水为流动相，在以80％～90％的甲醇水溶液为流动相洗脱得到化合物1(3mg)和化合物2(10mg)。
化合物1和2的结构鉴定方法见实施例1。
实施例3
(1)异叶三宝木的根部8kg粉碎，用丙酮提取3次(用量3×60L)，减压蒸馏回收提取液得到粗提物。
(2)将步骤(1)所得乙醇粗提物溶于蒸馏水中，用乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂得到萃取物。
(3)将步骤(2)中所得萃取物经硅胶柱进行梯度洗脱，用TLC确定流动体系，将石油醚和丙酮作为流动相进行梯度洗脱，梯度分别为100∶2，100∶5，100∶8，100∶12，100∶15，100∶20，100∶28，100∶40。
(4)将步骤(3)中所得的组分经MPLC(中压液相色谱，色谱填料为ODS)分离，以甲醇和水为流动系统进行梯度洗脱得到3-4个组分，梯度范围是6∶4～9∶1。
(5)将步骤(4)中所得的组分经HPLC-RI(高效液相-示差检测)色谱分离，以甲醇/水为流动相，在以80％～90％的甲醇水溶液为流动相洗脱得到化合物1(4mg)和化合物2(15mg)。
化合物1和2的结构鉴定方法见实施例1。
实施例4
异叶三宝木中新化合物1和2的NO抑制活性测试。
(1)实验原理
NO与炎症、神经退行性疾病等密切相关，具有NO抑制活性的化合物，是潜在的治疗炎症、阿尔兹海默症、帕金森症等神经退行性疾病的药物。本实验通过建立BV-2细胞模型，此细胞在LPS的刺激下，产生NO；在LPS刺激的同时，加入受试化合物，评价化合物1-2的抑制NO活性，从而发现抗炎以及治疗神经退行性疾病的潜在药物。
(2)实验方法
①小鼠小胶质细胞BV-2的培养
以DMEM高糖培养基作为基础配制成内含10％胎牛血清及1％双抗(青霉素∶链霉素＝1∶1)细胞培养液，37℃，5％CO2培养箱培养，2～3天换液一次，至细胞基本铺满培养瓶瓶底，传代或实验处理。
②化合物的配制方法
待测化合物用DMSO溶解，配成母液，浓度为30mM，储存于-20℃。临用时用DMEM培养液将其进行稀释，依次稀释为10mM、5mM、3mM、1mM、0.1mM、0.01mM。
③待测化合物的细胞毒性
将对数生长期的细胞，调细胞密度为1×105个/mL，接种于96孔板，置于37℃，5％的培养箱中，培养24小时后，加不同浓度的待测化合物，20h后，观察细胞的存活情况，并用MTT法定量检测化合物对细胞的毒性，以确定化合物的测试浓度。
④化合物的NO抑制活性
将处于对数生长期的BV-2细胞，调细胞密度接种于96孔板(5×104细胞/孔)，培养24小时，待细胞完全贴壁后，加入不同浓度的待处理化合物，预处理30min后，加入LPS至终浓度为0.2μg/mL，继续培养24小时后，取50μL细胞培养上清液，分别加入50μL Griess试剂(A液∶B液＝1∶1，A液含有1％的磺胺，5％的磷酸，B液为0.1％的α-萘乙二胺二盐酸盐，A，B液需要避光保存)，按Griess法，于550nm波长下测吸光度值，根据吸光度值和标准曲线计算各化合物对NO的抑制率。
⑤统计方法
全部资料采用SPSS(13.0)统计软件包进行检验分析。结果用平均值±标准误表示，评价整体性差异，组间均数采用One-Way ANOVA分析法进行方差齐性分析，并结合Dunnett’s test分析方法进行组间比较。多样本方差齐性检验采用Levene检验，当p＞0.05，方差是齐的，采用Dunnett’s双侧T检验多组间均数的差异，当p＜0.05，方差不齐，采用Dunnett T3检验多组间均数的差异。
⑥IC50的计算方法
将各剂量和抑制率等参数用非线性回归拟合计算化合物抑制NO的IC50值。
(3)实验结果：化合物抑制NO的IC50值见表2。
表2新化合物1-2抑制NO的IC50值
a2-Methyl-2-thiopseudourea，sulfate(SMT)为阳性对照药物。
结果表明实施例1中所制备得到的新化合物1和2具有NO抑制活性。
Claims (10)
1.两种新的天然二萜化合物Heterophypene A(1)和Heterophypene B(2)，其特征在于：具有如下结构。
2.一种权利要求1所述新的二萜化合物的制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
(1)异叶三宝木(Trigonostemon heterophyllus Merr.)的根部用溶剂进行提取，回收提取液得到粗提物；
(2)将步骤(1)所得粗提物溶于蒸馏水中，用有机溶剂萃取，减压回收溶剂得到萃取物；
(3)将步骤(2)中所得萃取物经硅胶柱进行梯度洗脱，以石油醚/丙酮或石油醚/乙酸乙酯混合溶剂梯度洗脱；
(4)将步骤(3)中所得组分经薄层色谱进行点板合并，合并成7-8个组分；
(5)将步骤(4)中所得的组分经MPLC(中压液相色谱，色谱填料为ODS)分离，以甲醇和水为流动系统进行梯度洗脱得到不同组分；
(6)将步骤(5)中所得的组分经HPLC-RI(高效液相-示差检测)色谱分离，以甲醇/水为流动相洗脱，得到化合物1和2。
3.按照权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征在于：所述异叶三宝木为大戟科(Euphorbiaceae)三宝木属异叶三宝木(T.heterophyllus)根部的提取物。
4.按照权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的提取方法为加热回流提取1～3次，所用溶剂为石油醚、环己烷、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇中的至少一种，药材：溶剂的重量体积比为1∶5～1∶15。
5.按照权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征在于：步骤(2)所用有机溶液为石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿中的一种，按照水溶液和有机溶剂1∶1～1∶1.25的体积比进行萃取。
6.按照权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述洗脱溶剂石油醚/丙酮或石油醚/乙酸乙酯混合溶剂的比例为100∶2～100∶25。
7.按照权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述甲醇/水混合溶剂的比例为7∶3～9∶1，或乙腈/水混合溶剂比例为6∶4～9∶1。
8.按照权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征在于：步骤(6)中所述流动相甲醇/水或乙腈/水混合溶剂为流动相，流动相中混合溶剂的比例为3∶2～9∶1得化合物1；流动相中混合溶剂的比例为3∶2～9∶1得化合物2。
9.一种药物制剂，其包含有如权利要求1中所述的化合物或药学上可接受的盐和药学上可接受的辅料、稀释剂和载体。
10.权利要求1所述的天然产物在制备抗炎药物中的应用。
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JUN MA等: "Phytochemicals with NO inhibitory effects and interactions with iNOS protein from Trigonostemon howii", BIOORGANIC CHEMISTRY * |
| 李奕星: "异叶三宝木枝条的生物活性成分研究", 海南大学硕士学位论文 * |
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