CN111337583A - 口服余甘子鞣质部位后尿液中指标成分含量测定及20种代谢产物分离鉴定方法 - Google Patents

口服余甘子鞣质部位后尿液中指标成分含量测定及20种代谢产物分离鉴定方法 Download PDF

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CN111337583A CN201911160662.4A CN201911160662A CN111337583A CN 111337583 A CN111337583 A CN 111337583A CN 201911160662 A CN201911160662 A CN 201911160662A CN 111337583 A CN111337583 A CN 111337583A
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梁文仪
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Abstract

本发明涉及一种口服余甘子鞣质部位后化学物质检测方法，特别涉及口服余甘子鞣质部位后尿液中指标成分含量测定及13种原型物质和20种代谢产物分离鉴定方法。具有操作简便、分离效果好、峰形好、灵敏度高、精密度高、重现性好、稳定性好、代谢产物鉴定数量高等优点，是一种能够有效评价余甘子鞣质部位尿液途径代谢和排泄情况的可行性方法。

Description

口服余甘子鞣质部位后尿液中指标成分含量测定及20种代谢 产物分离鉴定方法
技术领域
本发明涉及一种口服余甘子鞣质部位后化学物质检测方法，特别涉及口服余甘子鞣质部位后尿液中指标成分含量测定及13种原型物质和20种代谢产物分离鉴定方法。
背景技术
药物在体内一般经过吸收、分布、代谢与排泄等一系列过程，药效、药效维持时间和毒副作用等与药物体内代谢与排泄过程紧密相关。研究药物的代谢与排泄规律，对于设计合理给药途径、给药剂量和指导临床应用有重要意义，也可以为其药效物质基础研究提供理论基础。尿液是药物排泄的主要途径之一，一般大部分代谢产物通过肾经尿液排出体外。
目前，国内外对余甘子鞣质部位、没食子酸（gaiilc acid，GA）、鞣花酸（ellagicacid，EA）、柯里拉京（corilagin）的生物活性已有众多报道，但对于它们在实验动物或人体的代谢和排泄研究相对较少，尚未发现有余甘子鞣质部位在尿液中代谢的相关研究。此外，由于代谢产物的量很少，分离鉴定代谢产物是具有挑战的工作。丁雯等人研究当归赤芍药对在大鼠尿液中代谢产物，检测到 7 个 GA 代谢产物。贺玉琢研究大鼠口服地榆提取物及鞣花鞣质组分，在尿液中检测到 EA 代谢物海狸香色素和没食子酸代谢物 3,4-二甲基没食子酸。现有方法分离鉴定出的GA、EA代谢产物数量较少，且没有可同时分离鉴定余甘子鞣质代谢物的方法。
发明内容
发明目的：本发明提供了一种口服余甘子鞣质部位后尿液中化学物质的检测方法，包括：尿液样品的处理方法，其指标性成分没食子酸、柯里拉京、鞣花酸在尿液中的含量测定方法，和可同时分离鉴定出尿液中13种原型物质和20种代谢产物的方法，具有操作简便、分离效果好、峰形好、灵敏度高、精密度高、重现性好、稳定性好、代谢产物鉴定数量高等优点，是一种能够有效评价余甘子鞣质部位尿液途径代谢和排泄情况的可行性方法。
技术方案：
本发明提供了一种口服余甘子鞣质部位后尿液中化学成分的检测方法，包括：
（1）尿液样品的处理，包括：
精密量取尿液样品，稀释，精密量取稀释后尿液，加入内标物质溶液混合，加入一定量有机溶剂沉淀去除尿液中蛋白及杂质，萃取，分离取有机相，进样前，微孔滤膜过滤；
空白尿液按同样方法处理；
（2）指标性成分没食子酸（GA）、柯里拉京（corilagin）、鞣花酸（EA）在尿液中的含量检测，包括：
对照品溶液的配制：精密称取 GA 、corilagin、EA、内标物质，使用有机溶剂溶解定容配制一定浓度的GA、corilagin、EA、内标物质对照品溶液，储存，备用。
绘制标准曲线：精密吸取空白尿液样品，加入适量的 GA、corilagin 和 EA 系列浓度对照品溶液配制系列尿液样品，按照步骤（1）中尿液样品的处理方法处理后进 HPLC色谱仪；各成分与内标的峰面积比值为纵坐标（Y），目标成分浓度为横坐标（X），用加权最小二乘法计算回归方程及相关系数（r）；
尿液样品测定：经步骤（1）处理方法处理后的尿液样品进 HPLC 色谱仪；根据标准曲线，计算大鼠尿液样品中 GA、corilagin、EA的浓度，浓度乘以尿液体积计算得不同时间段尿液中 GA、 corilagin、EA 的排泄量；
色谱条件：色谱柱为C18色谱柱；和/或柱温 28-32℃；和/或流速：0.8-1.2 ml·min-1；和/或检测波长：268-272nm；和/或流动相：甲醇 - 0.2 % 冰醋酸/水梯度洗脱：0-15min 5-17%甲醇，15-22min 17-17%甲醇，22-35min 17-30%甲醇，35-55min 30-60%甲醇，55-65min60-90%甲醇，65-70min 90-5%甲醇；
（3）HPLC-MS同时分离鉴定尿液中原型成分和代谢产物的方法：
尿液样品预处理：按步骤（1）的方法进行；
色谱条件：同步骤（2）中色谱条件；
质谱条件：ESI：负离子模式；雾化气流： 1.20-1.80 L·min-1；离子源温度：280-320℃；干燥气压力：80-120kPa；质量扫描范围：m/z 100～1500；
分析指认确定成分：提取碎片离子，得到碎片的质谱图和裂解碎片数据，与参考文献数据进行对比分析，指认确定成分。
优选的，口服余甘子鞣质部位含药尿液中指认了 33 个成分，其中13个原型成分，20个代谢产物。
优选的，有机溶剂的种类为乙腈、二甲基亚砜、甲醇或其水溶液；更优选的，使用30-70%甲醇稀释和/或使用甲醇沉淀去除尿液中蛋白及杂质，萃取。
优选的，内标物质为苯甲酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸、咖啡酸；更优选的，内标物质为对羟基苯甲酸。
优选的，对照品溶液的配制：
GA对照品溶液：精密称取GA用50 %甲醇定容配制2-6 mg·mL-1 GA对照品溶液。
corilagin 对照品溶液：精密称取 corilagin用50%甲醇定容配制0.2-0.5mg·mL-1 corilagin 对照品溶液。
EA对照品溶液：精密称取 EA 用二甲基亚砜定容配制0.4-0.8 mg·mL-1 EA 对照品溶液。
对羟基苯甲酸溶液：精密称取对羟基苯甲酸用50 %甲醇定容配制0.1-0.3 mg·mL-1对羟基苯甲酸对照品溶液。
优选的，口服余甘子鞣质部位中 GA 和 EA给药剂量分别为 250-400mg·kg-1。
优选的，尿液样品预处理：精密量取大鼠尿液样品，30-70%甲醇稀释 5-20 倍；精密吸取稀释后大鼠尿液 200-1000 μL，加入 20-200 μL对羟基苯甲酸溶液，混合充分，然后加入400-6000μL 甲醇进行萃取，混匀，10000 -30000r·min-1离心，分取上层有机相，进样前微孔滤膜过滤，记录色谱图。空白尿液按同样方法处理。
优选的，色谱条件为：色谱柱：Diamonsil C18 （250 × 4.6 mm，5 μm）；
和/或，保护柱，优选的为Dikma；
和/或，柱温：30 ℃；
和/或，流动相：甲醇 - 0.2 % 冰醋酸/水；
Figure RE-165160DEST_PATH_IMAGE001
和/或，流速：1 mL·min-1；
和/或，检测波长：270 nm。
优选的，绘制标准曲线时，GA采用0.2-150μg ·mL-1浓度范围内系列浓度；corilagin采用0.3-20μg ·mL-1浓度范围内系列浓度；EA采用0.3-20μg ·mL-1浓度范围内系列浓度。
优选的，质谱条件：ESI：负离子模式；雾化气流：1.50 L·min-1；离子源温度：300℃；干燥气压力：100kPa；质量扫描范围：m/z 100～1500。
优选的，为大鼠口服。
优选的，将余甘子鞣质部位含药尿液与余甘子鞣质部位供试品总离子流图和空白尿液总离子流图的保留时间和质谱裂解碎片数据对比分析提取碎片离子，得到碎片的质谱图和裂解碎片数据对比分析。口服余甘子鞣质部位含药尿液中指认了 33 个成分，其中13个原型成分，20个代谢产物。
有益效果：
本实验建立了测定大鼠尿液样品中 GA、corilagin 和 EA 浓度的HPLC 检测方法，并对其进行了方法学验证。方法学考察结果均符合《中国药典》第三部附录中生物样品分析方法的基本要求，该方法简便、快速、重现性好，可以用来准确测定大鼠尿液样品中的 GA、corilagin 和 EA 的浓度。首次建立可同时分离鉴定口服余甘子鞣质部位后尿液中化学成分的HLPC-MS方法，指认了 33 个成分，其中13个原型成分，20个代谢成分，鉴定数量高，为余甘子鞣质部位尿液途径代谢和排泄研究提供一种可靠地分析方法。
附图说明
图1 大鼠尿液HPLC色谱图 A.空白尿液；B.空白尿液加入对照品；C.余甘子鞣质部位8 h含药尿液；D. GA 2 h含药尿液；E. EA 2 h含药尿液（1.GA；2.对羟基苯甲酸；3.corilagin；4. EA）
图2尿液中GA标准曲线
图3尿液中corilagin标准曲线
图4尿液中EA标准曲线
图5大鼠灌胃余甘子鞣质部位96 h内含药尿液色谱图（1.GA；2.对羟基苯甲酸；3.corilagin；4. EA）
图6大鼠灌胃余甘子鞣质部位后96 h内尿液中GA、corilagin和EA平均累积排泄量-时间曲线（n=6）
图7大鼠灌胃余甘子鞣质部位中GA、corilagin和EA口服量与尿液排泄量柱形图
图8 HPLC-MSn总离子流图（75 min）A.余甘子鞣质部位；B.空白尿液；C.余甘子鞣质含药尿液；D.GA含药尿液；E.EA含药尿液图
图9 HPLC-MSn总离子流图（51 min）A.余甘子鞣质部位；B.空白尿液；C.余甘子鞣质含药尿液；D.GA含药尿液；E.EA含药尿液图
图10-14余甘子鞣质部位中44个成分质谱图
图15-17余甘子鞣质部位含药尿液中33个成分质谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例和附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
1 仪器与试药
仪器：Waters 1525 高效液相色谱仪（二元泵、Waters 2996 紫外检测器，美国Waters）；Thermo 高效液相色谱-质谱联用仪（LTQ-Orbitrap XL HPLC-MS，ThermoFisher公司）；十万分之一电子天平（型号：Sartorious BT 25S，北京赛多利斯仪器有限公司）；高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；涡旋混合器（上海沪西分析仪器厂）；100-1000 移液枪（Eppendorf）；超声波清洗仪（昆山超声仪器有限公司，型号：KQ-500DE）；低温储存冰箱。
试药：余甘子药材购自北京藏医院，产地尼泊尔，经北京中医药大学阎玉凝教授鉴定为大戟科植物 Phyllanthus emblica L. 的干燥成熟果实。
GA（纯度 98 %，批号：20140401）购自上海源叶生物科技有限公司；corilagin（纯度 98 %，批号：MUST-13051301）购自成都曼斯特生物科技有限公司；EA（纯度98 %，批号：MUST-14031010）购自成都曼斯特生物科技有限公司；对羟基苯甲酸（纯度 98 %，批号：99-96-7）购自南京景竹生物科技有限公司；甲醇（色谱纯，Fisher 公司）；冰乙酸（色谱纯，批号：20140412，天津市丰越化学品有限公司）；屈臣氏纯净水；其他试剂为分析纯。
实验动物：雄性正常 Sprague-Dawley 大鼠，体重为 220-250 g，北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物使用许可证号：SCXK（京）2012-0001。动物饲养在北京中医药大学动物实验中心 SPF 级动物房中，自由进食进水，保持 12 h 避光，12 h 光照循环饲养，室内温度为 22 ± 1 ℃，相对湿度在 40 %左右，适应性喂养 4天后开始实验。实验前禁食 12 h ，自由饮水。
2 指标性成分没食子酸（GA）、柯里拉京（corilagin）、鞣花酸（EA）在尿液中的含量检测方法与结果
2.1 余甘子鞣质部位的制备
按照前期建立的余甘子鞣质部位制备工艺和含量测定方法制备余甘子鞣质部位和测定总鞣质、GA、corilagin、EA 含量，总鞣质含量为 54.17 %，GA、corilagin、EA的质量分数分别为：4.54 %、1.61 %、3.67 %。
2.2 对照品溶液的配制
GA对照品溶液：精密称取 GA 40.23 mg，50 %甲醇定容于 10 mL棕色容量瓶，即得4.023 mg·mL-1 GA对照品溶液，于-4 ℃冰箱中储存，备用。
corilagin 对照品溶液：精密称取 corilagin 3.01 mg，50 %甲醇定容于 10 mL棕色容量瓶，即得 0.3010 mg·mL -1 corilagin 对照品溶液，于-4 ℃冰箱中储存，备用。
EA对照品溶液：精密称取 EA 6.06 mg，二甲基亚砜定容于 10 mL棕色容量瓶，即得 0.6060 mg·mL -1 EA 对照品溶液，于-4 ℃冰箱中储存，备用。
对羟基苯甲酸溶液：精密称取对羟基苯甲酸 2.08 mg，50 %甲醇定容于 10 mL棕色容量瓶，即得 0.2080 mg·mL -1对羟基苯甲酸对照品溶液，于-4 ℃冰箱中储存，备用。
2.3 动物给药与尿液样品收集
余甘子鞣质水溶液给药剂量为 8 g·kg -1，根据 GA 和 EA 在余甘子鞣质部位中的质量分数，计算得大鼠口服余甘子鞣质部位中 GA 和 EA 含量分别为 90.80 mg 和73.40mg，即给药剂量分别为 363.20 mg·kg -1和 293.60 mg·kg-1。18 只 Sprague-Dawley 大鼠随机平均分为 3 组，每组 6 只，正常饲养 4 天，实验前12 小时禁食，自由饮水。大鼠置于代谢笼中饲养，收集空白尿液。按 8 g·kg -1剂量灌胃给予余甘子鞣质水溶液、363.20 mg·kg -1剂量灌胃给予 GA水溶液、293.60 mg·kg -1剂量灌胃给予 EA水溶液，于给药后 0 ~ 2、2 ~ 4、4 ~ 8、8 ~ 12、12 ~ 24、24 ~ 36、36 ~48、48 ~ 60、60 ~ 72、72 ~96 h 收集尿液。收集时代谢笼边缘及粪便表面的残余尿液用少量生理盐水仔细冲洗至收集管中，与原尿液混合均匀。记录尿液体积，尿液样品迅速保存在-20 ℃冰箱中，备用。
2.4 尿液样品预处理
2.4.1预处理方法考察
实验中对生物样品的预处理方法进行了考察，余甘子鞣质部位化学成分主要为可水解鞣质和酚酸类化合物，极性较大，不适合液-液萃取其有效成分。利用固相萃取小柱对于除掉水溶性杂质效果较好，但是，鞣质部位中大极性的成分会损失严重，所以，本实验采取沉淀法去除蛋白及杂质。
考察了乙腈和甲醇两种有机溶剂去除蛋白和杂质，结果乙腈和甲醇除杂效果差不多，考虑到价格问题，优选甲醇。
实验中考察了尿液中甲醇加入量，尿液样品中蛋白含量较少，考察了加入一倍量、二倍量和四倍量体积的甲醇，发现二倍量甲醇及以上可以使杂质沉淀完全，因此尿液样品选择加入二倍量甲醇。
2.4.2预处理方法确定
精密量取大鼠尿液样品，50 %甲醇稀释 10 倍。
精密吸取稀释后大鼠尿液 500 μL，加入 60 μL对羟基苯甲酸溶液，涡旋混合 3min使充分混匀，然后加入 1000 μL 甲醇进行萃取，萃取时间 5 min，涡旋混匀，4 ℃恒温下以 10000 r·min -1离心 10 min，分取上层有机相转移至新空白 EP 管中，过 0.45 μm微孔滤膜，取 20 μL进高效液相色谱仪，记录色谱图。空白尿液按同样方法处理。
2.5 色谱条件
色谱柱：Diamonsil C18 （250 × 4.6 mm，5 μm）；
保护柱：Dikma；柱温：30 ℃；
流动相：甲醇 - 0.2 % 冰醋酸/水；
流速：1 mL·min -1；检测波长：270 nm。
表 1 测定尿液中成分流动相梯度
Figure RE-6209DEST_PATH_IMAGE002
2.6 尿液中 GA、corilagin 和 EA分析方法学的建立与验证
2.6.1 专属性试验
取大鼠空白尿液样品，按“2.4 尿液样品预处理”方法进行处理，得到空白尿液样品图谱（图1A）；将一定浓度的 GA、corilagin 和 EA的对照品溶液和内标物对羟基苯甲酸加入大鼠空白尿液中，依法操作，得到相应谱图（图1B）；以及大鼠给药后的实际尿液谱图（图1C、图1D、图1E），将上述图谱进行比较。结果表明，在此分析条件下，尿液中内源性物质不干扰GA、corilagin、EA的检测，被测物峰形、分离度良好。
2.6.2 线性范围与灵敏度
精密吸取空白尿液样品，加入适量的 GA、corilagin 和 EA 系列浓度对照品溶液，配置成相当于 GA 0.3143、0.6286、3.143、6.286、18.86、37.71、75.43、113.1、125.7μg·mL-1，corilagin 0.4703、0.9406、2.822、5.644、11.29、16.93、18.81 μg·mL -1，EA 0.4734、0.9469、2.841、5.681、11.36、17.04、18.94 μg·mL -1的尿液样品。按“2.3 尿液样品预处理”方法处理后进 HPLC 色谱仪。各成分与内标的峰面积比值为纵坐标（Y），目标成分浓度为横坐标（X），用加权最小二乘法计算回归方程及相关系数（r）。大鼠尿液中 GA、corilagin和 EA 的标准曲线方程，相关系数、线性范围、LLOQ 见表 5，标准曲线的相关系数均大于0.9955。GA、corilagin 和 EA 的线性关系考察见表 2、图 2、表 3、图 3、表 4、图 4。
表2尿液中GA线性关系考察结果（n = 3）
Figure RE-250108DEST_PATH_IMAGE003
表3尿液中corilagin线性关系考察结果（n = 3）
Figure RE-439781DEST_PATH_IMAGE004
表4尿液中EA线性关系考察结果（n = 3）
Figure RE-668767DEST_PATH_IMAGE005
表5 GA、corilagin和EA在尿液中的标准曲线
Figure RE-297194DEST_PATH_IMAGE006
2.6.3 精密度与准确度
取空白尿液样品，加入适量的对照品溶液，配制 GA、corilagin、EA 三者的低、中、高三个浓度的尿液 QC 样品。按“2.4 尿液样品预处理”方法处理后进 HPLC 色谱仪。每个浓度进行 6 样本分析，计算日内精密度和准确度。重复操作，连续测定 3 天并随行标准曲线，计算日间精密度和准确度，结果见表 6。结果显示，GA、corilagin、EA的日内精密度 RSD ≤4.73 %、5.27 %和 5.48 %；日间精密度的 RSD ≤ 4.65 %、4.81 %和 4.65 %；GA、corilagin、EA 的准确度分别在93.53 % ~ 105.02 %、92.56 % ~105.02 %和 93.10 % ~103.95 %之间，表明，GA、corilagin 和 EA 的低、中、高浓度质控样品的准确度和精密度均符合目前生物样品分析方法指导原则的有关规定。
表6 GA、corilagin和EA尿液低、中、高浓度质控样品的精密度与准确度（n = 6）
Figure RE-411912DEST_PATH_IMAGE007
2.6.4 回收率试验
取空白尿液样品，加入适量的对照品溶液，配制 GA、corilagin、EA 三者的低、中、高三个浓度的 QC 样品，按“2.4.2尿液样品预处理”方法处理后进 HPLC 色谱仪。每个浓度进行6 样本分析，记录色谱峰面积，与未经处理的相应浓度的对照品溶液的峰面积比较，计算GA、corilagin、EA的尿液提取回收率，结果见表7。结果显示，GA 尿液质控样品的提取回收率≥ 94.36 %，RSD ≤ 5.37 %；corilagin 尿液质控样品的提取回收率≥ 92.28 %，RSD≤ 4.44 %；EA尿液质控样品的提取回收率≥91.20 %，RSD ≤ 3.72 %；内标的尿液提取回收率≥ 97.73 %，RSD ≤ 4.61 %。
表7 GA、corilagin、EA和内标在尿液中的提取回收率（%）（n = 6，mean ±SD）
Figure RE-772486DEST_PATH_IMAGE008
2.6.5 稳定性试验
取空白尿液样品，加入适量的对照品溶液，配制 GA、corilagin、EA 三者的低、中、高三个浓度的 QC 样品。将已知浓度的质控样品于室温下放置 24 h 测定；在冻融循环试验中，将质控样品置于-80 ℃下 24 h，然后取出于室温下自然融解后，再置于-80 ℃下冷冻 24h，如此反复至少 3 次后对样品进行测定；长期稳定性试验中，将质控样品于-80 ℃下保存30 d 后进行测定，结果见表 8、表 9 和表 10。结果显示，GA、corilagin 与 EA 在上述保存条件下 RSD ≤ 7.33 %。表明尿液样品在室温放置 24 h 或-80 ℃保存 30天或三周期冻融条件下，这三个被测组分仍可以被准确测定。
表8 GA尿液低、中、高浓度QC样品的稳定性考察（n = 3）
Figure RE-159605DEST_PATH_IMAGE009
表9 corilagin尿液低、中、高浓度QC样品的稳定性考察（n = 3）
Figure RE-591723DEST_PATH_IMAGE010
表10 EA尿液低、中、高浓度QC样品的稳定性考察（n = 3）
Figure RE-482319DEST_PATH_IMAGE011
2.7 尿液样品测定与排泄研究结果
按“2.4.2尿液样品预处理”项下方法操作，每个分析批制备一条随行标准曲线，根据随行标准曲线，计算大鼠尿液样品中 GA、corilagin、EA的浓度，浓度乘以尿液体积计算得不同时间段大鼠尿液中 GA、 corilagin、EA 的排泄量，已知这三者的灌胃给予量，求得 GA、corilagin、EA的排泄率及累积排泄率。
2.7.1 余甘子鞣质部位尿液排泄研究结果
大鼠口服余甘子鞣质部位后 96 h 内尿液样品色谱图见图5。测得大鼠含药尿液样品中 GA、corilagin、EA与内标物对羟基苯甲酸的峰面积之比，根据标准曲线方程计算得含药尿液中 GA、corilagin、EA的浓度，并根据收集的尿液体积分别计算出大鼠灌胃给药余甘子鞣质部位后 GA、corilagin、EA 在尿液中的排泄量及累积排泄量，有关数据见表11、表 12，GA、corilagin、EA 尿液累积排泄量-时间曲线见图 6，大鼠口服余甘子鞣质部位中 GA、corilagin、EA 口服量与尿液排泄量对比图见图 7。灌胃给药余甘子鞣质部位后，GA、corilagin 和 EA在大鼠尿液中的 96 h 内累积排泄量分别为 22437.19 μg、942.38 μg、669.06 μg，累积排泄率依次为 24.71 %、2.94 %、0.91 %。GA、corilagin 和 EA 在尿液排泄迅速，说明其不易在肾脏蓄积产生肾毒性。
表11大鼠灌胃给药余甘子鞣质部位后尿液中GA、corilagin和EA的排泄量数（n=6）
Figure RE-590958DEST_PATH_IMAGE012
表12大鼠灌胃余甘子鞣质部位后GA、corilagin、EA在尿液中的排泄率
Figure RE-262111DEST_PATH_IMAGE013
3 HPLC-MS同时分离鉴定出 13种原型成分和20种尿代谢产物的方法与结果
3.1 供试液的制备
称取余甘子鞣质部位粉末大约 15 mg ，50 % 甲醇定容于10 mL棕色容量瓶，浓度为1.5 mg·mL -1，摇匀备用。进样前摇匀，经 0.22 μm 的微孔滤膜过滤。
3.2 动物给药与尿液样品采集
方法同“2.3动物给药与尿液样品采集”
3.3 尿液样品预处理
方法同“2.4尿液样品预处理”
3.4 实验条件
3.4.1 色谱条件
色谱条件同“2.5.1 色谱条件”
3.4.2 质谱条件
ESI：负离子模式；雾化气流：1.50 L·min -1 ；离子源温度：300 ℃；
干燥气压力：100 kPa；质量扫描范围：m/z 100～1500。
3.5 余甘子鞣质部位及其 GA、EA尿液代谢产物分析结果
采用 HPLC-MS n 法对大鼠含药尿液样品、空白尿样及余甘子鞣质部位进行成分分析。采集的各个样品的总离子流色谱图，见图8。总离子流图显示，保留时间在 55min左右存在强度、峰形、保留时间基本一致的干扰，推测由某种系统误差引起，故对保留时间 0 ~ 51min 内的成分进行了分析，见图9，归属大鼠含药尿液中各个成分的来源。
3.5.1 余甘子鞣质部位成分分析
通过提取余甘子鞣质部位的碎片离子，得到碎片的质谱图和裂解碎片数据，同时与参考文献数据进行对比分析，指认了 44 个成分，初步推测出 32 个成分的结构，结果见表13，余甘子鞣质部位中 44个成分质谱图见图10-14。
表13余甘子鞣质部位成分的质谱数据
Figure RE-310969DEST_PATH_IMAGE014
Figure RE-321651DEST_PATH_IMAGE015
采用 HPLC-MS n 分析方法初步鉴定出余甘子鞣质部位中 32 个成分，主要分为 3类，其中可水解鞣质类 12 个：chebulic acid、mallonin、geraniin、putranjivain A 、Tercatain （或 MLT-4 ）、 MLT-1 、 elaeocarpusin 、 trigalloylglucose 、 corilagin、trigalloylglucose、tetragalloylglucose 、chebulic acid；粘酸类 7 个：mucic acid、mucic acid gallate 、 mucic acid-1,4-lactone-2-O-gallate （或 mucic acid-1,4-lactone-3-O-gallate）、mucic acid lactone 、mucic acid-2,5-di-O-gallate、mucicacid dimethyl ester-2-O-gallate、mucic acid dimethyl ester-2-O-gallate；酚酸类12个：gallic acid 、ellagic acid hexose 、cinamic acid 、ellagic acid deoxyhexose、ellagic acid 、multifidol glucoside 、digalloyl-HHDP-glucose、 3,6-di-galloylglucose（或 1(β)-6-di-O-galloyl-β-D-glucose）、3,6-di-galloylglucose（或 1(β)-6-di-O-galloyl-β-D-glucose）、3,6-di-galloylglucose（或1(β)-6-di-O-galloyl-β-D-glucose）、 galloyl glucose、galloyl glucose 。
3.5.2 大鼠含药尿液成分分析
将余甘子鞣质部位含药尿液、GA 含药尿液、EA 含药尿液与余甘子鞣质部位供试品总离子流图和空白尿液总离子流图的保留时间和质谱裂解碎片数据对比分析，见图9。
3.5.2.1 余甘子鞣质部位含药尿液成分分析
余甘子鞣质部位含药尿液中指认了 33 个成分，见表14，质谱图见图15-17。13个原型成分中有 2 个可水解鞣质类：chebulic acid 和 corilagin；3 个粘酸类：mucic acid、mucic acid gallate、mucic acid lactone；7 个酚酸类：gallic acid、malic acidgallate 、 6-O-galloyl-D-glucose 、 3,6-digalloyl-D-glucose 、 ferulic acid 、ellagic acid hexose、ellagic acid；1个有机酸：malic acid。除此之外，还推测出 20个代谢成分，其中 1 个粘酸类：mucic acid methyl ester gallate；16 个酚酸类成分：derivative of gallic acid、3,4-dihydroxybenzoic acid or 4,5-dihydroxybenzoicacid or 3,5-dihydroxybenzoic acid 、 3,4-dihydroxy phenylacetic acid 、pyrogallol-1-O-glucuronide or pyrogallol-2-O-glucuronide、pyrogallic acid、methyl gallic acid、methyl gallic acid、methyl gallic acid、dimethoxygallic acidglucuronide 、 5-(3’,4’,5’-trihydroxyphenyl)-γ-valerolactone 、combination ofgallic acid and glycine 、derivative of methylpyrogallic acid、gallic acidsulfate、gallic acid isomer、gallic acid glucuronide、derivative of catechin，大多为 GA的衍生物；3个尿石素类：urolithin C、 urolithin A glucuronide 、urolithin Bglucuronide，均为 EA的菌群代谢物。
表14灌胃给药余甘子总鞣质后大鼠尿液中原型成分及代谢产物的初步鉴定
Figure RE-601191DEST_PATH_IMAGE016
Figure RE-697323DEST_PATH_IMAGE017
余甘子鞣质部位中指认了32个成分，包括 12个可水解鞣质、11个酚酸和7个粘酸成分，经大鼠口服体内代谢后，在尿液中检测到 13个原型成分，20个代谢产物均为尿石素类衍生物和酚酸类化合物，提示余甘子鞣质部位在体内发生了广泛的水解和代谢。
4.结论
本发明建立了口服余甘子鞣质部位后尿液样品的处理方法，其指标性成分没食子酸、柯里拉京、鞣花酸在尿液中的HLPC含量测定方法，和可同时分离鉴定出13 种原型成分、20种尿液代谢产物的方法，具有操作简便、灵敏度高、精密度高、重现性好、稳定性好、代谢产物鉴定数量高等优点，为余甘子鞣质部位尿液途径代谢和排泄研究提供一种可靠地分析方法。

Claims (10)

1.一种口服余甘子鞣质部位后尿液中化学成分的检测方法，包括：
（1）尿液样品的处理，包括：
精密量取尿液样品，稀释，精密量取稀释后尿液，加入内标物质溶液混合，加入一定量有机溶剂沉淀去除尿液中蛋白及杂质，萃取，分离取有机相，进样前，微孔滤膜过滤；
空白尿液按同样方法处理；
（2）指标性成分没食子酸（GA）、柯里拉京（corilagin）、鞣花酸（EA）在尿液中的含量检测，包括：
对照品溶液的配制：精密称取 GA 、corilagin、EA、内标物质，使用有机溶剂溶解定容配制一定浓度的GA、corilagin、EA、内标物质对照品溶液，储存，备用；
绘制标准曲线：精密吸取空白尿液样品，加入适量的 GA、corilagin 和 EA 系列浓度对照品溶液配制系列尿液样品，按照步骤（1）中尿液样品的处理方法处理后进 HPLC 色谱仪；各成分与内标的峰面积比值为纵坐标（Y），目标成分浓度为横坐标（X），用加权最小二乘法计算回归方程及相关系数（r）；
尿液样品测定：经步骤（1）处理方法处理后的尿液样品进 HPLC 色谱仪；根据标准曲线，计算大鼠尿液样品中 GA、corilagin、EA的浓度，浓度乘以尿液体积计算得不同时间段尿液中 GA、 corilagin、EA 的排泄量；
色谱条件：色谱柱为C18色谱柱；和/或柱温 28-32℃；和/或流速：0.8-1.2 ml·min-1 ；和/或检测波长：268-272nm；和/或流动相：甲醇 - 0.2 % 冰醋酸/水梯度洗脱：0-15min 5-17%甲醇，15-22min 17-17%甲醇，22-35min 17-30%甲醇，35-55min 30-60%甲醇，55-65min60-90%甲醇，65-70min 90-5%甲醇；
（3）HPLC-MS同时分离鉴定尿液中原型成分和代谢产物的方法：
尿液样品预处理：按步骤（1）的方法进行；
色谱条件：同步骤（2）中色谱条件；
质谱条件：ESI：负离子模式；雾化气流： 1.20-1.80 L·min-1 ；离子源温度：280-320℃；干燥气压力：80-120kPa；质量扫描范围：m/z 100～1500；
分析指认确定成分：提取碎片离子，得到碎片的质谱图和裂解碎片数据，与参考文献数据进行对比分析，指认确定成分。
2.如权利要求1所述的方法，口服余甘子鞣质部位含药尿液中指认了 33 个成分，其中13个原型成分，20个代谢产物。
3.如前述任一项权利要求所述的方法，所述内标物质为苯甲酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸、咖啡酸；优选的，内标物质为对羟基苯甲酸。
4.如前述任一项权利要求所述的方法，所述有机溶剂的种类为乙腈、二甲基亚砜、甲醇或其水溶液。
5.如前述任一项权利要求所述的方法，步骤（1）中使用30-70%甲醇稀释，和/或使用甲醇沉淀去除尿液中蛋白及杂质，萃取。
6.如前述任一项权利要求所述的方法，其中沉淀去除尿液中蛋白及杂质的有机溶剂的用量为精密吸取的稀释后尿液的用量的2-6倍。
7.如前述任一项权利要求所述的方法，色谱条件为：色谱柱：Diamonsil C18 （250 ×4.6 mm，5 μm）；
和/或，保护柱，优选的为Dikma；
和/或，柱温：30 ℃；
和/或，流动相：甲醇 - 0.2 % 冰醋酸/水；
Figure 584249DEST_PATH_IMAGE001
和/或，流速：1 mL·min-1 ；
和/或，检测波长：270 nm。
8.如前述任一项权利要求所述的方法，其中质谱条件：ESI：负离子模式；雾化气流：1.50 L·min-1 ；离子源温度：300 ℃；干燥气压力：100kPa；质量扫描范围：m/z 100～1500。
9.如前述任一项权利要求所述的方法，GA、corilagin、对羟基苯甲酸对照品溶液用50%甲醇定容配制；EA对照品溶液用二甲基亚砜定容配制。
10.如前述任一项权利要求所述的方法，绘制标准曲线时，GA采用0.2-150μg ·mL-1浓度范围内系列浓度；corilagin采用0.3-20μg ·mL-1浓度范围内系列浓度；EA采用0.3-20μg·mL-1浓度范围内系列浓度。
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