CN111289635A - 口服余甘子鞣质部位后胆汁中指标成分含量测定及30种化学成分分离鉴定方法 - Google Patents

口服余甘子鞣质部位后胆汁中指标成分含量测定及30种化学成分分离鉴定方法 Download PDF

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梁文仪
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Abstract

本发明提供一种口服余甘子鞣质部位后胆汁中化学物质的检测方法，包括：胆汁样品采集；胆汁样品预处理；指标性成分没食子酸、柯里拉京、鞣花酸在胆汁中的含量测定方法；和可同时分离鉴定出胆汁中6种原型成分和24种代谢产物的方法。具有分离度好，简便准确，灵敏度高，重现性好，分离鉴定数量多等优点，能够有效评价口服余甘子鞣质部位在胆汁的代谢和排泄规律。

Description

口服余甘子鞣质部位后胆汁中指标成分含量测定及30种化学 成分分离鉴定方法
技术领域
本发明涉及一种口服余甘子鞣质部位后化学物质检测方法，特别涉及口服余甘子鞣质部位后胆汁中指标成分含量测定及30种化学成分分离鉴定方法。
背景技术
药物吸收进入体内后，通常经过分布、代谢与排泄过程。药物经体内代谢生成具有活性或产生新的生物活性的代谢产物，有的药物本身无活性，生成具有活性的代谢产物才能发挥药效。如果活性成分的代谢速度快，在体内很快消除，则药物的疗效就很难发挥应有的药效。胆汁排泄是入血成分在体内消除时间长短的重要因素，影响着药物的血药浓度、药效、药效维持时间长短以及是否出现毒性等。研究药物的代谢与排泄规律，对于设计合理给药途径、给药剂量等有重要意义。
余甘子富含鞣质成分，具有抗氧化、抗炎、抗癌和降血糖等生物活性，成为国内外研究的热点。然而截止目前，尚未发现研究口服余甘子鞣质部位后在胆汁中代谢、排泄的相关报道。此外，由于代谢产物的量很少，分离鉴定代谢产物尤其同时分离鉴定多种代谢产物存在困难。因此，需要一种能够有效评价口服余甘子鞣质部位在胆汁的代谢和排泄规律的检测方法。
发明内容
发明目的：本发明提供一种口服余甘子鞣质部位后胆汁中化学物质的检测方法，包括：胆汁样品采集；胆汁样品预处理；指标性成分柯里拉京（corilagin）、鞣花酸（EA）在胆汁中的含量测定方法；和可同时分离鉴定出胆汁中6种原型成分和24种代谢产物的方法。具有分离度好，简便准确，灵敏度高，重现性好，分离鉴定数量多等优点，能够有效评价口服余甘子鞣质部位在胆汁的代谢和排泄规律。
技术方案：
本发明提供了一种口服余甘子鞣质部位后胆汁中化学成分的检测方法，包括：
（1）动物给药与胆汁样品采集；
（2）胆汁样品预处理，包括：
精密吸取大鼠胆汁，加入内标溶液，涡旋混合，加入有机溶剂萃取，离心，取上层有机相，进高效液相色谱仪前过微孔滤膜，记录色谱图；
空白胆汁按同样方法处理；
（3） 指标性成分柯里拉京（corilagin）、鞣花酸（EA）在胆汁中的含量检测，包括：
按步骤（2）方法操作，每个分析批制备一条随行标准曲线，根据随行标准曲线，计算大鼠胆汁样品中corilagin、EA浓度，用浓度乘以胆汁体积后计算不同时间段大鼠胆汁中corilagin、EA的排泄量；
色谱条件：色谱柱为C18色谱柱；和/或柱温 28-32℃；和/或流速：0.8-1.2 ml·min-1；和/或检测波长：268-272nm；和/或流动相：甲醇 - 0.2 % 冰醋酸/水梯度洗脱：0-15min 5-25%甲醇，15-20min 25-25%甲醇，20-30min 25-30%甲醇，30-60min 30-60%甲醇，60-65min60-90%甲醇，65-70min 90-5%甲醇；
（4）HPLC-MS同时分离鉴定胆汁中原型成分和代谢产物的方法：
动物给药与胆汁样品采集，同步骤（1）；
胆汁样品预处理：同步骤（2）；
色谱条件：同步骤（3）；
质谱条件：ESI：负离子模式；雾化气流： 1.30-1.70 L·min-1；离子源温度：280-320℃；干燥气压力：80-120kPa；质量扫描范围：m/z 100～1500；
分析指认确定成分：提取碎片离子，得到碎片的质谱图和裂解碎片数据，对比分析，指认确定成分。
优选的，口服余甘子鞣质部位含药胆汁中确定了6 个原型成分，24个代谢产物。
优选的，内标物质为苯甲酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸、咖啡酸；更优选的，内标物质为对羟基苯甲酸。
优选的，步骤（2）中的有机溶剂的种类为乙腈或甲醇。
优选的，步骤（2）中的有机溶剂的用量为胆汁用量的2-6倍。
优选的，标准曲线制备方法为：精密吸取空白胆汁样品，加入适量的 corilagin和 EA 系列浓度对照品溶液配制系列胆汁样品，按照步骤（2）中胆汁样品预处理方法处理后进 HPLC 色谱仪；各成分与内标的峰面积比值为纵坐标（Y），目标成分浓度为横坐标（X），用加权最小二乘法计算回归方程及相关系数（r）。
优选的，制备标准曲线时， corilagin的线性范围为0.5-22μg ·mL-1；EA的线性范围为0.4-41μg ·mL-1。
优选的，用50%甲醇定容配制corilagin、对羟基苯甲酸对照品溶液，用二甲基亚砜定容配制EA对照品溶液。
优选的，色谱条件为：色谱柱：Diamonsil C18 （250 × 4.6 mm，5 μm）；
和/或，保护柱，优选的为Dikma；
和/或，柱温：30 ℃；
和/或，流速：1 mL·min-1；
和/或，检测波长：270 nm；
和/或，流动相：甲醇 - 0.2 % 冰醋酸/水梯度洗脱；
Figure RE-653117DEST_PATH_IMAGE001
优选的，质谱条件：ESI：负离子模式；雾化气流：1.50 L·min-1；离子源温度：300 ℃；干燥气压力：100kPa；质量扫描范围：m/z 100～1500。
优选的，为大鼠口服。
优选的，步骤（4）中将余甘子鞣质部位含药胆汁与余甘子鞣质部位供试品总离子流图和空白胆汁总离子流图的保留时间和质谱裂解碎片数据对比分析。
有益效果：
本发明建立了HPLC法测定大鼠胆汁中corilagin和EA含量测定方法，并进行方法学验证，该方法简单快速、灵敏度高、准确性高、重现性好，符合生物样品分析方法的基本要求。
首次建立了分离鉴定口服余甘子鞣质部位后胆汁中化学成分的HPLC-MS方法，弥补了现有空白，该方法可同时分离鉴定出胆汁中6 个原型成分，24个代谢产物。分离鉴定数量多，方法简便，为余甘子鞣质部位胆汁途径代谢和排泄研究提供一种可靠地分析方法。
附图说明
图1大鼠胆汁HPLC色谱图 A.空白胆汁；B.空白胆汁加入对照品；C.余甘子鞣质部位8 h含药胆汁；D.GA 2 h含药胆汁；E.EA 2 h含药胆汁（1.GA；2.对羟基苯甲酸；3.corilagin；4.EA）
图2胆汁中corilagin标准曲线
图3胆汁中EA标准曲线
图4 大鼠灌胃余甘子鞣质部位48h内含药胆汁色谱图 1.GA；2. 内标；3. corilagin；4.EA
图5大鼠灌胃余甘子鞣质部位后48 h内胆汁中corilagin和EA平均累积排泄量-时间曲线（n=6）
图6大鼠灌胃余甘子鞣质部位中GA、corilagin和EA口服量与胆汁排泄量
图7胆汁总离子流图（75 min）
图8胆汁总离子流图（50 min）
图9-13余甘子鞣质部位含药胆汁中30个成分质谱图。
具体实施方式
以下结合实施例和附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
仪器与试药
仪器：Waters 1525高效液相色谱仪（二元泵、Waters 2996紫外检测器，美国Waters）；Thermo 高效液相色谱-质谱联用仪（LTQ-Orbitrap XL HPLC-MS，Thermo Fisher公司）；十万分之一电子天平（型号：Sartorious BT 25S，北京赛多利斯仪器有限公司）；高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；涡旋混合器（上海沪西分析仪器厂）；100-1000移液枪（Eppendorf）；超声波清洗仪（昆山超声仪器有限公司，型号：KQ-500DE）；低温储存冰箱。
试药：余甘子药材购自北京藏医院，产地尼泊尔，经北京中医药大学阎玉凝教授鉴定为大戟科植物Phyllanthus emblica L. 的干燥成熟果实。
GA（纯度98 %，批号：20140401）购自上海源叶生物科技有限公司；corilagin（纯度98 %，批号：MUST-13051301）购自成都曼斯特生物科技有限公司；EA（纯度98 %，批号：MUST-14031010）购自成都曼斯特生物科技有限公司；对羟基苯甲酸（纯度98 %，批号：99-96-7）购自南京景竹生物科技有限公司；甲醇（色谱纯，Fisher公司）；冰乙酸（色谱纯，批号：20140412，天津市丰越化学品有限公司）；屈臣氏纯净水；其他试剂均为分析纯。
实验动物：雄性正常Sprague-Dawley大鼠，体重为220-250 g，北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物使用许可证号：SCXK（京）2012-0001。动物饲养在北京中医药大学动物实验中心SPF级动物房中，自由进食进水，保持12 h避光，12 h光照循环饲养，室内温度为22 ± 1 ℃，相对湿度在40 %左右，适应性喂养4天后开始实验。实验前禁食12 h，自由饮水。
指标性成分柯里拉京（corilagin）、鞣花酸（EA）在胆汁中的含量检测方法与结果
2.1 对照品溶液的配制
GA对照品溶液：精密称取GA 40.23 mg，50 %甲醇定容于10 mL棕色容量瓶，即得4.023mg·mL-1 GA对照品溶液，于4 ℃冰箱中储存，备用。
corilagin对照品溶液：精密称取corilagin 2.44 mg，50 %甲醇定容于10 mL棕色容量瓶，即得0.2440 mg·mL-1 corilagin对照品溶液，于4 ℃冰箱中储存，备用。
EA对照品溶液：精密称取EA 6.06 mg，二甲基亚砜定容于10 mL棕色容量瓶，即得0.6060 mg·mL-1 EA对照品溶液，于4 ℃冰箱中储存，备用。
精密称取对羟基苯甲酸1.72 mg，50 %甲醇定容于10 mL棕色容量瓶，即得0.1720mg·mL-1对羟基苯甲酸对照品溶液，于4 ℃冰箱中储存，备用。
2.2 动物给药与胆汁样品采集
18只Sprague-Dawley大鼠平均随机分为3组，每组6只，乙醚麻醉，仰卧位腹正中紧靠剑突位置向下做小切口，在肝脏下方深处找到胆总管，小心剪小口做胆管插管，并仔细固定好，缝合切口。收集给药前胆汁作为空白胆汁。待大鼠清醒后，按8 g·kg-1剂量灌胃给予余甘子鞣质水溶液、363.20 mg·kg-1剂量灌胃给予GA水溶液、293.60 mg·kg-1剂量灌胃给予EA水溶液，在给药后 0 ~ 2，2 ~ 4，4 ~ 8，8 ~ 12，12 ~ 24，24 ~ 36，36 ~ 48 h 收集含药胆汁，准确量取胆汁体积并记录，胆汁样品迅速保存在-80 ℃冰箱中，备用。
2.3 胆汁样品预处理
2.3.1 预处理方法考察
余甘子鞣质部位化学成分极性较大，不适合液-液萃取其有效成分。固相萃取小柱对于除掉水溶性杂质效果较好，但是，鞣质部位中大极性的成分会损失严重。经考察，采取沉淀法去除蛋白及杂质。
考察了乙腈和甲醇两种有机溶剂去除蛋白和杂质，结果乙腈和甲醇除杂效果相似。
考察了胆汁样品中甲醇加入量，胆汁样品中蛋白含量较少，发现二倍量甲醇及以上可以使杂质沉淀完全。
3）与余甘子鞣质类化合物结构和紫外吸收相似的小分子酚酸类化合物，
2.3.2预处理方法确定移液枪精密吸取大鼠胆汁400 μL，加入150 μL对羟基苯甲酸溶液，涡旋混合3 min使充分混匀，然后加入800 μL甲醇进行萃取，萃取时间5 min，涡旋混匀，4 ℃恒温下以10000 r·min-1离心10 min，分取上层有机相转移至新空白 EP 管中，过0.45μm微孔滤膜，取20 μL进高效液相色谱仪，记录色谱图。空白胆汁按同样方法处理。
2.4 色谱条件
色谱柱：Diamonsil C18 （250 × 4.6 mm，5 μm）；
保护柱：Dikma；柱温：30 ℃；
流动相：甲醇 - 0.2 % 冰醋酸/水；
流速：1 mL·min-1；检测波长：270 nm。
表1 测定胆汁中成分流动相梯度
Figure RE-621073DEST_PATH_IMAGE002
2.5 胆汁中corilagin、EA分析方法的建立与验证
2.5.1 专属性试验
取大鼠胆汁样品，按“2.3胆汁样品预处理”方法进行处理，得到空白胆汁样品图谱（图1A）；将一定浓度的GA、corilagin、EA的对照品溶液和内标对羟基苯甲酸加入大鼠空白胆汁中，依法操作，得到相应谱图（图1 B）；以及大鼠给药后的实际样品谱图（图1 C、图1 D、图1E），上述图谱进行比较。结果表明，在此分析条件下，生物基质中内源性物质不干扰GA、corilagin、EA的检测，被测物峰形良好。
2.5.2 线性范围与灵敏度
精密吸取空白胆汁样品，加入适量的corilagin、EA系列浓度对照品溶液，配置成相当于corilagin 0.2169、0.5422、1.084、2.169、5.422、10.84、16.27、21.69 μg·mL-1，EA0.4040、1.010、2.020、4.040、10.10、20.20、30.30、40.40 μg·mL-1的胆汁样品。按“4.3胆汁样品预处理”方法处理后进HPLC色谱仪。各成分与内标的峰面积比值为纵坐标（Y），目标成分浓度为横坐标（X），用加权最小二乘法计算回归方程及相关系数（r）。大鼠胆汁中corilagin、EA标准曲线方程，相关系数、线性范围、LLOQ见表4，标准曲线的相关系数均大于0.9955。corilagin和EA的线性关系考察见表2、图2、表3、图3。
表2 胆汁中corilagin线性关系考察结果（n = 3）
Figure RE-248364DEST_PATH_IMAGE003
表3胆汁中EA线性关系考察结果（n = 3）
Figure RE-491126DEST_PATH_IMAGE004
表4胆汁中corilagin和EA的标准曲线
Figure RE-887473DEST_PATH_IMAGE005
2.5.3 精密度与准确度
取空白胆汁样品，加入适量的对照品溶液，配制corilagin、EA两者的低、中、高三个浓度的 QC 样品。按“2.3胆汁样品预处理”方法处理后进HPLC色谱仪。每个浓度进行6样本分析，计算日内精密度和准确度。重复操作，连续测定3天并随行标准曲线，计算日间精密度和准确度。结果见表5。
表5 corilagin和EA胆汁低、中、高浓度质控样品的精密度与准确度（n = 6）
Figure RE-557488DEST_PATH_IMAGE006
Figure RE-672075DEST_PATH_IMAGE007
结果表明，准确度和精密度均符合目前生物样品分析方法指导原则的有关规定。
2.5.4 提取回收率试验
取空白胆汁样品，加入适量的对照品溶液，配制corilagin、EA两者的低、中、高三个浓度的 QC 样品，按“2.3胆汁样品预处理”方法处理后进HPLC色谱仪。每个浓度进行6样本分析，记录色谱峰面积，与未经处理的相应浓度的corilagin、EA对照品溶液的峰面积比较，计算corilagin、EA的提取回收率。结果见表6。
表6胆汁中corilagin、EA和内标的提取回收率（%）（n = 6，mean ±SD）
Figure RE-452949DEST_PATH_IMAGE008
2.5.5 稳定性试验
取空白胆汁样品，加入适量的对照品溶液，配制corilagin、EA两者的低、中、高三个浓度的 QC 样品。将已知浓度的质控样品于室温下放置 24 h测定；在冻融循环试验中，将质控样品置于-80 ℃下24 h，然后取出于室温下自然融解，再置于-80 ℃下冷冻24 h，如此反复至少 3 次后测定；长期稳定性试验中，将质控样品于-80 ℃下保存 30 d 后进行测定。结果见表7、表8。
表7 corilagin胆汁低、中、高浓度质控样品的稳定性考察（n = 3）
Figure RE-969381DEST_PATH_IMAGE009
表8EA胆汁低、中、高浓度质控样品的稳定性考察（n = 3）
Figure RE-810298DEST_PATH_IMAGE010
结果表明胆汁样品在室温放置24 h或-80 ℃保存30天或三周期冻融条件下，corilagin、EA仍可以被准确测定。
2.6 胆汁样品测定与胆汁排泄研究结果
按“2.3胆汁样品预处理”项下方法操作，每个分析批制备一条随行标准曲线，根据随行标准曲线，计算大鼠胆汁样品中corilagin、EA浓度，用浓度乘以胆汁体积后计算不同时间段大鼠胆汁中corilagin、EA的排泄量，已知这三者的灌胃给予量，求得corilagin、EA的排泄率。
2.6.1 余甘子鞣质部位胆汁排泄研究结果
大鼠口服余甘子鞣质部位后48 h内胆汁样品色谱图见图4。在大鼠各时间段的胆汁中8.4 min左右均未见明显GA色谱峰，可以看到corilagin和EA色谱峰，说明GA原型成分几乎不经过胆汁排泄，排泄量视为0 μg。测得大鼠含药胆汁样品中corilagin、EA与内标物对羟基苯甲酸的峰面积之比，根据标准曲线方程计算得含药胆汁中corilagin、EA的浓度，并根据收集的胆汁体积计算出大鼠灌胃给药余甘子鞣质部位后corilagin、EA在胆汁中的排泄量及累积排泄量，有关数据见表9、表10。corilagin、EA胆汁累积排泄量-时间曲线见图5，大鼠口服余甘子鞣质部位中GA、corilagin、EA口服量与胆汁排泄量对比图见图6。
表9 大鼠灌胃给药余甘子鞣质部位后胆汁中corilagin和EA的排泄量数（n=6）
Figure RE-881022DEST_PATH_IMAGE011
表10 大鼠灌胃余甘子鞣质部位后corilagin、EA在胆汁中的排泄率（n=6）
Figure RE-200008DEST_PATH_IMAGE012
3 HPLC-MS同时分离鉴定出6种原型成分和24种胆汁代谢产物的方法与结果
3.1 动物给药与胆汁样品采集
方法同“2.2动物给药与胆汁样品采集”
3.2 胆汁样品预处理
方法同“2.3胆汁样品预处理”
3.3 实验条件
3.3.1 色谱条件
色谱条件同“2.4色谱条件”
3.3.2 质谱条件
ESI：负离子模式；
雾化气流：1.50 L·min-1；
离子源温度：300 ℃，
干燥气压力：100 kPa；
质量扫描范围：m/z 100～1500。
3.4 余甘子鞣质部位及其GA、EA含药胆汁成分分析结果
采用HPLC-MSn联用方法对大鼠含药胆汁和空白胆汁进行分析，采集各个样品的总离子流色谱图，见图7。总离子流图显示，保留时间在55 min左右存在强度、峰形、保留时间基本一致的干扰，推测由某种系统误差引起，故对保留时间0 ~ 50 min内的成分进行分析，见图8，归属大鼠含药胆汁中各个成分的来源。
3.4.1 大鼠含药胆汁成分分析
将余甘子鞣质部位含药胆汁、GA含药胆汁、EA含药胆汁与余甘子鞣质部位供试品总离子流图和空白胆汁总离子流图的保留时间和质谱裂解碎片数据对比分析。
3.4.1.1 余甘子鞣质部位胆汁成分分析
余甘子鞣质部位含药胆汁中指认了30个成分，见表11，图9-13，其中6个原型成分中包括1个可水解鞣质类：corilagin；5个酚酸类：6-O-galloyl-D-glucose、3,6-digalloyl-D-glucose 、ferulic acid、ellagic acid、ellagic acid deoxyhexose。除此之外，还确定了24个代谢成分，其中有14个GA代谢衍生物：gallic acid glucuronide 、pyrogallolglucuronidesulfate、2-O-methylpyrogallol glucuronidesulfate、pyrogallol-1-O-glucuronide or pyrogallol-2-O-glucuronide、methyl gallic acid glucuronide、methyl gallic acid、deravative of methyl gallic acid、methyl gallic acid、pyrogallic acid disulfate、3,6-digalloyl-D-glucose glucuronide、3,6-digalloyl-D-glucose glucuronide、methyl gallic acid propyl ester glucuronide、3-hydroxy-4-methoxyl-benzoic acid sulfate、methyl gallic acid sulfate；10个EA代谢衍生物：ellagic acid deoxyhexose glucuronide、urolithin B glucuronide、urolithin Aglucuronide、ellagic acid glucuronide、ellagic acid methyl ether、ellagic acidmethyl ether glucuronide、urolithin C methyl ether glucuronidesulfate、ellagicacid dimethyl ether、nasutin A glucuronide、urolithin D glucuronide。
表11灌胃给药余甘子总鞣质后大鼠胆汁中原型成分及代谢产物的初步鉴定
Figure RE-836526DEST_PATH_IMAGE013
Figure RE-379503DEST_PATH_IMAGE014
Figure RE-468681DEST_PATH_IMAGE015
Figure RE-325779DEST_PATH_IMAGE016
4.结论
本发明建立了HPLC法测定大鼠胆汁中corilagin和EA含量测定方法，并进行方法学验证，该方法简单快速、灵敏度高、准确性高、重现性好，符合生物样品分析方法的基本要求。
首次建立了分离鉴定口服余甘子鞣质部位后胆汁中化学成分的HPLC-MS方法，弥补了现有空白，该方法可同时分离鉴定出胆汁中6 个原型成分，24个代谢产物。分离鉴定数量高，方法简便，为余甘子鞣质部位胆汁途径代谢和排泄研究提供一种可靠地分析方法。

Claims (10)

1.一种口服余甘子鞣质部位后胆汁中化学成分的检测方法，包括：
（1）动物给药与胆汁样品采集 ；
（2）胆汁样品预处理，包括：
精密吸取大鼠胆汁，加入内标溶液，涡旋混合，加入有机溶剂萃取，离心，取上层有机相，进高效液相色谱仪前过微孔滤膜，记录色谱图；
空白胆汁按同样方法处理；
（3）指标性成分柯里拉京（corilagin）、鞣花酸（EA）在胆汁中的含量检测，包括：
按步骤（2）方法操作，每个分析批制备一条随行标准曲线，根据随行标准曲线，计算大鼠胆汁样品中corilagin、EA浓度，用浓度乘以胆汁体积后计算不同时间段大鼠胆汁中corilagin、EA的排泄量；
色谱条件：色谱柱为C18色谱柱；和/或柱温 28-32℃；和/或流速：0.8-1.2 ml·min-1 ；和/或检测波长：268-272nm；和/或流动相：甲醇 - 0.2 % 冰醋酸/水梯度洗脱：0-15min 5-25%甲醇，15-20min 25-25%甲醇，20-30min 25-30%甲醇，30-60min 30-60%甲醇，60-65min60-90%甲醇，65-70min 90-5%甲醇；
（4）HPLC-MS同时分离鉴定胆汁中原型成分和代谢产物的方法：
动物给药与胆汁样品采集，同步骤（1）；
胆汁样品预处理：同步骤（2）；
色谱条件：同步骤（3）；
质谱条件：ESI：负离子模式；雾化气流： 1.30-1.70 L·min-1 ；离子源温度：280-320℃；干燥气压力：80-120kPa；质量扫描范围：m/z 100～1500；
提取碎片离子，得到碎片的质谱图和裂解碎片数据，对比分析，指认确定成分。
2.如前述任一项权利要求所述的检测方法，其中口服余甘子鞣质部位含药胆汁中确定了6 个原型成分，24个代谢产物。
3.如前述任一项权利要求所述的检测方法，其中内标物质为苯甲酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸、咖啡酸；更优选的，内标物质为对羟基苯甲酸。
4.如前述任一项权利要求所述的检测方法，步骤（2）中的有机溶剂的种类为乙腈或甲醇。
5.如前述任一项权利要求所述的检测方法，步骤（2）中的有机溶剂的用量为胆汁用量的2-6倍。
6.如前述任一项权利要求所述的检测方法，标准曲线制备方法为：精密吸取空白胆汁样品，加入适量的 corilagin 和 EA 系列浓度对照品溶液配制系列胆汁样品，按照步骤（2）中胆汁样品预处理方法处理后进 HPLC 色谱仪；各成分与内标的峰面积比值为纵坐标（Y），目标成分浓度为横坐标（X），用加权最小二乘法计算回归方程及相关系数（r）。
7.如前述任一项权利要求所述的检测方法，制备标准曲线时， corilagin的线性范围为0.5-22μg ·mL-1；EA的线性范围为0.4-41μg ·mL-1。
8.如前述任一项权利要求所述的检测方法，用50%甲醇定容配制corilagin、对羟基苯甲酸对照品溶液，用二甲基亚砜定容配制EA对照品溶液。
9.如前述任一项权利要求所述的检测方法，色谱条件为：色谱柱：Diamonsil C18 （250× 4.6 mm，5 μm）；
和/或，保护柱，优选的为Dikma；
和/或，柱温：30 ℃；
和/或，流速：1 mL·min-1；
和/或，检测波长：270 nm；
和/或，流动相：甲醇 - 0.2 % 冰醋酸/水梯度洗脱。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
10.如前任一项权利要求所述的检测方法，质谱条件：ESI：负离子模式；雾化气流：1.50L·min-1 ；离子源温度：300 ℃；干燥气压力：100kPa；质量扫描范围：m/z 100～1500。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109876031A (zh) * 2019-04-21 2019-06-14 北京中医药大学 一种余甘子鞣质部位的富集方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BAORU YANG ET AL: "Composition and Biological Activities of Hydrolyzable Tannins of Fruits of Phyllanthus emblica", 《JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY》 *
YONGYU LI ET AL: "Characterization of phenolic compounds from Phyllanthus emblica fruits using HPLC-ESI-TOF-MS as affected by an optimized microwave-assisted extraction", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF FOOD PROPERTIES》 *
吴玲芳 等: "可水解鞣质单体化学与药理作用研究进展", 《中草药》 *
吴玲芳: "藏药余甘子鞣质部位体内成分分析", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（医药卫生科技辑）》 *
杨光辉 等: "人肠内菌对藏药余甘子鞣质部位代谢的研究", 《北京中医药大学学报》 *

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