CN111289636A - 口服余甘子鞣质部位后粪便中指标成分含量测定及28种成分分离鉴定方法 - Google Patents

口服余甘子鞣质部位后粪便中指标成分含量测定及28种成分分离鉴定方法 Download PDF

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梁文仪
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Abstract

本发明提供一种口服余甘子鞣质部位后粪便中化学物质的检测方法，包括：HPLC法测定大鼠粪便中GA、corilagin和EA含量测定和分离鉴定口服余甘子鞣质部位后粪便中化学成分的HPLC‑MS方法。可同时分离鉴定出粪便中12种原型成分和16种代谢产物。具有简单快速、灵敏度高、准确性高、重现性好、分离鉴定数量高等优点，为余甘子鞣质部位粪便途径代谢和排泄研究提供一种可靠地分析方法。

Description

口服余甘子鞣质部位后粪便中指标成分含量测定及28种成分 分离鉴定方法
技术领域
本发明涉及一种余甘子鞣质部位口服后粪便中化学成分UPLC-MSn分析检测方法。
背景技术
药物经体内吸收后，进行水解、氧化、还原的一相代谢反应和与体内葡萄糖醛酸、硫酸等物质结合的二相代谢反应。通过代谢物分析可以确定药物在体内的显效形式。药物的排泄有肾排泄、胆汁排泄、粪便排泄、乳汁和汗液排泄等途径。药物葡萄糖醛酸或硫酸酯结合物经过十二指肠时在肠内菌群作用下水解成苷元，重新吸收入血，未被重吸收的成分则经粪便排出。研究药物的排泄和代谢对阐明药物的体内过程和变化，设计给药途径、给药剂量等具有重要的意义。
藏药余甘子为大戟科叶下珠属植物余甘子Phyllanthus emblica L. 的干燥成熟果实，鞣质含量很高，具有广泛的药理学活性，引起国内外研究者的高度重视，然而截止目前，尚未发现研究口服余甘子鞣质部位后在粪便中代谢、排泄的相关报道。此外，由于代谢产物的量很少，分离鉴定代谢产物尤其同时分离鉴定多种代谢产物是具有困难的工作。因此，需要一种能够有效评价余甘子鞣质部位粪便代谢和排泄情况的可行性分析检测方法。
发明内容
发明目的：本发明提供一种口服余甘子鞣质部位后粪便中化学物质的检测方法，包括：粪便样品预处理；指标性成分没食子酸、柯里拉京、鞣花酸在粪便中的含量测定方法；和可同时分离鉴定出粪便中12种原型成分和16种代谢产物的方法。具有简单快速、灵敏度高、准确性高、重现性好、分离鉴定数量多效果好等优点，是一种能够有效评价余甘子鞣质部位粪便代谢和排泄情况的分析检测方法。
技术方案：
本发明提供了一种口服余甘子鞣质部位后粪便中化学成分的检测方法，包括：
（1）采集粪便，冷冻备用；
（2）粪便样品预处理，包括：
取粪便样品，加入有机溶剂，研磨超声提取，离心；精密量取适量上清液，加入有机溶剂水溶液稀释；精密吸取稀释后上清液，加入内标溶液，充分混合，加入有机溶剂水溶液涡旋混匀，进高效液相色谱仪前微孔滤膜过滤，记录色谱图；
空白粪便按同样方法处理；
（3）指标性成分没食子酸（GA）、柯里拉京（corilagin）、鞣花酸（EA）在粪便中的含量检测，包括：
按步骤（2）“粪便样品预处理”方法操作，每个分析批制备一条随行标准曲线，根据随行标准曲线，计算大鼠粪便样品中GA、corilagin、EA浓度，用浓度乘以基质粪便体积后计算得大鼠粪便中GA、corilagin、EA的排泄量；
色谱条件：色谱柱为C18色谱柱；和/或柱温 28-32℃；和/或流速：0.8-1.2 ml·min-1；和/或检测波长：268-272nm；和/或流动相：甲醇 - 0.2 % 冰醋酸/水梯度洗脱：0-20min 5-17%甲醇，20-25min 17-17%甲醇，25-28min 17-26%甲醇，28-42min 26-26%甲醇，42-57min26-60%甲醇，57-67min 60-90%甲醇； 67-72min 90-5%甲醇；
（4）HPLC-MS同时分离鉴定粪便中原型成分和代谢产物的方法：
粪便样品采集，同步骤（1）；
粪便样品预处理：同步骤（2）；
色谱条件：同步骤（3）中色谱条件；
质谱条件：ESI：负离子模式；雾化气流： 1.30-1.80 L·min-1；离子源温度：280-320℃；干燥气压力：80-120kPa；质量扫描范围：m/z 100～1500；
分析指认确定成分：提取碎片离子，得到碎片的质谱图和裂解碎片数据，对比分析，指认确定成分。
优选的，口服余甘子鞣质部位含药粪便中确定了28个成分，其中12个原型成分，16个代谢产物。
优选的，内标物质为苯甲酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸、咖啡酸；更优选的，内标物质为对羟基苯甲酸。
优选的，步骤（2）中的有机溶剂的种类为乙腈或甲醇；有机溶剂水溶液为30-70%的乙腈或甲醇。
优选的，步骤（2）中于30-50 kHz、230-270 W条件下超声提取10-60 min。
优选的，步骤（2）中离心转数为10000-30000 r·min-1。
优选的，步骤（2）为：取粪便样品，捣碎研磨，称取一定量置于容器中，加入2-5倍量有机溶剂，研磨，超声提取，离心，取上清液作为粪便提取液；精密量取适量粪便提取液加入有机溶剂水溶液稀释20-60倍；精密吸取200-2000μL稀释后粪便上清液，加入20-500μL内标溶液，充分混合，加入有机溶剂水溶液涡旋混匀，进高效液相色谱仪前微孔滤膜过滤，记录色谱图。空白粪便按同样方法处理。
优选的，标准曲线制备方法为：精密吸取空白粪便样品，加入适量的 GA、corilagin 和 EA 系列浓度对照品溶液配制系列粪便样品，按照步骤（2）中粪便样品预处理方法处理后进 HPLC 色谱仪；各成分与内标的峰面积比值为纵坐标（Y），目标成分浓度为横坐标（X），用加权最小二乘法计算回归方程及相关系数（r）；
优选的，制备标准曲线时，GA采用0.2-110μg ·mL-1浓度范围内系列浓度；corilagin采用0.3-40μg ·mL-1浓度范围内系列浓度；EA采用0.3-40μg ·mL-1浓度范围内系列浓度。
优选的，用50%甲醇定容配制GA、corilagin、对羟基苯甲酸对照品溶液，用二甲基亚砜定容配制EA对照品溶液。
优选的，色谱条件为：色谱柱：Diamonsil C18 （250 × 4.6 mm，5 μm）；
和/或，保护柱，优选的为Dikma；
和/或，柱温：30 ℃；
和/或，流速：1 mL·min-1；
和/或，检测波长：270 nm；
和/或，流动相：甲醇 - 0.2 % 冰醋酸/水梯度洗脱。
Figure RE-417111DEST_PATH_IMAGE001
优选的，质谱条件：ESI：负离子模式；雾化气流：1.50 L·min-1；离子源温度：300℃；干燥气压力：100kPa；质量扫描范围：m/z 100～1500。
优选的，为大鼠口服。
优选的，步骤（4）中将余甘子鞣质部位含药粪便与余甘子鞣质部位供试品总离子流图和空白粪便总离子流图的保留时间和质谱裂解碎片数据对比分析。
有益效果：
本发明建立并验证了HPLC法测定大鼠粪便中GA、corilagin和EA含量测定方法，首次建立了分离鉴定口服余甘子鞣质部位后粪便中化学成分的HPLC-MS方法，可同时分离鉴定出粪便中12种原型成分和16种代谢产物。具有简单快速、灵敏度高、准确性高、重现性好、分离鉴定数量高等优点，为余甘子鞣质部位粪便途径代谢和排泄研究提供一种可靠地分析方法。
附图说明：
图1 大鼠粪便HPLC色谱图（A.空白粪便；B.空白粪便加入对照品；C.余甘子鞣质 24 h含药粪便；D.GA 12 h含药粪便；E.EA 12 h含药粪便（1.GA；2.对羟基苯甲酸；3.corilagin；4.EA））；
图2粪便中GA标准曲线；
图3粪便中corilagin标准曲线；
图4粪便中EA标准曲线；
图5 大鼠灌胃余甘子鞣质部位96 h内含药粪便色谱图（1.GA；2. 内标；3. corilagin；4.EA）；
图6大鼠灌胃余甘子鞣质部位后96 h内粪便中GA、corilagin和EA平均累积排泄量-时间曲线（n=6）；
图7大鼠灌胃余甘子鞣质部位中GA、corilagin和EA口服量与粪便排泄量（n=6）；
图8 粪便总离子流图（75 min）（A.空白粪便；B.给药余甘子部位粪便；C.给药GA粪便；D.给药EA粪便）；
图9 粪便总离子流图（55 min）（A.空白粪便；B.给药余甘子部位粪便；C.给药GA粪便；D.给药EA粪便）；
图10-14 余甘子鞣质部位含药粪便中28个成分的质谱图。
具体实施方式
以下结合实施例和附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
仪器与试药
仪器：Waters 1525高效液相色谱仪（二元泵、Waters 2996紫外检测器，美国Waters）；Thermo 高效液相色谱-质谱联用仪（LTQ-Orbitrap XL HPLC-MS，Thermo Fisher公司）；十万分之一电子天平（型号：Sartorious BT 25S，北京赛多利斯仪器有限公司）；超声波清洗仪（昆山超声仪器有限公司，型号：KQ-500DE）；低温储存冰箱。
试药：余甘子药材购自北京藏医院，产地尼泊尔，经北京中医药大学阎玉凝教授鉴定为大戟科植物Phyllanthus emblica L. 的干燥成熟果实。GA（纯度98 %，批号：20140401）购自上海源叶生物科技有限公司；corilagin（纯度98 %，批号：MUST-13051301）购自成都曼斯特生物科技有限公司；EA（纯度98 %，批号：MUST-14031010）购自成都曼斯特生物科技有限公司；对羟基苯甲酸（纯度98 %，批号：99-96-7）购自南京景竹生物科技有限公司；甲醇（色谱纯，Fisher公司）；冰乙酸（色谱纯，批号：20140412，天津市丰越化学品有限公司）；屈臣氏纯净水；其他试剂为分析纯。
实验动物：雄性正常Sprague-Dawley大鼠，体重为220-250 g，北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物使用许可证号：SCXK（京）2012-0001。动物饲养在北京中医药大学动物实验中心SPF级动物房中，自由进食进水，保持12 h避光，12 h光照循环饲养，室内温度为22 ± 1 ℃，相对湿度在40 %左右，适应性喂养4天后开始实验。实验前禁食12 h ，自由饮水。
指标性成分没食子酸（GA）、柯里拉京（corilagin）、鞣花酸（EA）在粪便中的含量检测方法与结果
2.1 对照品溶液的配制
GA对照品溶液：精密称取GA 40.23 mg，50 %甲醇定容于10 mL棕色容量瓶，即得4.023mg·mL-1 GA对照品溶液，于-4 ℃冰箱中储存，备用。
corilagin对照品溶液：精密称取corilagin 3.01 mg，50 %甲醇定容于10 mL棕色容量瓶，即得0.3010 mg·mL-1 corilagin对照品溶液，于-4 ℃冰箱中储存，备用。
EA对照品溶液：精密称取EA 6.06 mg，二甲基亚砜定容于10 mL棕色容量瓶，即得0.6060 mg·mL-1 EA对照品溶液，于-4 ℃冰箱中储存，备用。
精密称取对羟基苯甲酸1.72 mg，50 %甲醇定容于10 mL棕色容量瓶，即得0.1720mg·mL-1对羟基苯甲酸对照品溶液，于-4 ℃冰箱中储存，备用。
2.2 动物给药与粪便采集
18只Sprague-Dawley大鼠随机平均分为3组，每组6只，正常饲养4天，实验前12小时禁食，自由饮水。大鼠置于代谢笼中饲养，收集空白粪便。按 8 g·kg-1剂量灌胃给予余甘子鞣质水溶液、363.20 mg·kg-1剂量灌胃给予GA水溶液、293.60 mg·kg-1剂量灌胃给予EA水溶液，于给药后0 ~ 12、12 ~ 24、24 ~ 36、36 ~ 48、48 ~ 60、60 ~ 72、72 ~ 96 h收集大鼠含药粪便。粪便采集后，迅速保存在-20 ℃冰箱中，备用。
2.3 粪便样品预处理
取大鼠粪便样品，捣碎研磨，称取0.5 g，置于研钵中，加入3倍量甲醇，充分研磨，转移至EP管中，于40 kHz、250 W条件下超声提取30 min，4 ℃恒温下以15000 r·min-1离心10min，吸取上清液于新空白EP管中。
精密量取粪便提取液适量，50 %甲醇稀释40倍。
移液枪精密吸取稀释后大鼠粪便上清液500 μL，加入100 μL内标溶液，涡旋混合3min使充分混匀，然后加入300 μL 50 %甲醇，涡旋混匀后，过0.45μm微孔滤膜，取20 μL进高效液相色谱仪，记录色谱图。空白粪便按同样方法处理。
2.4 色谱条件
色谱柱：Diamonsil C18 （250 × 4.6 mm，5 μm）；
保护柱：Dikma；柱温：30 ℃；
流动相：甲醇 - 0.2 % 冰醋酸/水；
流速：1 mL·min-1；检测波长：270 nm。
表1测定粪便中成分流动相梯度
Figure RE-334251DEST_PATH_IMAGE002
2.5 粪便样品中GA、corilagin和EA分析方法建立与验证
2.5.1 专属性试验
取大鼠粪便样品，按“2.3 粪便样品预处理”方法进行处理，得到空白粪便图谱（图1A）；将一定浓度的GA、corilagin、EA的对照品溶液和内标对羟基苯甲酸加入大鼠空白粪便中，得到相应谱图（图1B）；以及大鼠给药后的实际样品谱图（图1C、图1D、图1E），上述图谱进行比较。结果表明，在此分析条件下，粪便中内源性物质不干扰GA、corilagin、EA的检测，被测物峰形良好。
2.5.2 线性范围与灵敏度
精密吸取空白生物样品，加入适量的GA、corilagin和EA系列浓度对照品溶液，配成相当于GA 0.2694、0.5388、1.077、2.694、5.388、16.16、32.33、64.66、96.98、107.7 μg·mL-1，corilagin 0.3762、0.9406、1.881、5.644、11.29、22.57、33.86、37.62 μg·mL-1，EA0.3788、0.9469、1.894、5.681、11.36、22.73、34.09、37.88 μg·mL-1的粪便样品；按“2.3 粪便样品预处理”方法处理后进HPLC色谱仪。各成分与内标的峰面积比值为纵坐标（Y），目标成分浓度为横坐标（X），用加权最小二乘法计算回归方程及相关系数（r）。粪便样品中的GA、corilagin、EA标准曲线方程，相关系数、曲线测定浓度范围、LLOQ见表5，标准曲线的相关系数均大于 0.9955。GA、corilagin和EA的线性关系考察见表2、图2、表3、图3、表4、图4。
表2 粪便中GA线性关系考察结果（n = 3）
Figure RE-677770DEST_PATH_IMAGE003
表3粪便中corilagin线性关系考察结果（n = 3）
Figure RE-72979DEST_PATH_IMAGE004
表4粪便中EA线性关系考察结果（n = 3）
Figure RE-949668DEST_PATH_IMAGE005
表5粪便中GA、corilagin和EA的标准曲线
Figure RE-772131DEST_PATH_IMAGE006
2.5.3 精密度和准确度试验
取空白粪便样品，加入适量的对照品溶液，配制GA、corilagin、EA三者的低、中、高三个浓度的 QC 样品。按“2.3 粪便样品预处理”方法处理后进HPLC色谱仪。每个浓度进行6样本分析，计算日内精密度和准确度。重复操作，连续测定3天并随行标准曲线，计算日间精密度和准确度，结果见表6。
表6 GA、corilagin和EA粪便低、中、高浓度质控样品的精密度与准确度（n = 6）
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE007
结果表明，GA、corilagin、EA低、中、高浓度质控样品的准确度和精密度均符合目前生物样品分析方法指导原则的有关规定。
2.5.4 回收率试验
取空白粪便样品，加入适量的对照品溶液，配制GA、corilagin、EA三者的低、中、高三个浓度的 QC 样品，按“2.3 粪便样品预处理”方法处理后进HPLC色谱仪。每个浓度进行6样本分析，记录色谱峰面积，与未经处理的相应浓度的GA、corilagin、EA对照品溶液的峰面积比较，计算GA、corilagin、EA的提取回收率。结果见表7。
表7粪便中GA、corilagin、EA和内标的提取回收率（%）（n = 6，mean ±SD）
Figure RE-101481DEST_PATH_IMAGE008
2.5.5 稳定性试验
取空白粪便样品，加入适量的对照品溶液，配制GA、corilagin、EA三者的低、中、高三个浓度的 QC 样品。将已知浓度的质控样品放置于室温24 h测定；在冻融循环试验中，将质控样品置于-80 ℃下 24 h，然后取出于室温下自然融解，再置于-80 ℃下冷冻24 h，如此反复至少 3 次后进行样品测定；长期稳定性试验中，将质控样品于-80 ℃下保存 30 d 后进行样品测定。结果见表8、表9、表10。
结果显示，被测物在上述保存条件下RSD ≤ 7.86 %。表明粪便样品在室温放置24h或-80 ℃保存30天或三周期冻融条件下，GA、corilagin、EA这三个被测组分仍可以被准确测定。
表8 GA粪便低、中、高浓度QC样品的稳定性考察（n = 3）
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE009
表9 corilagin粪便低、中、高浓度QC样品的稳定性考察（n = 3）
Figure RE-923550DEST_PATH_IMAGE010
表10 EA粪便低、中、高浓度QC样品的稳定性考察（n = 3）
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE011
2.6 粪便样品测定
按“2.3粪便样品预处理”项下方法操作，每个分析批制备一条随行标准曲线，根据随行标准曲线，计算大鼠粪便样品中GA、corilagin、EA浓度，用浓度乘以基质粪便体积后计算得不同时间段大鼠粪便中GA、corilagin、EA的排泄量及累积排泄量，已知灌胃给予量，求得GA、corilagin、EA的排泄率及累积排泄率。
2.6.1 余甘子鞣质部位粪便排泄研究结果
大鼠口服余甘子鞣质部位后96 h内粪便样品色谱图见图5。测得大鼠含药粪便样品中GA、corilagin、EA与内标物对羟基苯甲酸的峰面积之比，根据标准曲线方程计算得含药粪便中GA、corilagin、EA的浓度，并根据收集的粪便质量计算出大鼠灌胃给药余甘子鞣质部位后GA、corilagin、EA在粪便中的排泄量及累积排泄量，有关数据见表 11、表 12。GA、corilagin、EA粪便累积排泄量-时间曲线见图 6，大鼠口服余甘子鞣质部位中GA、corilagin、EA口服量与粪便排泄量对比图见图7。大鼠灌胃给药余甘子鞣质部位后，GA、corilagin和EA在大鼠粪便中的96 h内累积排泄量分别为46184.73 μg、12603.49 μg、4889.97 μg，累积排泄率依次为50.86 %、39.07 %、6.66 %。
表11大鼠灌胃给药余甘子鞣质部位后粪便中GA、corilagin和EA的排泄量数（n=6）
Figure RE-654746DEST_PATH_IMAGE012
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE013
表12大鼠灌胃余甘子鞣质部位后GA、corilagin、EA在粪便中的排泄率
Figure RE-772743DEST_PATH_IMAGE014
3 HPLC-MS同时分离鉴定出 12种原型成分和16种粪便代谢产物的方法与结果
3.1 动物给药与粪便样品采集
方法同“2.2动物给药与粪便样品采集”。
3.2 粪便样品预处理
方法同“2.3粪便样品预处理”。
3.3 实验条件
3.3.1 色谱条件
色谱条件同“2.4.1 色谱条件”。
3.3.2 质谱条件
ESI：负离子模式；
雾化气流：1.50 L·min-1；
离子源温度：300 ℃，
干燥气压力：100 kPa；
质量扫描范围：m/z 100～1500。
3.4 余甘子鞣质部位及其GA、EA粪便代谢产物测定
采用HPLC-MSn法对大鼠含药粪便样品和空白粪便进行分析，采集各个样品的总离子流图，见图8。总离子流图显示，保留时间在57 min左右存在强度、峰形、保留时间基本一致的干扰，推测由某种系统误差引起，故对保留时间0 ~ 55 min内的成分进行分析，见图9，归属大鼠含药粪便中各个成分的来源。
3.4.1 大鼠含药粪便成分分析
将余甘子鞣质部位含药粪便、GA含药粪便、EA含药粪便与余甘子鞣质部位供试品总离子流图和空白粪便总离子流图的保留时间和质谱裂解碎片数据对比分析。
3.4.1.1 余甘子鞣质部位含药粪便成分分析
余甘子鞣质部位含药粪便中指认了23个成分，见表13，图10-14，在54.21 min、54.94min、55.62 min、56.15 min分别提取得到urolithin C 、urolithin A 、ellagic aciddimethyl ether、urolithin A methyl ether 和EA的质谱图，由于系统干扰，没有进行指认，即共确定了28个成分的结构。12个原型成分中包括1个可水解鞣质类：corilagin；4个粘酸类：mucic acid、mucic acid gallate、mucic acid lactone、mucic acid dimethylester 2-O-gallate；6个酚酸类：6-O-galloyl-D-glucose、gallic acid、malic acidgallate、3,6-digalloyl-D-glucose、ellagic acid hexose、ellagic acid；1个有机酸：malic acid。除此之外，还确定了16个代谢成分，其中1个粘酸类：mucic acid methylester gallate；9个酚酸类：protocatechuic acid 、3,4-dihydroxy phenylacetic acid、3-methoxy-4-hydroxyphenylacetic acid、pyrogallic acid、methyl gallic acid、methyl gallic acid、gallic acid isomer、benzoic acid、5-(3’,4’,5’-trihydroxyphenyl)-γ-valerolactone，大多为GA的衍生物；6个尿石素类：3,4,8,9,10-pentahydroxy-urolithin、urolithin D、urolithin C 、urolithin A 、ellagic aciddimethyl ether、urolithin A methyl ether，均为EA的菌群代谢物。
表13 灌胃给药余甘子总鞣质后大鼠粪便中原型成分及代谢产物的初步鉴定
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE015
Figure RE-90854DEST_PATH_IMAGE016
4.结论
本发明建立并验证了HPLC法测定大鼠粪便中GA、corilagin和EA含量测定方法，首次建立了分离鉴定口服余甘子鞣质部位后粪便中化学成分的HPLC-MS方法，可同时分离鉴定出粪便中12种原型成分和16种代谢产物。具有简单快速、灵敏度高、准确性高、重现性好、分离鉴定数量高等优点，为余甘子鞣质部位粪便途径代谢和排泄研究提供一种可靠地分析方法。

Claims (10)

1.一种口服余甘子鞣质部位后粪便中化学成分的检测方法，包括：
（1）采集粪便，冷冻备用；
（2）粪便样品预处理 ，包括：
取粪便样品，加入有机溶剂，研磨超声提取，离心；精密量取适量上清液，加入有机溶剂水溶液稀释；精密吸取稀释后上清液，加入内标溶液，充分混合，加入有机溶剂水溶液涡旋混匀，进高效液相色谱仪前微孔滤膜过滤，记录色谱图；
空白粪便按同样方法处理；
（3）指标性成分没食子酸（GA）、柯里拉京（corilagin）、鞣花酸（EA）在粪便中的含量检测，包括：
按步骤（2）“粪便样品预处理”方法操作，每个分析批制备一条随行标准曲线，根据随行标准曲线，计算大鼠粪便样品中GA、corilagin、EA浓度，用浓度乘以基质粪便体积后计算得大鼠粪便中GA、corilagin、EA的排泄量；
色谱条件：色谱柱为C18色谱柱；和/或柱温 28-32℃；和/或流速：0.8-1.2 ml·min-1 ；和/或检测波长：268-272nm；和/或流动相：甲醇 - 0.2 % 冰醋酸/水梯度洗脱：0-20min 5-17%甲醇，20-25min 17-17%甲醇，25-28min 17-26%甲醇，28-42min 26-26%甲醇，42-57min26-60%甲醇，57-67min 60-90%甲醇； 67-72min 90-5%甲醇；
（4）HPLC-MS同时分离鉴定粪便中原型成分和代谢产物的方法：
粪便样品采集，同步骤（1）；
粪便样品预处理：同步骤（2）；
色谱条件：同步骤（3）中色谱条件；
质谱条件：ESI：负离子模式；雾化气流： 1.30-1.80 L·min-1 ；离子源温度：280-320℃；干燥气压力：80-120kPa；质量扫描范围：m/z 100～1500；
分析指认确定成分：提取碎片离子，得到碎片的质谱图和裂解碎片数据，对比分析，指认确定成分。
2.根据前述任一项权利要求所述的检测方法，其中，口服余甘子鞣质部位含药粪便中确定了 28 个成分，其中12个原型成分，16个代谢产物。
3.根据前述任一项权利要求所述的检测方法，所述内标物质为苯甲酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸、咖啡酸；更优选的，内标物质为对羟基苯甲酸。
4.根据前述任一项权利要求所述的检测方法，步骤（2）中的有机溶剂的种类为乙腈或甲醇；有机溶剂水溶液为30-70%的乙腈或甲醇。
5.根据前述任一项权利要求所述的检测方法，步骤（2）中于30-50 kHz、230-270 W条件下超声提取10-60 min。
6.根据前述任一项权利要求所述的检测方法，步骤（2）中离心转数为10000-30000 r·min-1。
7.根据前述任一项权利要求所述的检测方法，标准曲线制备方法为：精密吸取空白粪便样品，加入适量的 GA、corilagin 和 EA 系列浓度对照品溶液配制系列粪便样品，按照步骤（2）中粪便样品预处理方法处理后进 HPLC 色谱仪；各成分与内标的峰面积比值为纵坐标（Y），目标成分浓度为横坐标（X），用加权最小二乘法计算回归方程及相关系数（r）。
8.根据前述任一项权利要求所述的检测方法，制备标准曲线时，GA采用0.2-110μg ·mL-1浓度范围内系列浓度；corilagin采用0.3-40μg ·mL-1浓度范围内系列浓度；EA采用0.3-40μg ·mL-1浓度范围内系列浓度；优选的，用50%甲醇定容配制GA、corilagin、对羟基苯甲酸对照品溶液，用二甲基亚砜定容配制EA对照品溶液。
9.根据前述任一项权利要求所述的检测方法，色谱条件为：色谱柱：Diamonsil C18（250 × 4.6 mm，5 μm）；
和/或，保护柱，优选的为Dikma；
和/或，柱温：30 ℃。
Figure 57561DEST_PATH_IMAGE001
10.根据前述任一项权利要求所述的检测方法，质谱条件为：ESI：负离子模式；雾化气流：1.50 L·min-1 ；离子源温度：300 ℃；干燥气压力：100kPa；质量扫描范围：m/z 100～1500。
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