CN111333691A

CN111333691A - 一种罗汉果甜苷ⅴ的制备方法

Info

Publication number: CN111333691A
Application number: CN202010333014.0A
Authority: CN
Inventors: 蒋亦轩; 莫卓群; 冯博文
Original assignee: Yongzhou Huamao Biotechnology Co ltd
Current assignee: Yongzhou Huamao Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-04-24
Filing date: 2020-04-24
Publication date: 2020-06-26
Anticipated expiration: 2040-04-24
Also published as: CN111333691B

Abstract

本发明公开了一种罗汉果甜苷Ⅴ的制备方法，包括如下步骤：步骤一，鲜果干燥：新鲜的成熟期罗汉果干燥处理；步骤二，制备浸膏：罗汉果干果粉碎，用乙醇溶液浸润提取，过滤后将滤液浓缩，制得浸膏；步骤三，洗脱浓缩：将浸膏稀释，脱色过滤后，注入大孔树脂柱中洗脱，洗脱液浓缩干燥，制得罗汉果总苷；步骤四，超滤除杂：罗汉果总苷溶于适量水中，通过超滤系统进行过滤，得到的滤液喷雾干燥，制得罗汉果甜苷Ⅴ半成品；步骤五，洗脱干燥：罗汉果甜苷Ⅴ半成品用适量水溶解，注入聚酰胺柱中，通过调节乙醇浓度进行梯度洗脱，收集最后一道洗脱后的洗脱液，浓缩至原有体积的十分之一，再加入适量水调节溶液密度，喷雾干燥，即制得罗汉果甜苷Ⅴ成品。

Description

一种罗汉果甜苷Ⅴ的制备方法

技术领域

本发明属于植物提取领域，具体涉及一种罗汉果甜苷Ⅴ的制备方法。

背景技术

罗汉果，葫芦科罗汉果属多年生藤本植物的果实，心形叶，雌雄异株，花期5-6月，果期是我国特有的传统保健药材，自被使用时起，就被认为具有止咳、祛痰、润肺、降血糖、保肝等作用，是首批被国家卫生部公布的药食两用中药材。

罗汉果产地主要位于广西桂北地区，湖南，广东，江西，贵州部分地区也有出产。罗汉果成熟过程包括生长期，花期与果期。其中罗汉果的花期为6-8月，从授粉开始至罗汉果长成大约需70d，据有关研究表明，当罗汉果长至85d，以上时，其中的罗汉果甜苷Ⅴ含量将达到最大值。罗汉果果期为8-10月，成熟罗汉果在未及时冷藏保鲜处理的情况下只能保存约5-7d。

有研究表明，罗汉果中最主要的有效成分为葫芦烷型四环三萜皂苷类化合物，其中以罗汉果甜苷Ⅴ为主，是一类甜味很强的非糖类物质，其甜度约为蔗糖的300倍，作为一种食品添加剂被广泛使用。我国于1996年7月的全国食品添加剂标准化技术委员会第十七次会议上批准该产品作为食品添加剂使用。目前，允许罗汉果甜苷作为食品添加剂使用的国家还有：日本、韩国、泰国、新加坡、英国等。现在，科学家正在设计，利用高甜度的天然糖苷与低甜度的低聚糖等互相搭配，取长补短，生产出色香味俱佳又甜度适中的保健复合甜味剂。

由于罗汉果是一种不耐保存的植物果实，即使是在冷藏情况下，罗汉果中的罗汉果甜苷Ⅴ也会由于自身酶的左右而分解，目前罗汉果甜苷Ⅴ的生产主要通过鲜果直接提取，导致生产受果期所限，产能受限，年产量低，无法满足国内外对罗汉果甜苷Ⅴ的巨大市场需求，亟待开发一种新的罗汉果甜苷Ⅴ的制备方法，摆脱对罗汉果鲜果的依赖，延长生产周期，提高产量。

发明内容

本发明针对现有制备罗汉果甜苷Ⅴ的不足之处，通过将鲜果干制，提供一种以罗汉果干果为原料，制备罗汉果甜苷Ⅴ的方法。

本发明提供了一种罗汉果甜苷Ⅴ的制备方法，包括如下步骤：

（1）鲜果干燥：将新鲜的成熟期罗汉果干燥处理；

优选的，所述罗汉果为日龄在85d~100d的成熟罗汉果，当果龄大于100d时，罗汉果开始腐败；

优选的，所述干燥前在罗汉果表面扎孔，所述干燥方法包括真空干燥法，微波干燥法，鼓风干燥法和远红外干燥法；

优选的，干燥方法为真空、微波混用干燥法；

优选的，所述扎孔的孔径为2.0~2.5mm，扎孔深度为1.5~2.0cm，所述干燥温度为55℃~65℃，当温度大于70℃时，罗汉果总苷与罗汉果甜苷Ⅴ的含量开始下降，干燥后罗汉果的含水量小于5%，以易于长期存储；

（2）制备浸膏：将步骤（1）得到的罗汉果干果进行粉碎，用乙醇溶液浸润提取，过滤后将滤液浓缩，制得浸膏；

优选的，干果粉碎后颗粒过20目筛网，用乙醇溶液分两次浸润提取，室温负压过滤，合并滤液，滤液浓缩在高温负压条件下进行。

优选的，所述两次浸润提取的参数为：第一次浸润提取的乙醇浓度为60~80%，料液比为1:15~1:25，温度为60℃~80℃，时间为60~90min，第二次浸润提取的乙醇浓度为60~80%，料液比为1:10~1:15，温度为60℃~80℃，时间为30~60min；所述滤液浓缩的参数为：温度为70℃~80℃，压强为-0.06MPa~-0.08MPa，体积浓缩比为10；

步骤（2）得到的浸膏中，罗汉果总苷含量为12~15%，罗汉果甜苷Ⅴ的含量为3~8%；

（3）洗脱浓缩：将步骤（2）制备的浸膏稀释，脱色过滤后，注入大孔树脂柱中进行洗脱，洗脱液浓缩干燥，制得罗汉果总苷；

优选的，用水对浸膏进行稀释溶解，并加入适量活性炭脱色一定时间，脱色后的浸膏溶液减压过滤后，以一定流速注入到LX-T5大孔树脂柱中，设置洗脱参数，用水和不同浓度的乙醇溶液依次洗脱，收集最后一道洗脱后的洗脱液，并将洗脱液在一定条件下进行浓缩干燥。

优选的，所述溶解浸膏用水量为浸膏体积的15~20倍，所述活性炭的加入量为1~1.5g/100ml水，所述脱色时间为30~60min，所述浸膏溶液入柱流速为1倍浸膏体积/h；所述洗脱参数为：用水、20~30%乙醇溶液和70~80%乙醇溶液作为洗脱液依次洗脱，单次洗脱的洗脱液用量为浸膏体积的15~25倍，洗脱流速为1~1.5倍浸膏体积/h；所述洗脱液浓缩参数为：温度为65℃~75℃，压强为-0.06MPa~-0.08MPa，体积浓缩比为10；所述干燥为真空干燥。

步骤（3）得到的罗汉果总苷中，罗汉果总苷含量为85~95%，罗汉果甜苷Ⅴ的含量为47~65%；

（4）超滤除杂：将步骤（3）制得的罗汉果总苷溶于适量水中，通过超滤系统进行过滤，得到的滤液喷雾干燥，制得罗汉果甜苷Ⅴ半成品；

优选的，所述溶解罗汉果总苷的用水量为罗汉果总苷体积的5~10倍，所述超滤系统截留分子量为3000，所述超滤系统过滤的参数为：过滤压力为1.0~2.0MPa，过滤温度为15℃~25℃，滤液的电导率不大于1000µs/cm；所述喷雾干燥的参数为：入口温度为180℃~190℃，出口温度为90℃~100℃。

步骤（4）中得到的罗汉果甜苷Ⅴ半成品中，罗汉果甜苷Ⅴ含量为73~86%；

（5）洗脱干燥：将步骤（4）中制得的罗汉果甜苷Ⅴ半成品用适量水溶解，注入聚酰胺柱中，通过调节乙醇浓度进行梯度洗脱，收集最后一道洗脱后的洗脱液，将收集的洗脱液浓缩至原有体积的十分之一，再加入适量水调节溶液密度，喷雾干燥，即制得罗汉果甜苷Ⅴ成品。

优选的，所述溶解罗汉果甜苷Ⅴ半成品的用水量为罗汉果甜苷Ⅴ半成品体积的2~4倍；所述梯度洗脱的参数为：用20~30%乙醇溶液、45~55%乙醇溶液、75~85%乙醇溶液作为洗脱液依次洗脱，洗脱流速为0.5~2BV/h，单次洗脱的洗脱液用量为15-20BV；所述加水调节后溶液密度为1.10~1.16g/cm³，所述喷雾干燥的参数为：入口温度为180℃~190℃，出口温度为90℃~100℃。

步骤（5）中得到的罗汉果甜苷Ⅴ成品中，罗汉果甜苷Ⅴ含量为98%以上。

本发明中的BV指料液比，意为相对于1kg固体原料所需溶液的体积，即单次洗脱液用量体积（L）为罗汉果甜苷Ⅴ半成品质量（Kg）的倍数；洗脱流速BV/h，意为每小时通过的溶液的体积（L）为原料质量（Kg）的倍数，即洗脱流速为每小时通过的洗脱液体积（L）为罗汉果甜苷Ⅴ半成品质量（Kg）的倍数。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

（1）通过鲜果干制，以干果为原料制备，打破了罗汉果甜苷Ⅴ的生产受罗汉果期影响的局限性，能连续生产，提高产品的产量，增强产品的竞争力；

（2）利用鲜果干制方法，有效降低了罗汉果自身酶解反应，通过干果制备浸膏，再通过大孔树脂柱洗脱，超滤系统过滤干燥、以及聚酰胺树脂柱梯度洗脱，工艺流程短，所需时间少，分离效果明显，产率高，制备的罗汉果甜苷Ⅴ产品外观颜色纯正，无杂色，收率与含量均高，其中收率可达到1.7~2.3%，转化率高达94%；

（3）使用的有机溶剂仅为乙醇，且大部分乙醇在减压浓缩时回收重复利用，对环境污染较小，每个环节产生的废弃物均可作为副产品出售，有效的控制了环境污染，绿色环保。

附图说明

图1是实施例1制备罗汉果甜苷Ⅴ的工艺流程图；

图2是实施例1罗汉果原料的HPLC图谱，其中纵坐标表示峰面积，横坐标表示分离时间；

图3是实施例1制备的罗汉果甜苷Ⅴ的图谱，其中纵坐标表示峰面积，横坐标表示分离时间；

图4是罗汉果甜苷Ⅴ对照品的HPLC图谱，其中纵坐标表示峰面积，横坐标表示分离时间。

具体实施方式

（1）鲜果干燥：将新鲜的成熟期罗汉果干燥处理；

优选的，干燥方法为真空、微波混用干燥法；

下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。

实施例1

以罗汉果干果为原料，制备高含量罗汉果甜苷Ⅴ的具体工艺流程如下：

（1）罗汉果干果的制备

选取日龄90d的罗汉果（湖南省永州市双牌县产），经检验，其中罗汉果总苷含量为3.23%，罗汉果甜苷Ⅴ含量为2.08%，在新鲜罗汉果果身以打孔机扎出10个小孔，孔径为2.0mm，深度为2.0cm，将其置入真空微波干燥箱中，控制真空度为-0.07MPa，控制微波频率2450MHz，干燥至罗汉果水分小于5%。

（2）罗汉果浸膏的制备

将罗汉果粉碎成大小均匀的粉末，过20目筛网，按照料液比为1:20，加入70%乙醇溶液，在70℃浸润提取90min后过滤，按照料液比1:10，在滤渣中加入70%乙醇溶液，在70℃浸润提取30min，常温负压过滤后将滤液合并，将滤液在温度75℃，压强-0.07MPa下，浓缩至原有体积的十分之一，制得浸膏。

（3）罗汉果总苷的制备

在浸膏中加入浸膏体积15倍的水，将浸膏溶解，按照1.5g/100ml水加入活性炭，搅拌脱色30min后常压过滤，滤液以1倍浸膏体积/h的流速注入LX~T5树脂柱中，以1倍浸膏体积/h的流速，依次缓慢流过浸膏体积20倍的水、15倍的25%乙醇溶液和20倍的75%乙醇溶液，将最后一道75%乙醇溶液洗脱液收集，在70℃、-0.07MPa下浓缩至原有体积的十分之一，真空干燥后，得到罗汉果总苷。

（4）罗汉果总苷的除杂

在罗汉果总苷中加入罗汉果总苷体积10倍的水，将罗汉果总苷溶解于水中，选择截留分子量为3000的超滤系统，控制压力为1.5MPa，控制水温为20℃，过滤后对滤液进行测试，要求电导率不大于1000µs/cm，若高于则重复过滤，将滤液喷雾干燥，设置入口温度为185℃，出口温度控制在95℃，得到罗汉果甜苷Ⅴ半成品。

（5）罗汉果甜苷Ⅴ的制备

在罗汉果甜苷Ⅴ半成品中加入其体积3倍的水，将罗汉果甜苷Ⅴ半成品溶于水中，再将其注入聚酰胺树脂柱中，以每小时流过罗汉果甜苷Ⅴ半成品质量1倍体积溶液的流速，依次缓慢流过罗汉果甜苷Ⅴ半成品质量15倍体积的20%乙醇溶液、15倍体积的50%乙醇溶液和20倍体积的80%乙醇溶液，收集80%乙醇溶液洗脱液，浓缩至原有体积的十分之一后，加水将溶液密度调节至1.14g/cm³，喷雾干燥，设置入口温度为185℃，出口温度控制在95℃，收集干燥后的粉末，即得到罗汉果甜苷Ⅴ成品。

实施例2

以罗汉果干果为原料，制备高含量罗汉果甜苷Ⅴ的具体工艺流程如下

（1）罗汉果干果的制备

选取日龄85d的罗汉果（湖南省永州市双牌县产），经检验，其中罗汉果总苷含量为3.16%，罗汉果甜苷Ⅴ含量为1.84%，在新鲜罗汉果果身以打孔机扎出10个小孔，孔径1.5mm，深度为2.0cm，将其置入真空微波干燥箱中，控制真空度为-0.07MPa，控制微波频率2450MHz，干燥至罗汉果水分小于5%。

（2）罗汉果浸膏的制备

将罗汉果粉碎成大小均匀的粉末，过20目筛网，按照料液比为1:20，加入70%乙醇溶液，在70℃浸润提取90min后过滤，按照料液比1:15，在滤渣中加入75%乙醇溶液，在70℃浸润提取30min，常温负压过滤后将滤液合并，将滤液在温度75℃，压强-0.07MPa下，浓缩至原有体积的十分之一，制得浸膏。

（3）罗汉果总苷的制备

在浸膏中加入浸膏体积20倍的水，将浸膏溶解，按照1.5g/100ml水加入活性炭，搅拌脱色30min后常压过滤，滤液以1倍浸膏体积/h的流速注入LX~T5树脂柱中，以1倍浸膏体积/h的流速，依次缓慢流过浸膏体积25倍的水、25倍的25%乙醇溶液和25倍的75%乙醇溶液，将最后一道75%乙醇溶液洗脱液收集，在70℃、-0.07MPa下浓缩至原有体积的十分之一，真空干燥后，得到罗汉果总苷。

（4）罗汉果总苷的除杂

在罗汉果总苷中加入罗汉果总苷体积15倍的水，将罗汉果总苷溶解于水中，选择截留分子量为3000的超滤系统，控制压力为1.5MPa，控制水温为20℃，过滤后对滤液进行测试，要求电导率不大于1000µs/cm，若高于则重复过滤，将滤液喷雾干燥，设置入口温度为180℃，出口温度控制在90℃，得到罗汉果甜苷Ⅴ半成品。

（5）罗汉果甜苷Ⅴ的制备

在罗汉果甜苷Ⅴ半成品中加入其体积2.5倍的水，将罗汉果甜苷Ⅴ半成品溶于水中，再将其注入聚酰胺树脂柱中，以每小时流过罗汉果甜苷Ⅴ半成品质量1倍体积溶液的流速，依次缓慢流过罗汉果甜苷Ⅴ半成品质量20倍体积的20%乙醇溶液、20倍体积的50%乙醇溶液和20倍体积的80%乙醇溶液，收集80%乙醇溶液洗脱液，浓缩至原有体积的十分之一后，加水将溶液密度调节至1.14g/cm³，喷雾干燥，设置入口温度为185℃，出口温度控制在95℃，收集干燥后的粉末，即得到罗汉果甜苷Ⅴ成品。

采用HPLC法对罗汉果干果原料、实施例1所制的罗汉果甜苷Ⅴ成品以及罗汉果甜苷Ⅴ对照品进行表征，罗汉果甜苷Ⅴ含量测定标准：使用液相色谱检测，参照中国药典2015版中罗汉果的细则，按照高效液相色谱法（通则0512）测定。

图2~4分别为罗汉果原料、实施例1制备的罗汉果甜苷Ⅴ和罗汉果甜苷Ⅴ对照品的HPLC图谱，从图4中可知，分离时间25min时的对应峰为罗汉果甜苷Ⅴ的特征峰，对比图2和图3可知，图2中罗汉果甜苷Ⅴ的特征峰非常小，其他特征峰较大，表明罗汉果原料中，罗汉果甜苷Ⅴ的含量较低，而图3中罗汉果甜苷Ⅴ的特征峰非常显著，而其他细小杂峰较少，表明罗汉果甜苷Ⅴ的含量高，纯度大。通过外标法进行检测，测定实施例1中罗汉果甜苷Ⅴ含量为98.31%，纯度达到99.43%，同时，通过计算，实施例1所述制备方法的收率为1.7~2.3%，转化率达到94%。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种罗汉果甜苷Ⅴ的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

（1）鲜果干燥：将新鲜的成熟期罗汉果干燥处理；

2.根据权利要求1所述的一种罗汉果甜苷Ⅴ的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中干燥前在罗汉果表面扎孔，所述干燥方法包括真空干燥法、微波干燥法、鼓风干燥法和远红外干燥法。

3.根据权利要求2所述的一种罗汉果甜苷Ⅴ的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中扎孔的孔径为2.0~2.5mm，扎孔深度为1.5~2.0cm，所述干燥的温度为55℃~65℃，干燥后罗汉果的含水量小于5%。

4.根据权利要求1所述的一种罗汉果甜苷Ⅴ的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中干果粉碎后颗粒过20目筛网，用乙醇溶液分两次浸润提取，室温减压过滤，合并滤液，滤液浓缩在高温负压条件下进行。

5.根据权利要求4所述的一种罗汉果甜苷Ⅴ的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中所述两次浸润提取的参数为：第一次浸润提取的乙醇浓度为60~80%，料液比为1:15~1:25，温度为60℃~80℃，时间为60~90min，第二次浸润提取的乙醇浓度为60~80%，料液比为1:10~1:15，温度为60℃~80℃，时间为30~60min；所述滤液浓缩的参数为：温度为70℃~80℃，压强为-0.06MPa~-0.08MPa，体积浓缩比为10。

6.根据权利要求1所述的一种罗汉果甜苷Ⅴ的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中用水对浸膏进行稀释溶解，并加入适量活性炭脱色一定时间，脱色后的浸膏溶液减压过滤后，以一定流速注入到LX-T5大孔树脂柱中，设置洗脱参数，用水和不同浓度的乙醇溶液依次洗脱，收集最后一道洗脱后的洗脱液，并将洗脱液在一定条件下进行浓缩干燥。

7.根据权利要求6所述的一种罗汉果甜苷Ⅴ的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中所述溶解浸膏用水量为浸膏体积的15~20倍，所述活性炭的加入量为1~1.5g/100ml水，所述脱色时间为30~60min，所述浸膏溶液入柱流速为1倍浸膏体积/h；所述洗脱参数为：用水、20~30%乙醇溶液和70~80%乙醇溶液作为洗脱液依次洗脱，单次洗脱的洗脱液用量为浸膏体积的15~25倍，洗脱流速为1~1.5倍浸膏体积/h；所述洗脱液浓缩参数为：温度为65℃~75℃，压强为-0.06MPa~-0.08MPa，体积浓缩比为10；所述干燥为真空干燥。

8.根据权利要求1所述的一种罗汉果甜苷Ⅴ的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中所述溶解罗汉果总苷的用水量为罗汉果总苷体积的5~10倍，所述超滤系统截留分子量为3000，所述超滤系统过滤的参数为：过滤压力为1.0~2.0MPa，过滤温度为15℃~25℃，滤液的电导率不大于1000µs/cm；所述喷雾干燥的参数为：入口温度为180℃~190℃，出口温度为90℃~100℃。

9.根据权利要求1所述的一种罗汉果甜苷Ⅴ的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）中所述溶解罗汉果甜苷Ⅴ半成品的用水量为罗汉果甜苷Ⅴ半成品体积的2~4倍；所述梯度洗脱的参数为：用20~30%乙醇溶液、45~55%乙醇溶液、75~85%乙醇溶液作为洗脱液依次洗脱，洗脱流速为0.5~2BV/h，单次洗脱的洗脱液用量为15-20BV；所述加水调节后溶液密度为1.10~1.16g/cm³，所述喷雾干燥的参数为：入口温度为180℃~190℃，出口温度为90℃~100℃。