CN111329852A

CN111329852A - 4-苯基丁酸类衍生物在制备治疗脑缺血再灌注损伤的药物中的用途

Info

Publication number: CN111329852A
Application number: CN202010288061.8A
Authority: CN
Inventors: 叶晓霞; 范兰兰; 孔珊珊
Original assignee: Wenzhou Medical University
Current assignee: Wenzhou Medical University
Priority date: 2020-04-14
Filing date: 2020-04-14
Publication date: 2020-06-26

Abstract

本发明提供一种4‑苯基丁酸类衍生物在制备治疗脑缺血再灌注损伤的药物中的用途，属于药物化学领域。其中，4‑苯基丁酸类衍生物包括3‑吲哚丁酸、2‑氧代‑4‑苯基丁酸、(R)‑2‑羟基‑4‑苯基丁酸、1‑芘丁酸、及4‑(4‑氨基苯基)丁酸这五种化合物。发明人研究发现，这类4‑苯基丁酸类衍生物能够通过对内质网应激和神经细胞自噬的双重抑制作用，极大的减少脑缺血再灌注后的脑梗死面积，对脑缺血再灌注损伤起到保护作用，具有很好的应用前景。

Description

4-苯基丁酸类衍生物在制备治疗脑缺血再灌注损伤的药物中的用途

技术领域

本发明涉及药物化学领域，具体而言，本发明涉及一种4-苯基丁酸类衍生物在制备治疗脑缺血再灌注损伤的药物中的用途。

背景技术

缺血性脑卒中的高发病率、高致死率及高致残率严重威胁着人类的健康，在世界范围内，每年有超过560万人因脑缺血而导致残疾或死亡。我国现有脑卒中患者1300万，每年新发患者约200万，其中致死致残率达30-40％。临床上对缺血性脑卒中的治疗原则是及时开通血管，恢复血流，但是当大脑缺血一段时间，再恢复血液供应，会出现脑缺血再灌注损伤(Cerebral Ischemic Reperfusion Injury,CIRI)，引起神经细胞的死亡致使脑组织及其功能受到进一步损害。

目前对于CIRI保护药物的研究较少，用于临床实践的CIRI的保护药物非常有限。主要有以下四类：1.自由基清除剂及抗氧化剂，如依达拉奉，目前临床使用最多但其价格昂贵且临床效果有限；2.钙离子通道阻滞剂，如尼莫地平，其使用有一定的局限性，易引起继发性脑水肿或颅内压增高；3.中成药类，如银杏叶提取物，然而中成药的分子作用机制不明，非单体疗效不利于走向国际；4.小分子多肽类，如碱性成纤维生长因子(bFGF)，但多肽类药物难以穿过血脑屏障，研究还局限在实验室阶段。

基于此，开发对脑缺血再灌注损伤有保护作用的药物具有非常重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种4-苯基丁酸类衍生物在制备治疗脑缺血再灌注损伤的药物中的用途。申请人研究发现，这类4-苯基丁酸类衍生物能够极大的减少脑缺血再灌注后的脑梗死面积，对CIRI起到了保护作用，具有很好的应用前景。

本发明是这样实现的：

CIRI是一个复杂的病理生理过程，导致单一机制作用的药物治疗很难达到理想的效果。目前，CIRI明确的机制主要为神经细胞过度自噬和内质网过度应激引起神经细胞大量凋亡。大量的自由基产生和氧化应激引起内质网功能紊乱，比如Ca²⁺稳态破坏会造成内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)。如果内质网应激持续或变强，神经细胞将会启动凋亡程序。过度的内质网应激会引起过度自噬，进而会使神经细胞自噬性死亡。因此选择性地抑制内质网应激和自噬的强度和持续时间，可以有效降低内质网应激和自噬的毒副作用和凋亡率，从而对CIRI起到保护作用。

化学分子伴侣类如4-苯基丁酸(4-PBA)是经美国食品药品监督管理局(FDA)批准上市的可经口服给药并具有生物活性的小分子化学分子伴侣，已确证其发挥生物活性是通过加速内质网内蛋白的折叠、稳定未成熟蛋白防止其作物折叠以及阻滞为折叠蛋白的聚集等来减少内质网应激。且有大量文献报道4-PBA是一种氨清除剂，可用于治疗小儿尿素循环障碍疾病，同时也可用于镰状细胞贫血病和地中海贫血病的治疗，且其在阿尔茨海默症及帕金森病上均有疗效，原因是4-PBA能够很好的透过血脑屏障，并具有很好的神经保护生物活性。然而，申请人在研究中发现4-PBA对神经元细胞PC12内质网过度应激模型和自噬模型的抑制作用并不强。

由于4-PBA已成为FDA授权批准药物，且其能够透过血脑屏障，申请人在探索对大鼠全脑缺血再灌注保护作用机制的研究中，以4-PBA为母核结构，开发对大鼠全脑缺血再灌注损伤有保护作用的药物分子，并将此类化合物统称为4-苯基丁酸类衍生物。

基于此，第一方面，本发明提供一种4-苯基丁酸类衍生物在制备治疗脑缺血再灌注损伤的药物中的用途，其中，所述4-苯基丁酸类衍生物的结构如下所示：

上述五种结构的4-苯基丁酸类衍生物，分别为3-吲哚丁酸(化合物A)、2-氧代-4-苯基丁酸(化合物C)、(R)-2-羟基-4-苯基丁酸(化合物D)、1-芘丁酸(化合物G)；4-(4-氨基苯基)丁酸(化合物N)。这五种化合物均具有分子量小、极性不大，易通过血脑屏障、可采用腹腔注射的简便给药方式等优点。申请人研究发现，这五种4-苯基丁酸类衍生物(尤其是4-对氨基苯基丁酸)，对内质网应激的抑制作用强于4-苯基丁酸，而且能够同时抑制处于应激状态的PC12细胞的自噬，提高细胞生存率。

申请人进一步将4-对氨基苯基丁酸(化合物N)尝试在大鼠全脑缺血再灌注前，腹腔注射该化合物，实验结果表明，4-对氨基苯基丁酸通过抑制ERS和自噬，大大减少了大鼠脑缺血再灌注后脑梗死面积，对CIRI起到了保护作用。由此提示，这五种4-苯基丁酸类衍生物能够通过对内质网应激和神经细胞自噬的双重抑制作用，发挥对脑缺血再灌注损伤的保护作用，可用于制备预防或治疗脑缺血再灌注损伤的药物。

基于上述研究结果，本发明第二方面，提供一种4-苯基丁酸类衍生物在制备内质网应激抑制剂中的用途；一种4-苯基丁酸类衍生物在抑制内质网应激导致的神经细胞凋亡的药物中的用途；以及一种4-苯基丁酸类衍生物在制备治疗内质网应激诱导疾病的药物中的用途。

该五种4-苯基丁酸类衍生物通过对GRP78蛋白和CHOP蛋白的下调作用，实现对内质网应激的抑制作用，且表现出比4-苯基丁酸(此为常用的内质网应激抑制剂)更好的抑制效果。进一步对这五种化合物进行浓度梯度筛选发现，化合物A使GRP78蛋白和CHOP蛋白的表达量下降量相对对照组始终有统计学意义，化合物A在8μM、5μM、2μM浓度下，均具有较强的抑制内质网应激活性，且其与同浓度下的4-PBA相比，对GRP78及CHOP的表达抑制作用均强于4-PBA，表明在2μM低浓度下化合物A抑制内质网应激的活性仍强于4-PBA。由此说明，这五种化合物能够有效抑制内质网应激，可用于制备内质网抑制剂，用于制备治疗内质网应激诱导疾病的药物，其中应激诱导疾病包括缺血性脑卒中、糖尿病、神经退行性疾病、病毒性肝炎。

第三方面，本发明还提供一种该4-苯基丁酸类衍生物在制备抑制神经细胞自噬的药物中的用途。在本发明的一些实施例中，该4-苯基丁酸类衍生物的结构为：

发明人通过进行自噬活性筛选研究发现，化合物A、C、D、G、N能够下调Benclin-1、Atg7和LC3这几种与细胞自噬相关蛋白的表达量，其中，以化合物N的作用最佳。由此说明这五种化合物具有较强的抑制细胞自噬，提高细胞生存率的作用，可用于制备抑制神经细胞自噬的药物。

对化合物N的活性进一步研究，细胞免疫荧光实验结果表明，化合物N可以降低LC3和PDI的表达，即抑制自噬和内质网应激。AnnexinV/PI双染法实验结果表明化合物N可以通过抑制内质网应激和自噬降低细胞的凋亡率。化合物N也能通过降低磷酸化的AMPK和升高磷酸化的mTOR来抑制自噬。由此说明，化合物N具有更大的药用潜力。

第四方面，本发明还提供一种治疗脑缺血再灌注损伤的药物，所述药物的活性成分为上述4-苯基丁酸类衍生物中的至少一种。

在可选的实施方式中，该药物还包括一种或多种药学上可接受的载体。其中，“药学上可接受的载体”是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙/镁、聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明提供的药物的各种剂型，可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。所述药物的制剂形式包括注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、软膏剂、控释或缓释剂或纳米制剂。

本发明提供的药物的给药形式通过口服、鼻吸入、直肠或者肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其它液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为MTT法检测化合物A-M的细胞毒性；其中，图a为化合物A-E的检测结果；图b为化合物F-M的检测结果。测试时包括：空白组，不加TG诱导和化合物；药物组，正常细胞加A-M相应的化合物，给药组终浓度均为10μM。

图2为MTT法检测化合物A-M及C′、D′、E′的细胞存活率；其中，图a为化合物A-E′的检测结果；图b为化合物F-M的检测结果。测试时包括：空白组，不加TG诱导和化合物；阳性组，加TG诱导内质网应激反应，不加化合物；加药测试组，加TG，加用PBS溶解的化合物，化合物浓度为10μM。独立实验重复次数n>3，^#p<0.0001，与CON组比较；^*p<0.05，^***p<0.0001，与TG组比较。

图3为western blotting法检测化合物A-M作用内质网应激PC12细胞中GRP78蛋白的表达；其中，图a和图c为化合物A-E对GRP78蛋白的表达情况及结果分析图；图b和图d为化合物F-M对GRP78蛋白的表达情况及结果分析图。测试时包括：空白组，不加TG诱导和化合物；阳性组，加TG诱导内质网应激反应，不加化合物；加药测试组，加TG，加用PBS溶解的化合物，化合物浓度为10μM。独立实验重复次数n>3，^#p<0.0001，与CON组比较；^*p<0.05，^**0.0001<p<0.05，与TG组比较。

图4为western blotting法检测化合物4-PBA(8μM)、A、C、D作用内质网应激PC12细胞中GRP78和CHOP蛋白的表达；其中，图a1为各化合物对CHOP和GRP78蛋白的表达情况；图a2和图a3分别为其对CHOP和GRP78蛋白的结果分析图。测试时包括：空白组，不加TG诱导和化合物；阳性组，加TG诱导内质网应激反应，不加化合物，TG浓度为10μM；加药测试组，加TG，加用PBS溶解的化合物，分别为P10、P8、A、C、D浓度为4-PBA(10μM)、4-PBA(8μM)、A(8μM)、C(8μM)、D(8μM)。独立实验重复次数n>3，^#p<0.0001，与CON组比较；^*p<0.05，^**0.0001<p<0.05，与TG组比较。

图5为western blotting法检测化合物4-8PBA(5μM)、A、C、D作用内质网应激PC12细胞中GRP78蛋白的表达；其中，图b1和图b2分别为各化合物对GRP78蛋白的表达情况及结果分析图。测试时包括：空白组，不加TG诱导和化合物；阳性组，加TG诱导内质网应激反应，不加化合物，TG浓度为10μM；加药测试组，加TG，加用PBS溶解的化合物，分别为P10、P5、A、C、D浓度为4-PBA(10μM)、4-PBA(5μM)、A(5μM)、C(5μM)、D(5μM)。独立实验重复次数n>3，^#p<0.0001，与CON组比较；^*p<0.05，^**0.0001<p<0.05，与TG组比较。

图6为western blotting法检测化合物4-PBA(2μM)、A、C、D作用内质网应激PC12细胞中GRP78和CHOP蛋白的表达；其中，图c1为各化合物对CHOP和GRP78蛋白的表达情况；图c2和图c3分别为其对CHOP和GRP78蛋白的结果分析图。测试时包括：空白组，不加TG诱导和化合物；阳性组，加TG诱导内质网应激反应，不加化合物，TG浓度为10μM；加药测试组，加TG，加用PBS溶解的化合物，分别为P10、P2、A、C、D浓度为4-PBA(10μM)、4-PBA(2μM)、A(2μM)、C(2μM)、D(2μM)。独立实验重复次数n>3，^#p<0.0001，与CON组比较；^*p<0.05，^**0.0001<p<0.05，与TG组比较。

图7为western blotting法检测化合物C、C′、D、D′、E、E′作用内质网应激PC12细胞中GRP78蛋白的表达；其中，图a和图b分别为化合物对GRP78蛋白的表达情况及结果分析图。测试时包括：空白组，不加TG诱导和化合物；阳性组，加TG诱导内质网应激反应，不加化合物；加药测试组，加TG，加用PBS溶解的化合物，化合物浓度为10μM。

图8western blotting法检测化合物N、G作用内质网应激PC12细胞中GRP78蛋白的表达；其中，图a和图b为给药浓度为10μM时，各化合物对GRP78蛋白的表达情况及结果分析图；图c和图d为给药浓度为5μM时，各化合物对GRP78蛋白的表达情况及结果分析图。测试时包括：空白组，不加TG诱导和化合物；阳性组，加TG诱导内质网应激反应，不加化合物；加药测试组，加TG，加用PBS溶解的化合物，化合物给药终浓度为10μM、5μM。独立实验重复次数n>3，^#p<0.0001，与CON组比较；^*p<0.05，^**0.0001<p<0.05，与TG组比较。

图9为western blotting法检测化合物N、A作用内质网应激PC12细胞中GRP78蛋白的表达；其中，图a和图b分别为化合物对GRP78蛋白的表达情况及结果分析图。测试时包括：空白组，不加TG诱导和化合物；阳性组，加TG诱导内质网应激反应，不加化合物；加药测试组，加TG，加用PBS溶解的化合物，为P10、P5、A、N的浓度为PBA(10μM)、PBA(5μM)、A(5μM)、N(5μM)。独立实验重复次数n>3，^#p<0.0001，与CON组比较；^*p<0.05，^**0.0001<p<0.05，与TG组比较。

图10为细胞免疫荧光法检测化合物N作用内质网应激PC12细胞中GRP78和CHOP蛋白的表达；测试时包括：空白组，不加TG诱导和化合物；阳性组，加TG诱导内质网应激反应，不加化合物；加药测试组，加TG，加用PBS溶解的化合物，给药终浓度为10μM。

图11为western blotting法检测化合物N作用内质网应激PC12细胞中通路蛋白的表达；其中，图a1和图a2对应ATF6蛋白的表达情况及结果分析图；图b1和图b2对应XBP-1蛋白的表达情况及结果分析图；图c1和图c2对应PERK蛋白的表达情况及结果分析图；图d1和图d2对应Caspase12蛋白的表达情况及结果分析图。测试时包括：CON组为阴性对照组，TG组为模型组，N组为直接给药而未加TG组，NT组为给化合物N和TG组，终浓度均为10μM。独立实验重复次数n>3，^#p<0.0001，与CON组比较；^*p<0.05，^**0.0001<p<0.05，与TG组比较。

图12表示PBA类衍生物在H₂O₂诱导下自噬蛋白的表达；其中图(A)为化合物A-H自噬蛋白的表达情况；图(B)为化合物I-E’自噬蛋白的表达情况。图(C)和图(F)表示PBA类衍生物Atg7蛋白的表达情况；图(D)和图(G)表示PBA类衍生物Beclin-1蛋白的表达情况；图(E)和图(H)表示PBA类衍生物LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白的表达情况。化合物终浓度为10μM，3-MA终浓度为25μM，预给药1h后加入500μM H₂O₂后4h检测蛋白表达情况。CON组表示正常细胞组。数据表示为平均值±SD，n＝3。^###P＜0.001，^##P＜0.005，^#P＜0.05相对于con组，^***P＜0.001，^**P＜0.005，^*P＜0.05相对于H₂O₂组。

图13为在动物层面用MCAO模型来看化合物N对脑缺血再灌注损伤的作用；图(A)、图(B)和图(C)表示化合物N以30mg/kg的浓度腹腔注射，在MCAO的条件下TTC染色及脑梗死面积统计图和神经评分。数据表示为平均值±SD，n＝3。^###P＜0.001，^##P＜0.005，^#P＜0.05相对于sham组，^***P＜0.001，^**P＜0.005，^*P＜0.05相对于NS组。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

发明人经前期实验筛选具有保护脑缺血再灌注损伤的化合物，得到17个4-苯基丁酸类化合物，具体结构如下：

发明人再对上述17个化合物的其生物活性进行更加深入的研究，具体如下：

实施例1

检测化合物的细胞毒性

采用MTT法检测化合物的细胞毒性，具体步骤如下：状态良好的细胞长满皿底面积的90％左右后，将细胞传代至96孔板中，每孔加入100μL细胞悬液，使每孔传入约1x105个细胞(细胞计数法)，每个样品设6个复孔，同时设置空白组与对照组，96孔板的边缘孔每孔加入100μLPBS缓冲液，铺板完成；待其长满70％左右时换饥饿培养基继续培养22-24h；

饥饿24h后再给其换成完全培养基培养，并同时给药，恒温培养箱培养24h；24h后在避光条件下直接加入MTT液，每孔20μL，恒温箱培养4h；4h后吸弃原有培养液，每孔加入DMSO150μL，置于微孔振荡器上震荡10min使蓝色结晶完全溶解，最后在酶标仪490nm处测定OD值。

结果如图1所示，这些化合物对细胞没有细胞毒性，适宜继续研究。

实施例2

检测化合物的对细胞的存活率

按照实施例1中的方法进行细胞培养、传代、铺板。其中进行预给药后1h每实验孔均给予TG(终浓度10μM)，再放入恒温培养箱培养24h；24h后在避光条件下直接加入MTT液，每孔20μL，恒温箱培养4h；4h后吸弃原有培养液，每孔加入DMSO150μL，置于微孔振荡器上震荡10min使蓝色结晶完全溶解，最后在酶标仪490nm处测定OD值。

细胞存活率/％＝OD490(给药组-空白组)/OD490(对照组-空白组)×100％

结果如图2所示，各组的细胞存活率对于TG组都有统计学意义。说明这些化合物对于TG引发的细胞生存率的下降有一定的逆反作用。对于此模型，这些化合物有继续研究的意义。其中化合物A、D、G的细胞存活率较高，A几乎与正常细胞水平相近，活性较好。

实施例3

Western-blotting法检测4-PBA抑制活性

采用western blotting对于化合物A-M作用内质网应激PC12细胞中GRP78和CHOP蛋白的表达。

(1)从培养箱中取出处于对数生长期，长势密集的细胞，消化，传代，将细胞铺入六孔板中。

(2)在加入刺激物前将隔夜的培养基换成新鲜已配好的培养基，各个培养皿中加入2μL的不同浓度的药物，并设置阴性对照DMSO，阳性对照TG。药物终浓度为10μM。

(3)药物孵育24h后收集蛋白样品，加入裂解混合液100μL，冰上裂解20min。用刮棒刮下细胞，用移液枪吸取转移至EP管内，4℃，12000r/min，离心5min。取上清测在595nm处测吸光度，配制蛋白样品。

(4)配15％的SDS-PAGE凝胶，将蛋白样品上样到加样孔，加蛋白预染marker。浓缩胶为80V，30min，到分离胶时调至120V，1h。待样品完全分离后，取胶，切取所需片段，配电转液转膜300mA，1.5h。

(5)将膜放在5％的牛奶放在摇床上缓慢摇动，室温封闭1h。

(6)一抗孵育，4℃，过夜。

(7)二抗孵育，室温，1h

(8)孵育好二抗后用TBST洗膜3次，每次7min。曝光。

结果如图3所示，从中可以看出A、C、D、G化合物被证明有抑制内质网应激活性，因为它们能够抑制内质网应激的标志性蛋白GRP78的表达。

实施例4

化合物浓度梯度筛选

采用western blotting法对PBA、A、C、D这几个化合物进行浓度梯度筛选，使终浓度依次按10μM、8μM、5μM、2μM减小，以10μM浓度的PBA为阳性对照。

结果如图4-6所示：

在终浓度为8μM时(如图4所示)，PBA和A从GRP78和CHOP蛋白上显示出较好的抑制内质网应激的效果，而C和D的效果就没有很理想。在终浓度为5μM和2μM时(如图5和图6所示)，A在GRP78和CHOP这两个蛋白上始终显示比较理想的抑制效果，甚至要优于10μM的PBA的抑制效果。所以，化合物A在8μM、5μM、2μM浓度下均具有较强的抑制内质网应激活性，且其与同浓度下的4-PBA相比，对GRP78及CHOP的表达抑制作用均强于4-PBA，表明在2μM低浓度下化合物A抑制内质网应激的活性仍强于4-PBA。

实施例5

4-PBA类似物中酯化与非酯化结构活性比较

为了探究化合物结构中的羧基是否为抑制ERS活性作用的关键基团，特地选择化合物C、D、E的酯化产物化合物C′、D′、E′与其做比较，采用western blotting法，实验步骤如实施例3。

结果如图7所示，虽然化合物C、D在10μM时有存在抑制作用，化合物E虽然不存在抑制活性。从成药性角度考虑，酯基结构比羧基结构极性小，更容易透过生物膜，从而产生更强的药效。由图可知，化合物C与C′、D与D′、E与E′抑制内质网应激活性作用的差异非常小；由此可见，羧基并非4-PBA类似物的抑制ERS活性的关键基团。

实施例6

化合物N活性验证

综上发明人设计出化合N来探究其抑制内质网应激的活性。分别采用如实施例3所示的western blotting法，做了终浓度为10μM和5μM的两组实验。

结果如图8所示，由此发现化合物N在这两个浓度下都要比4-PBA的抑制GRP78表达的效果要好。化合物N在10μM时对GRP78蛋白的抑制活性较G好，进一步降低浓度至5μM，发现活性依然比G好。

实施例7

化合物N与A活性对比

上述浓度梯度筛选中发现化合物N的抑制效果是最理想的，所以发明人采用如实施例3所示的western blotting法，对化合物N与A进行活性比较。

结果如图9所示，在相同的模型下分组为CON组，TG组，4-PBA(10μM)组，4-PBA(5μM)组，A(5μM)组，N(5μM)组，在GRP78的指标蛋白条带下，化合物N在5μM浓度下活性较同浓度A好，且比10μM浓度下的4-PBA活性更好。

实施例8

化合物N细胞免疫荧光

细胞免疫荧光按照WB的细胞处理办法，进行铺板，24h后用4％多聚甲醛固定，将细胞放在载玻片上孵育一抗，4℃，过夜，之后避光孵育荧光二抗，37℃，1h。封片，拍片。

结果如图10所示，图中红色荧光的是蛋白，蓝色荧光的是细胞核。据图可以看出给入化合物N后TG刺激诱导的ERS标志蛋白GRP78及凋亡标志蛋白CHOP的升高都得到明显的抑制，进一步证实了化合物N的确具有较强的抑制内质网应激的活性。

实施例9

化合物N通路实验

继续采用western blotting法，实验步骤如实施例3，考察化合物N对ERS三条通路及仅与ERS诱导凋亡相关的Caspase12通路的相关蛋白的影响。ERS三条通路分别是ATF6、IRE1、PERK。

结果如图11所示，通过检测ATF6蛋白，IRE1通路的下游蛋白XBP-1蛋白，PERK通路蛋白，Caspase12通路蛋白，发现化合物N可以抑制ATF6和XBP-1蛋白的表达。因此得出化合物N能抑制ATF6及XBP-1的表达，说明化合物N是通过抑制ATF6及IER1通路而不是PERK及Caspase12通路来抑制内质网应激的。

实施例10

CCK8测定化合物对抗H₂O₂引起的细胞自噬性损伤

造模损伤H₂O₂浓度的确定:取对数生长期的细胞，以8000-10000个细胞/孔接种于96孔板，每孔加入100μM培养基，在37℃，5％CO₂的培养箱中过夜。将不同终浓度为100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM的H₂O₂加入细胞后培养4h后加入CCK8溶液，10μL每孔，1-2h后用酶联免疫检测仪于450nm波长处测定其吸光度(A值)，计算细胞生存率(A(加药-空白)/A(0加药-空白))×100％，本实验重复三次。将细胞生存率低于60％时H₂O₂浓度为细胞引起自噬性损伤的模型浓度。

CCK8测定:取对数生长期的PC12细胞，以8000-10000个细胞/孔接种于96孔板，每孔加入100μM培养基，在37℃，5％CO₂的培养箱中过夜。每孔加入终浓度为10μM不同化合物培养24h。到时间后再给予H₂O₂刺激4h,之后加入CCK8溶液放入培养箱中继续培养1-2h后，在酶联免疫检测仪于450nm处测定其吸光度(A值)，DMSO组为空白对照组。计算细胞生存率(A(加药-空白)/A(0加药-空白))×100％，实验重复三次。

实验结果如图12所示，图中显示H₂O₂组较con组蛋白Atg7、Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ表达明显升高，化合物C、F、N、C’使蛋白Atg7、Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ表达均下降。以上化合物使蛋白Atg7、Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ的下降程度较自噬抑制标准对照品3-MA都低，所以其抑制自噬的活性较3-MA强。

实施例12

脑缺血再灌注模型的建立

(1)大脑中动脉栓塞模型：

成年的SD大鼠购自福建吴氏实验动物中心，体重250g左右。分别设置sham组，NS(Normal surgery)组，给药组。每组为8只老鼠。给药时间和给药方式：缺血后腹腔给药。SD大鼠饲养在标准湿度和温度的环境下，12h昼夜交替，并自由进水和进食，实验前禁食12h。SD大鼠以10％的水合氯醛以3.5ml/100g方式麻醉并仰卧固定。颈部正中开1.5-2cm的口，钝性分离皮肉，暴露手术视野，分离右侧颈总动脉(CCA)及伴行的迷走神经、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA),用2.0手术缝线结扎颈外动脉的远侧端，并在近侧设置一个死结。颈内动脉和颈总动脉用止血夹夹闭血管。在距离CCA分叉处0.5mm的ECA血管壁上用弯头注射器戳开一个小口，轻轻带入大鼠的线栓，线栓由颈外插入CCA与ICA的交叉口时，埋入一根线来固定线栓。然后打开ICA上的动脉夹并将线栓由颈外动脉插入颈内动脉。当插入线栓至标记口时并略微有阻力就可以停止插入线栓，将线栓固定，并解除多余的线和动脉夹，缝合颈部皮肤。90min后拔出线栓，进行24h再灌注。

(2)TTC实验

大鼠断头处死迅速取脑(10min内取脑)，置于冰上2-3min，待脑组织略硬。然后将脑组织间隔2mm冠状切6刀，切成6个大脑连续的冠状切面。然后将脑片置于2％TTC的PBS溶液中，37℃恒温避光孵育30min期间间隔10min将脑片翻动一次。经TTC染色后，正常组织呈红色，梗死组织呈白色。取出脑片放入4％多聚甲醛中固定。将脑片按照顺序正确排列，拍照保存，用Image J图像分析软件处理并统计，计算每个脑片的梗死面积并根据脑片厚度计算相对梗死面积。

实验结果由图13所示，结果显示申请人所选的PBA类衍生物对细胞均没有细胞毒性损害，特别是化合物N抑制活性较为突出，进一步采用WB实验发现化合物N对内质网应激标志蛋白GRP78和自噬相关蛋白均具有明显的抑制活性。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。