CN113349300A

CN113349300A - 4-苯基丁酸在制备猪肠道保健产品中的应用

Info

Publication number: CN113349300A
Application number: CN202110629535.5A
Authority: CN
Inventors: 蒋谦; 高静霞; 谭碧娥; 印遇龙
Original assignee: Hunan Agricultural University
Current assignee: Hunan Agricultural University
Priority date: 2021-06-07
Filing date: 2021-06-07
Publication date: 2021-09-07

Abstract

本发明公开了4‑苯基丁酸在制备猪肠道保健产品中的应用。本发明还公开了一种基于4‑苯基丁酸的猪肠道保健产品。发明人研究发现，猪肠道上皮细胞对于4‑苯基丁酸具有较高的浓度耐受性；在安全剂量下，4‑苯基丁酸能有效促进猪肠上皮屏障物理损伤的自我修复，并且对大肠杆菌内毒素及呕吐毒素损伤的肠道上皮屏障完整性、屏障功能与细胞紧密连接蛋白均有促修复的功效。同时，肠溶衣包被的4‑苯基丁酸能显著提高断奶应激仔猪的平均日增重，降低血液中内毒素含量与腹泻率。因此，4‑苯基丁酸、4‑苯基丁酸盐、4‑苯基丁酸衍生物可用于制备猪肠道保健产品，应用于防治不同因素导致的猪肠道屏障损伤与并发症，具有很好的应用前景。

Description

4-苯基丁酸在制备猪肠道保健产品中的应用

技术领域

本发明涉及畜牧兽医领域，具体涉及了4-苯基丁酸、4-苯基丁酸盐以及4-苯基丁酸衍生物在制备猪肠道保健产品中的应用。

背景技术

2020年7月，我国全面禁用了饲用抗生素的使用，生猪养殖业面临了前所未有的挑战。肠上皮屏障是动物机体抵御外来有害物质入侵的第一道防线，肠道屏障功能的完整对于维持动物的健康生长至关重要。大量研究已经证实，饲料及原料中的呕吐毒素超标、病原菌感染、断奶应激、营养性腹泻等负面因素均会造成猪的肠道屏障受损，引起肠道内病原菌及内毒素进行血液循环，导致机体的炎性反应，损伤动物的自我免疫与生长性能。畜牧研究领域419项研究结果提示：肠道屏障功能完整性与动物生长性能密切正相关,预示着保护动物肠道屏障的完整性是改善动物健康与提高生长性能的关键。因此，在饲用抗生素禁用的大背景下，肠道保健产品的开发与应用是实现生猪健康养殖的有效途径。

动物的肠道屏障将机体内循环系统与肠道微生物、内毒素等有害物质分隔开来。肠道屏障的维持很大程度上依赖于肠上皮细胞的稳态，包括细胞紧密连接的完整性、免疫反应、程序性细胞死亡和增殖。猪肠上皮细胞系IPEC-J2是一种来源于未哺乳仔猪空肠的猪肠上皮细胞系，已有研究表明，细菌脂多糖(LPS)、霉菌毒素均会诱导IPEC-J2构建的体外肠道屏障模型发生屏障功能损伤。因此，IPEC-J2细胞构建的体外肠道屏障模型被广泛用于猪的肠道保健产品筛选与功效评估。

4-苯基丁酸(4-PBA)是一种芳香酸类有机化合物，研究发现，4-苯基丁酸对细胞内质网应激的下游分子信号具有良好的调控作用。在1996年，美国食品和药物管理局(FDA)批准使用4-苯基丁酸用于治疗人类尿素循环障碍相关疾病。中国专利CN 110507640 A公开了4-苯基丁酸钠盐在制备治疗I型Bartter综合征药物中的应用，中国专利CN 111329852 A公开了4-苯基丁酸类衍生物在制备治疗脑缺血再灌注损伤的药物中的用途。然而，对于 4-苯基丁酸治疗猪肠道屏障损伤及相应并发症还未有报道。

近年来研究表明，4-苯基丁酸对于小鼠的肠道细胞的内质网应激下游信号也有调控作用。然而4-苯基丁酸是否能调控猪肠道上皮细胞稳态、保护猪肠道屏障功能还不清楚，有必要开展相关的研究。目前，4-苯基丁酸能够通过化学合成的方式大批量成产，且成本低廉，具备了应用于动物肠道保健产品的潜力。因此，评估4-苯基丁酸的安全性与肠道屏障损伤的防治功效，并将其作为猪肠道保健产品予以开发与利用，对于生猪肠病防治具有重要意义。

发明内容

针对生猪养殖过程中饲料呕吐毒素超标、病原菌感染、断奶应激、营养性腹泻造成猪的肠道屏障受损及其并发症等问题，发明人的前期研究表明，4-苯基丁酸能够有效缓解猪肠道上皮细胞的内质网应激，提高细胞的蛋白合成与自我修复能力，推测其具备促进猪肠道屏障快速修复，具有开发为猪肠道保健产品的应用潜力。

为此，发明人开展了深入研究，证实了猪的肠道细胞对于4-苯基丁酸具有很好的浓度耐受性。在安全剂量下，4-苯基丁酸能有效促进猪肠上皮屏障物理损伤的修复，并且对大肠杆菌内毒素及呕吐毒素损伤的肠道上皮屏障完整性、屏障功能与细胞紧密连接蛋白均具有促修复的功效。同时，肠溶衣包被的4-苯基丁酸能显著提高断奶应激仔猪的平均日增重，降低血液中内毒素含量与腹泻率。因此，4-苯基丁酸、4-苯基丁酸盐、4-苯基丁酸衍生物可用于制备猪肠道保健产品，应用于不同因素导致的猪肠道屏障损伤与并发症的辅助治疗。

本发明目的在于提供4-苯基丁酸在制备猪肠道保健产品中的应用,以4-苯基丁酸、 4-苯基丁酸盐、4-苯基丁酸衍生物为有效成分治疗猪肠道屏障损伤。

本发明的另一个目的在于提供一种治疗或者辅助治疗猪肠道屏障损伤(肠漏症)的一种保健产品，含有效剂量以上的4-苯基丁酸、4-苯基丁酸盐、4-苯基丁酸衍生物为有效成分。

本发明提供的4-苯基丁酸、4-苯基丁酸盐、4-苯基丁酸衍生物制备的猪肠道保健产品治疗或者辅助治疗猪肠道屏障损伤(肠漏症)的分子机制包括：调节猪肠道上皮细胞内质网应激下游信号，提高紧密连接蛋白基因与蛋白水平的表达，加快物理损伤的肠道上皮细胞的迁移与修复能力。

与传统的抗生素疗法相比，本发明提供的产品与应用具有以下优势：

1、作用靶点是提高肠道本身的修复能力，不直接杀害肠道菌群。

2、使用无残留，动物不会产生耐药性。

3、亦可作为肠道酸化剂，从微生物生态角度改善动物肠道健康。

4、产品原料可通过化学合成，价格低廉。

附图说明

图1为4-苯基丁酸对猪肠道上皮细胞活力以及对肠道屏障模型的影响。

图2为4-苯基丁酸对物理损伤的猪肠道屏障的修复效力评估。

图3为4-苯基丁酸对呕吐毒素损伤的猪肠道屏障的修复效力评估。

图4为4-苯基丁酸对内毒素损伤的猪肠道屏障的修复效力评估。

具体实施方式

下面对本发明的研发技术方案做出进一步说明：

实验材料与方法

(1)细胞：猪的空肠上皮细胞系IPEC-J2，由中国科学院亚热带农业生态研究所提供。

(2)药物：4-苯基丁酸(CAS:1821-12-1)、大肠杆菌来源的LPS(L4516-1MG)、呕吐毒素(SML1664-1mL)和荧光黄(46944-100MG-F)购自上海默克公司。耗材：磷酸缓冲液(PBS)、DMEM/F12细胞培养基(11320082)，胰酶消化液(25200056)、青霉素-链霉素-谷氨酰胺(10378016)和胎牛血清(16140071)购于Thermo公司；六孔transwell板(孔径0.4μm，3491)、96孔和6孔细胞培养板购于Corning公司；黑色不透明96孔板(FCP966-80pcs)购于上海碧云天公司。

(3)基于Transwell小室构建体外肠上皮屏障模型：利用IPEC-J2细胞接种于6 孔Transwell培养板上，密度为1×10⁵个细胞/孔，每24h换液一次。大约14天后使用Millipore电阻仪(ESR-2)进行TEER测量，每24h测定一次。当单层细胞完全分化(分化时间约18天，典型标志为：细胞单层形成接触抑制、细胞停止增殖、TEER值稳定且大于 800Ω·cm²)，即可以用于后续试验。

(4)猪肠道物理损伤模型构建：利用10μL无菌的移液吸头细端对猪体外肠道屏障模型进行平行划线,随后利用PBS洗掉脱落的细胞，从而构建物理损伤的猪肠道屏障模型。

(5)猪肠道物理霉菌毒素损伤模型构建：采用2.0μg/mL呕吐毒素处理48h诱导猪肠道屏障霉菌毒素损伤模型；治疗组的肠道屏障模型加入1.0mmol/L 4-苯基丁酸处理48h。

(6)猪肠道物理炎性损伤模型构建：采用5.0μg/mL LPS处理48h诱导猪肠道屏障模型炎性损伤；治疗组的肠道屏障模型加入1.0mmol/L 4-苯基丁酸处理48h。

(7)猪肠道屏障完整性的评估：试验在Transwell小室构建的体外肠上皮屏障模型中进行，对肠上皮屏障模型中细胞加以相应处理后，使用Millipore电阻仪(ESR-2)进行跨膜电阻值(TEER)值测定，每隔24h测定一次TEER值，以TEER值表示猪肠道屏障的完整性。

(8)猪肠道屏障渗透性的评估：试验在Transwell小室体外肠上皮屏障模型中进行，试验过程中在Transwell上层小室中分别加入荧光黄(4kDa)工作液10μL，37℃孵育 30分钟，从Transwell下层小室吸取100μL缓冲液，利用多功能酶标仪(TECAN-Infinite MPLEX)分别检测稀释液在Ex/Em＝490/525nm条件下荧光强度，用于评估IPEC-J2肠上皮屏障模型细胞旁途径渗透性。

(9)猪肠道屏障紧密连接蛋白基因与蛋白表达的测定：用总RNA提取试剂盒提取细胞的总RNA，随后反转录为cDNA，利用qPCR对目的基因的表达进行相对定量，所用的引物序列分别为：GAPDH(F:GGGCATGAACCATGAGAAGT,R:AAGCAGGGATGATGTTCTGG)；ZO-1(F:GGCCCTTACCTTTCGCCTGA,R:GCCTCAGGGCTTGGTGTTCT)；Claudin-1(F：CCCGGTCAATGCCAGATATG, R:CACCTCCCAGAAGGCAGAGA)；Occludin(F:GCTGGAGGAAGACTGGAT,R:ATCCGCAGATCCCTTAAC)。用总蛋白提取试剂盒提取组织、细胞中的总蛋白，利用BCA法测定蛋白含量，无菌水进行蛋白样品的浓度稀释及配平，样品经99℃，5min变性后，进行SDS-PAGE电泳，转膜后利用5％脱脂奶粉封闭，随后利用一抗孵育2h，TBST洗涤5分钟*5次，二抗孵育2h，TBST洗涤5分钟*5次，利用辣根过氧化物酶(HRP)免疫显色，电泳凝胶成像系统(SYNGENE-G:BOX F3)分析样品中紧密连接蛋白相对表达量。

实施案例1：采用不同摩尔浓度(1-50mmol/L)的4-苯基丁酸处理接种于96孔板的IPEC-J2细胞，cck-8法检测个处理组中细胞的相对活力；利用IPEC-J2细胞在transwell 小室中构建猪肠道屏障模型，随后采用不同摩尔浓度(1-50mmol/L)的4-苯基丁酸处理transwell小室中构建猪肠道屏障模型，48h后检测猪肠道屏障的完整性与渗透性，结果发现，0.5-10mmol/L的4-苯基丁酸对猪肠道上皮细胞的活力、肠道屏障的完整性与屏障功能均无显著影响，预示着猪肠道细胞对于4-苯基丁酸有着较高的浓度耐受性；并且低浓度的4-苯基丁酸有在数值上提高了猪肠道上皮细胞活力及肠道屏障模型的跨膜电阻。

实施案例2：利用IPEC-J2细胞在transwell小室中构建猪肠道屏障模型，随后采用10μL无菌的移液吸头细端对猪体外肠道屏障模型进行平行划线,随后利用PBS洗掉脱落的细胞，构建物理损伤的猪肠道屏障模型；进一步在治疗组的猪肠道屏障模型中添加1 mmol/L的4-苯基丁酸，每隔24h检测猪肠道屏障的完整性与渗透性，同时，在普通6孔板中的IPEC-J2细胞给予相同处理，每隔12h利用显微镜拍照记录肠道上皮细胞的迁移情况。结果发现，4-苯基丁酸促进了物理损伤的猪肠道屏障模型中细胞的自我迁移；同时，4-苯基丁酸治疗组的猪肠道屏障的完整性与屏障功能也得以更快的修复。

实施案例3：利用IPEC-J2细胞在transwell小室中构建猪肠道屏障模型，随后采用2.0μg/mL呕吐毒素处理48h诱导猪肠道屏障霉菌毒素损伤模型；进一步在治疗组的猪肠道屏障模型中添加1mmol/L的4-苯基丁酸，每隔24h检测猪肠道屏障的完整性与渗透性，同时，实验收尾阶段收集猪肠道上皮细胞，检测紧密连接蛋白基因与蛋白水平的表达情况。结果表明，4-苯基丁酸促进了呕吐毒素损伤的猪肠道屏障模型中细胞的紧密连接蛋白的表达，同时，4-苯基丁酸治疗组的猪肠道屏障的完整性与屏障功能得以更快的修复。

实施案例4：利用IPEC-J2细胞在transwell小室中构建猪肠道屏障模型，随后采用采用5.0μg/mL LPS处理48h诱导猪肠道屏障炎性损伤模型；进一步在治疗组的猪肠道屏障模型中添加1mmol/L的4-苯基丁酸，每隔24h检测猪肠道屏障的完整性与渗透性，同时，最实验收尾阶段收集猪肠道上皮细胞，检测紧密连接蛋白基因与蛋白水平的表达情况。结果表明，4-苯基丁酸促进了炎性损伤的猪肠道屏障模型中细胞的紧密连接蛋白的表达，同时，4-苯基丁酸治疗组的猪肠道屏障的完整性与屏障功能得以更快的恢复。

实施案例5：利用肠溶衣包被4-苯基丁酸，随后开展21日龄断奶仔猪(杜长大，48头，每组24头)的无抗饲喂实验。具体来说，对照组的仔猪饲喂无抗生素商品日粮，试验组仔猪饲喂无抗生素商业饲料并添加200ppm肠溶衣包被4-苯基丁酸，试验持续14天，记录对照组与实验组之间仔猪的初始体重、末重、腹泻率等数据，试验末期，通过前腔静脉采血15mL，用于ELISA测定血液中内毒素的含量。结果表明，1.0ppm肠溶衣包被的4-苯基丁酸提高了仔猪的日增重，降低血液中内毒素含量与仔猪腹泻率。

表1：肠溶衣包被4-苯基丁酸对断奶应激仔猪生长、肠道屏障功能与腹泻率的影响(实施案例5)

Claims

1.4-苯基丁酸、4-苯基丁酸盐和4-苯基丁酸衍生物在制备猪肠道保健产品中的应用。

2.权利要求1所述的应用，其特征在于：应用的症状包括但不限于断奶应激、营养性腹泻、饲料霉菌毒素超标、肠道病原菌感染等因素造成的肠道屏障损伤(肠漏症)以及相应的并发症。

3.根据权利1中所述的应用，其特征在于：应用方式是通过猪饲料、饮水添加或者直接灌服。

4.一种基于4-苯基丁酸的猪肠道保健产品，其特征在于：所述的产品以4-苯基丁酸、4-苯基丁酸盐和4-苯基丁酸衍生物为功能成分。

5.根据权利4中所述的猪肠道保健产品，其特征在于：所述的产品为颗粒剂、栓剂、泡腾剂。

6.根据权利4中所述的猪肠道保健产品，其特征在于：所述的产品为肠溶衣包被缓释剂、微胶囊包被剂、微生物载体制剂。