CN111317768B - 一种参归养血片中药制剂、制备及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种参归养血片中药制剂、制备及其检测方法，制备步骤：(1)取人参、黄芪、女贞子，80％乙醇回流提取三次，制浸膏A；(2)取枸杞子、牡蛎，加水回流提取二次，制浸膏B；(3)取白术、五味子、当归、川芎、何首乌、大黄、木香，75％乙醇回流提取三次，加水收集沉淀，制浸膏C；(4)混合上述浸膏，70℃减压干燥，粉碎成细粉，加入淀粉适量，制粒；60℃下干燥，加入硬脂酸镁，混匀，压片，包糖衣或薄膜衣。检测方法包括对制剂中黄芪、当归、川芎、大黄、何首乌、五味子、枸杞子、女贞子的薄层色谱鉴别，和对特女贞苷、人参皂苷含量的高相液相色谱测定。本发明采用分组提取，可以富集有效成分，从而提升产品疗效。

Description

一种参归养血片中药制剂、制备及其检测方法
技术领域
本发明属于中成药的制备技术领域，具体而言，涉及一种参归养血片中药制剂、制备及其检测方法。
背景技术
参归养血片由人参、黄芪、白术、五味子、当归、川芎、女贞子等制成，具有益气养血、健脾补肾的功效，用于气血两虚所致的头晕目眩，心悸失眠，神疲倦怠，气短乏力，纳差等症。对白细胞减少症、贫血有一定的疗效。参归养血片原工艺是在中医药理论指导下，以中药材为原料，按照规定的处方、生产工艺和质量标准生产的制剂，是一个传统的中成药片剂。原工艺如下：取人参、白术、大黄粉碎成细粉；川芎、当归、木香、五味子四味加80％乙醇回流二次，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度为1.30～1.34(80℃)的浸膏，药渣另器收集；何首乌、黄芪、女贞子、牡蛎等五味及上述醇提药渣加水煎煮三次，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.30～1.34(80℃)的浸膏，与上述人参等细粉及浸膏合并，混匀，制粒，压片，包糖衣或薄膜衣，即得。
原工艺存在以下问题：(1)人参、白术、大黄经粉碎直接入药，不利于有效成分的吸收；(2)制粒过程中对粒度和均匀度要求较高，药材直接粉碎入药易造成分布不均匀，增加制粒和压片的难度；(3)不能保证有效成分的充分提取，转移率较低，不利于资源的合理利用，增加生产成本。
发明内容
本发明目的是在于提供一种参归养血片中药制剂、制备及其检测方法，保证有效成分的充分提取，提高转移率。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种参归养血片中药制剂，所述参归养血片原料的质量份组分为：人参4～6份，黄芪20～25份，白术5～6份，五味子2～4份，当归4～5份，川芎5～6份，女贞子4～6份，牡蛎4～6份，枸杞子5～6份，何首乌4～5份，大黄1～2份，木香2～3份。
进一步地，所述参归养血片原料的质量份组分为：人参5份，黄芪20份，白术5份，五味子3份，当归5份，川芎5份，女贞子5份，牡蛎5份，枸杞子5份，何首乌5份，大黄2份，木香2份。
一种参归养血片中药制剂的制备方法，所述参归养血片的制备包括以下步骤：
(1)制备浸膏A：取人参、黄芪、女贞子药材，80％乙醇回流提取三次，合并提取液，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，浓缩至稠膏，备用；
(2)制备浸膏B：取枸杞子、牡蛎，加水回流提取二次，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩至稠膏，备用；
(3)制备浸膏C：取白术、五味子、当归、川芎、何首乌、大黄、木香共7味药材，75％乙醇回流提取三次，合并提取液，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味；加入药材质量1倍量的水，混匀，静置24h，过滤，收集沉淀，备用；
(4)制片：混合上述浸膏，70℃减压干燥或喷雾干燥，粉碎成细粉，加入淀粉适量，混匀，用95％乙醇作润湿剂，过20目筛网制粒；60℃下干燥，加入3％的硬脂酸镁，混匀，过20目筛网，压片，包糖衣或薄膜衣，即得。
进一步地，所述步骤(1)中，80％乙醇回流提取，第一次乙醇的加入量是药材质量的8倍，第二次乙醇的加入量是药材质量的6倍，第三次乙醇的加入量是药材质量的4倍，每次提取2小时；所述滤液在-0.04Mpa、70℃下减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.10～1.15的浸膏，该相对密度为60℃下测定的密度。
进一步地，所述步骤(2)中，加水回流提取，第一次水的加入量是药材质量的8倍，第二次水的加入量是药材质量的6倍，每次提取2小时；所述滤液在-0.04Mpa、70℃下减压浓缩至相对密度为1.10～1.15的浸膏，该相对密度为60℃下测定的密度。
进一步地，所述步骤(3)中，75％乙醇回流提取，第一次乙醇加入量是药材质量的8倍，第二次乙醇加入量是药材质量的6倍，第三次乙醇加入量是药材质量的4倍，每次提取2小时；所述滤液在-0.04Mpa、70℃下减压回收乙醇；所述浸膏C的相对密度为1.08～1.12，该相对密度为25℃下测定的密度。
进一步地，所述步骤(4)中喷雾干燥压力为0.05Kpa，主机转速50rpm。
一种参归养血片中药制剂的检测方法，其特征在于：所述检测方法包括含量测定项目，含量测定是采用高效液相色谱法测定参归养血片中特女贞苷成分的含量，具体步骤为：
(1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为35:65的甲醇-0.8％磷酸溶液为流动相，检测波长为224nm，理论塔板数以特女贞苷峰计算应不低于4000；
(2)对照品溶液制备：取经五氧化二磷真空干燥24小时的特女贞苷对照品，精密称定，加30％甲醇溶解稀释至0.04-0.06mg/ml，即得对照品溶液；
(3)供试品溶液制备：取装量差异项下同一份样品内容物，研细，混匀，取1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％甲醇50ml，称定重量，在功率250W、频率40kHz条件下超声处理20min，放冷，再称定重量，用30％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液：
(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录峰面积，以外标法计算，即得。
一种参归养血片中药制剂的检测方法，其特征在于：所述检测方法包括含量测定项目，含量测定是采用高效液相色谱法测定参归养血片中人参皂苷成分的含量，具体步骤为：
(1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为99:400的乙腈-0.05mol/L磷酸水溶液为流动相，检测波长为203nm，理论塔板数以人参皂苷峰计算应不低于2000；
(2)对照品溶液制备：取经五氧化二磷真空干燥24小时的人参皂苷Rg1对照品和人参皂苷Re对照品，精密称定，加甲醇溶解稀释至每1ml中含人参皂苷Rg1 0.3-0.5mg/ml和人参皂苷Re 0.8-1.2mg/ml，即得对照品溶液；
(3)供试品溶液制备：取同一份样品内容物30片，除去糖衣，研细，取粉末4g，精密称定，加乙醚50ml，水浴加热回流提取1小时，滤过，滤渣挥尽乙醚后，加甲醇60ml，水浴加热回流提取1小时，滤过，药渣用少量甲醇洗涤3次，每次10ml，合并滤液和洗液，回收甲醇，残渣加水20ml，温热使溶解，用水饱和的正丁醇提取5次，每次30ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次70ml，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣加水10ml使溶解，加入预先处理好的直径为1.5cm，下部为填充高度7cm的D101型大孔吸附树脂，上部为填充高度3cm的200目中性氧化铝的混合柱上，用水50ml洗脱，弃去水液，再用70％乙醇80ml洗脱，收集70％乙醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，移置10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液：
(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录峰面积，以外标法计算，即得。
一种参归养血片中药制剂的检测方法，其特征在于：所述检测方法包括对制剂中黄芪、当归、川芎、大黄、何首乌、五味子、枸杞子、女贞子的薄层色谱鉴别，具体如下：
(1)黄芪薄层色谱鉴别
取本品10片，除去薄膜衣或糖衣，研细，加甲醇30ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml微热使溶解，用饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用氨试液提取3次，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水3～5ml使溶解，通过内径1.7cm、柱高13cm的D101型大孔吸附树脂柱，以水50ml洗脱，弃去水液，再用40％乙醇30ml洗脱，弃去40％乙醇洗脱液，继用70％乙醇50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，作为供试品溶液；取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取吸取供试品溶液各5μl，对照品溶液各3μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷:甲醇:水＝13:6:2的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，热风吹至斑点显色清晰；供试品图谱中，在与对照品色谱相应的位置上，日光下显相同的棕褐色斑点，紫外光灯365nm下显相同的橙黄色荧光斑点；
(2)当归、川芎薄层色谱鉴别
取本品10片，除去糖衣或薄膜衣，研细，加乙醇30ml，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至5ml，作为供试品溶液；取当归、川芎对照药材各1g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液各5μl，对照药材溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷:乙酸乙酯＝9:1为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的蓝白色荧光斑点；
(3)大黄、何首乌薄层色谱鉴别
取本品10片，除去糖衣或薄膜衣，研细，加甲醇30ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml溶解，再加盐酸1ml，水浴水解30分钟，立即冷却，用乙醚提取2次，每次10ml，合并提取液，挥干，残渣加三氯甲烷1ml使溶解，作为供试品溶液；取大黄对照药材及何首乌对照药材各0.2g，分别同法制成对照药材溶液；取大黄素对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液各10μl，对照药材溶液及对照品溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以60～90℃沸程下石油醚：甲酸乙酯：甲酸＝15:5:1的上层液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，分别显相同的橙黄色荧光斑点；置氨气中熏后，日光下检视，斑点变为红色；
(4)五味子薄层色谱鉴别
取本品10片，除去糖衣或薄膜衣，研细，加三氯甲烷40ml，超声处理10分钟，滤过，残渣加三氯甲烷20ml，超声处理10分钟，滤过，合并两次滤液，加入0.3g活性炭粉末，超声处理5分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加三氯甲烷1ml使溶解，作为供试品溶液；取五味子醇甲对照品，加三氯甲烷制成每1ml含0.1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述溶液各15μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以环己烷:乙酸乙酯＝5：5为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯254nm下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
(5)枸杞子薄层色谱鉴别
取除去包衣的本品粉末0.5g，加水35ml，加热煮沸15分钟，放冷，滤过，滤液用乙酸乙酯15ml振摇提取，提取液浓缩至约1ml，作为供试品溶液；另取枸杞子对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯：三氯甲烷：甲酸＝3:2:1为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
(6)女贞子薄层色谱鉴别
取除去包衣后的本品粉末0.5g，加三氯甲烷20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；取齐墩果酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述溶液各4μl分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷:甲醇:甲酸＝40:1:1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，110℃下加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
1、本发明采用分组提取工艺制备参归养血片，既可以提取出生物碱及其盐、苷类、挥发油及有机酸类等有效成分，同时也可将水溶性的多糖、酚酸等最大限度的溶出，富集有效成分的同时，剔除部分无效物质，从而提升产品疗效，满足品种的技术要求。
2、分组提取，便于有效成分的溶出，也方便达到制粒和压片时的粒度和均匀度。
3、本发明方法制备的参归养血片的质量标准增加鉴别项五味子、枸杞子、女贞子；增加含量测定项特女贞苷。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图；
图2为特女贞苷标准曲线；
图3为Rg1标准曲线；
图4为Re标准曲线；
图5为黄芪的薄层鉴别色谱图；图中，1为黄芪甲苷对照品，2为阴性对照样品，3为样品150401，4为样品150402，5为样品150403；
图6为当归川芎的薄层鉴别色谱图；图中，1为当归对照药材，2为川芎对照药材，3为阴性对照样品，4为样品150401，5为样品150402，6为样品150403；
图7为大黄何首乌的薄层鉴别色谱图；图中，1为大黄素对照品，2为大黄对照药材，3为何首乌对照药材，4为阴性对照样品，5为样品150401，6为样品150402，7为样品150403；
图8为五味子的薄层鉴别色谱图；图中，1为五味子醇甲对照品，2为阴性对照样品，3为样品150401，4为样品150402，5为样品150403；
图9为枸杞的薄层鉴别色谱图；图中，1为枸杞对照药材，2为阴性对照样品；3为样品150401，4为样品150402，5为样品150403；
图10为人参的薄层鉴别色谱图；图中，1为人参皂苷对照品，2为人参药材对照液，3为阴性对照样品，4为样品150401，5为样品150402，6为样品150403；
图11为白术的薄层鉴别色谱图；图中，1为白术对照药材，2为阴性对照样品，3为样品150401，4为样品150402，5为样品150403；
图12为木香的薄层鉴别色谱图；图中，1为去氢木香内酯对照品，2为木香烃内酯，3为阴性对照样品，4为样品150401，5为样品150402，6为样品150403；
图13为女贞子的薄层鉴别色谱图；图中，1为齐墩果酸对照品，2为样品150401，3为样品150402，4为样品150403，5为阴性对照样品。
具体实施方式
下面对本发明做进一步详细描述，所述是对本发明的解释而不是限定。下面给出具体的实施例。
实施例1：
1、制备浸膏A：分别称取人参50g、黄芪200g、女贞子50g，平行3份，编为1～3个实验号，用80％乙醇回流提取3次，加醇量分别为药材质量的8倍、6倍、4倍，每次2小时，收集提取液，测定收干膏量、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、特女贞苷成分含量，实验结果见表1。合并提取液，过滤，在-0.04Mpa、70℃下减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.10～1.15的浸膏，该相对密度为60℃下的密度。
表1人参、黄芪、女贞子提取实验结果统计表
Figure BDA0001903966730000051
2、制备浸膏B：分别称取枸杞子50g、牡蛎50g，各3份，编为1～3个实验号，加水回流提取二次，加水量分别为药材质量的8倍、6倍，每次2小时，合并提取液，滤过，在-0.04Mpa、70℃下减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.10～1.15的浸膏，该相对密度为60℃下的密度，测定干膏量，实验结果见表2。
表2枸杞子、牡蛎提取结果统计表
Figure BDA0001903966730000052
Figure BDA0001903966730000061
3、制备浸膏C：分别称取白术62.5g、五味子37.5g、当归125.0g、川芎62.5g、何首乌62.5g、大黄25.0g、木香25.0g，平行3份，编为1～3个实验号，75％乙醇回流提取三次，乙醇的加入量分别为药材质量的8倍、6倍、4倍，每次2小时，合并提取液。分别测干膏量、五味子醇甲成分的含量，实验结果见表3。
表3五味子等七味药材提取结果统计表
Figure BDA0001903966730000062
为了去除五味子等七味药材乙醇提取物中的水溶性大分子无效物质，并使有效成分五味子醇甲进一步富集，对五味子等七味药材的乙醇提取液，浓缩至相对密度为1.10(25℃)的浸膏(无醇味)，加入原药材质量1倍量的水，搅匀，室温静置24h，滤过，收集沉淀。
4、制片：混合上述浸膏，70℃减压干燥，粉碎成细粉，加入淀粉适量，混匀，用95％乙醇作润湿剂，过20目筛网制粒；60℃下干燥，加入3％的硬脂酸镁，混匀，过20目筛网，压片，包糖衣或薄膜衣，即得。
实验结果显示：本发明提取工艺稳定、可行。
实施例2：
1、制备浸膏A：按照处方量的300倍投料，80％乙醇回流提取3次，第一次乙醇的加入量为药材质量的8倍，提取2小时；第二次乙醇的加入量为药材质量的6倍，提取2小时；第三次乙醇的加入量为药材质量的4倍，提取2小时；合并提取液，滤过，提取液70℃减压至稠膏(111.8kg)，相对密度为1.10～1.15(60℃)。
2、制备浸膏B：按照处方量的300倍投料，自来水回流提取2次，第一次水的加入量为药材质量的8倍，提取2小时；第二次水的加入量为药材质量的6倍，提取2小时；合并提取液，滤过，70℃减压浓缩至稠膏(60.4kg)，相对密度为1.10～1.15(60℃)。
3、制备浸膏C：按照处方量的300倍投料，75％乙醇回流提取3次，第一次乙醇的加入量为药材质量的8倍，提取2小时；第二次乙醇的加入量为药材质量的6倍，提取2小时；第三次乙醇的加入量为药材质量的4倍，提取2小时；合并提取液，滤过，提取液70℃减压至相对密度为1.08～1.12(25℃)稠膏(296.5kg)。浓缩膏加药材质量的1倍量的水搅拌均匀后静置24小时，收集沉淀(13.5kg)。
4、合并上述浸膏与沉淀，70℃减压干燥，粉碎，得干粉69.1kg。
表4有效成分转移率及工艺前后含药量对比
Figure BDA0001903966730000071
根据药材提取液检测结果分析，人参总皂苷有效成分转移率达71％，每粒的有效成分含量高于原标准；特女贞苷有效成分转移率达37％，每粒的有效成分含量高于原标准2倍。
实施例3：
1、特女贞苷成分的HPLC法测定
(1)对照品来源及纯度检查：特女贞苷对照品(批号：111926-201404，供含量测定用，购自中国食品药品检定研究院)。经HPLC归一化法测定含量为97.30％。
测定波长的选择：取特女贞苷对照品溶液，用紫外可见分光光度计，从200～400nm波长范围内进行扫描测定。扫描结果表明，特女贞苷在224nm波长处有最大吸收，因此，确定224nm处为检测特女贞苷的检测波长。
色谱条件：色谱柱：AgilentXDB-C18柱，250×4.6mm，5μm；流动相：甲醇-0.8％磷酸溶液(35:65)；检测波长为224nm；柱温：30℃。在此条件下，特女贞苷色谱峰与其它组分均能达到基线分离，理论板数按特女贞苷峰计算不低于4000。
色谱柱的选择：取装量差异项下同一份样品(批号：150401)内容物，研细，混匀，取1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)20min，放冷，再称定重量，用30％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，按拟定的条件和方法，选用不同型号的色谱柱，分别注入液相色谱仪测定，计算，统计，结果请见表5。
表5不同型号色谱柱特女贞苷含量测定考察及结果
试验号 柱型号 样品峰面积均值 样品含量(mg/片)
1 Agilent XDBC<sub>18</sub>(250×4.6mm) 534.1 0.69
2 Welchrom C18(250×4.6mm) 512.9 0.67
试验结果表明，Welchrom C18柱子未将样品完全分离开，且峰形对称度不好。因此，确定选用Agilent XDB C18柱作为含量检测研究的色谱柱。
(2)提取溶剂与方法的选择试验
提取溶剂的选择：取装量差异项下同一份样品(批号：150401)内容物，研细，混匀，取1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)20min，放冷，再称定重量，用30％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
精密吸取供试品溶液各10μl，按拟定条件和方法注入液相色谱仪测定，试验结果请见表6。
表6特女贞苷提取溶剂与方法的选择试验及结果
试验号 提取溶剂与方法 取样量(g) 峰面积均值(A) 峰面积比值(A/g)
1 30％甲醇超声法 1001.56 536.3 535.47
2 稀乙醇超声法 1003.45 577.4 575.42
试验结果表明，用30％甲醇和稀乙醇作为特女贞苷的提取溶媒，峰面积比值相差不大，但稀乙醇提取的峰形不好，理论塔板数和分离度均达不到要求，不能完全将目标峰分开。故选用30％甲醇超声提取作为本品中特女贞苷成分含量测定的提取溶剂和方法。
提取完全性试验：取装量差异项下同一份样品(批号：150401)内容物，研细，混匀，取1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)20min，放冷，再称定重量，用30％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
精密吸取供试品溶液各10μl，按拟定条件和方法注入液相色谱仪测定，结果见表7。
表7特女贞苷提取完全性试验与结果
试验号 取样量(g) 超声时间(分) 峰面积积分均值(A) 峰面积积分比值(A/g)
1 1002.41 10 511.45 510.22
2 1000.15 20 525.10 525.02
3 1003.48 30 503.60 501.86
4 1004.21 40 517.60 515.43
试验结果表明，超声提取20分钟的效果最好，随超声时间的延长，含量并未增加。故确定超声提取时间为20分钟。
(3)供试品溶液、对照品溶液及空白对照液的制备
供试品溶液的制备：取装量差异项下同一份样品(批号：150401)内容物，研细，混匀，取1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)20min，放冷，再称定重量，用30％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
对照品溶液的制备：取经五氧化二磷真空干燥24小时的特女贞苷对照品5.28mg，精密称定，置100ml量瓶中，加30％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含特女贞苷0.0528mg)。
阴性空白对照液的制备：取除去女贞子的模拟处方，制成不含女贞子的空白样品，按供试品溶液制法制成阴性空白对照溶液。
(4)空白干扰试验
分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性空白对照溶液各20μl，按上述色谱条件，注入液相色谱仪，测定峰面积积分值，观察比较。
试验结果表明，在阴性空白对照液的HPLC色谱中，与对照品峰相应的保留时间位置上无相应的峰出现，表明阴性空白无干扰。
(5)线性关系的考察
精密称取特女贞苷对照品11.37mg，置50ml量瓶中，加30％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为C＝0.2274mg/ml的溶液；吸取该溶液5ml，定容于10ml量瓶中，摇匀，得浓度为C＝0.1137mg/ml的溶液；再吸取该溶液5ml，依次稀释制备成含量分别为0.05685mg/ml、0.028425mg/ml和0.0142125mg/ml的系列对照品溶液。精密吸取各溶液10μl，分别注入液相色谱仪，测定峰面积，计算，统计，结果请见表8。以峰面积积分均值为纵坐标，以特女贞苷进样量为横坐标绘制标准曲线图，并进行线性回归，回归方程为Y＝11644X-13.22，r＝0.999。试验结果表明，特女贞苷进样量在0.1421～2.274μg范围内呈良好的线性关系。
表8特女贞苷线性关系试验及结果
Figure BDA0001903966730000091
(6)精密度试验
分别精密吸取对照品溶液(C＝0.0402mg/ml)与供试品溶液(批号：150401)各10μl，连续注入液相色谱仪各5次，按上述色谱条件测定特女贞苷峰面积积分值，计算，统计。试验及结果请分别见表9和表10。
表9特女贞苷对照品精密度试验及结果
Figure BDA0001903966730000092
Figure BDA0001903966730000101
表10样品中特女贞苷成分精密度试验及结果
Figure BDA0001903966730000102
试验结果表明，特女贞苷对照品精密度试验的RSD为1.30％，样品中特女贞苷成分精密度试验的RSD为1.02％，其精密度均良好。
(7)稳定性试验
取对照品溶液(C＝0.0395mg/ml)与供试品(批号150401)溶液，分别在放置0、2、5、8、24小时的时间间隔，各精密吸取10μl，分别注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定特女贞苷峰面积积分值，计算，统计。结果请见表11。
表11特女贞苷稳定性试验及结果
Figure BDA0001903966730000103
试验结果表明，对照品与样品溶液在24小时内峰面积积分值均变化不大，RSD值分别为0.98％和2.78％，说明该方法和其供试品溶液在24小时内稳定性良好。
(8)重复性试验
取装量差异项下同一份样品(批号：150401)内容物，研细，混匀，取1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)20min，放冷，再称定重量，用30％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，按拟定条件和方法注入液相色谱仪测定，计算，统计，结果请见表12。
表12重复性试验及结果
Figure BDA0001903966730000111
试验结果表明，6次取样重复测定的平均含量为0.68mg/片，相对标准偏差为RSD＝1.46％。说明其重复性良好。
(9)回收率试验
采用加样回收试验法，分别精密称取同批(批号：150401)已知含量(含量：0.68mg/片，平均每片装量为：0.3g/片，折合：2.3mg/g)的本品内容物，研细，混匀，取1.0g，精密称定，平行6份，精密加入特女贞苷对照品溶液(C＝0.4366mg/ml)各3ml，混匀，以30％甲醇为溶剂，按上述供试品溶液制法制成供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，按拟定条件和方法注入液相色谱仪测定，计算，统计。按下式计算加样回收率，结果请见表13。
表13特女贞苷加样回收试验结果
Figure BDA0001903966730000112
试验结果表明，特女贞苷加样回收试验的平均回收率为96.91％，说明其回收率良好，测定的相对标准偏差RSD＝4.82％。
(10)样品中特女贞苷成分的含量测定
经对三批试生产的参归养血片样品，按正文方法处理，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，照上述色谱条件依法测定，计算样品含量，结果请见表14。
表14三批样品特女贞苷含量测定结果
Figure BDA0001903966730000121
根据三批样品实际测试结果及药材质量不同，造成各批次之间含量差异较大。中试样品含量最高为0.69mg/片，最低为0.68mg/片，故暂定本品每片含女贞子以特女贞苷(C31H42O17)计，不得低于0.23mg。
2、人参皂苷成分的HPLC法测定
(1)对照品来源及纯度检查：人参皂苷对照品Rg1，Re(批号分别为：110703-201529，110754-201324，供含量测定用，购自中国食品药品检定研究院)。经HPLC归一化法测定含量为95％，92.7％。
测定波长的选择：取人参皂苷对照品溶液，用紫外可见分光光度计，从200～300nm波长范围内进行扫描测定。扫描结果表明，人参皂苷在203nm波长处有最大吸收，因此，确定203nm处为检测人参皂苷的检测波长。
色谱条件：色谱柱：AgilentXDB-C18柱，250×4.6mm，5μm；流动相：乙腈-0.05mol/L磷酸水溶液(99:400)；检测波长为203nm；柱温：21℃。在此条件下，人参皂苷色谱峰与其它组分均能达到基线分离，理论板数按人参皂苷峰计算不低于2000。
色谱柱的选择：取同一份样品(批号：150401)内容物30片，除去包衣，研细，取粉末4g，精密称定，加乙醚50ml，水浴加热回流提取1小时，滤过，滤渣挥尽乙醚后，加甲醇60ml，水浴加热回流提取1小时，滤过，药渣用少量甲醇洗涤3次，每次10ml，合并滤液和洗液，回收甲醇，残渣加水20ml，温热使溶解，用水饱和的正丁醇提取5次，每次30ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次70ml，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣加水10ml使溶解，加入预先处理好的中性氧化铝与D101型大孔吸附树柱(上部为200目的中性氧化铝3cm，下部为大孔吸附树脂7cm，直径1.5cm)上，用水50ml洗脱，弃去水液，再用70％乙醇80ml洗脱，收集70％乙醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，移置10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，按拟定的条件和方法，选用不同型号的色谱柱，分别注入液相色谱仪测定，计算，统计，结果请见表15。
表15不同型号色谱柱人参皂苷含量测定考察及结果
Figure BDA0001903966730000122
Figure BDA0001903966730000131
试验结果表明，不同型号和来源的色谱柱对含量测定影响大，Welchrom柱子分离度达不到要求，无法分开人参皂苷Re，因此，确定选用Agilent XDB C18柱作为含量检测研究的色谱柱。
(2)提取方法的选择试验
取同一份样品(批号：150401)内容物30片，除去糖衣，精密称定，研细。取粉末4g，精密称定，加乙醚50ml，水浴加热回流提取1小时，滤过，滤渣挥尽乙醚后，加甲醇60ml，水浴加热回流提取1小时，滤过，药渣用少量甲醇洗涤3次，每次10ml，合并滤液和洗液，回收甲醇，残渣加水20ml，温热使溶解，用水饱和的正丁醇提取5次，每次30ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次70ml，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣加水10ml使溶解，加入预先处理好的中性氧化铝与D101型大孔吸附树柱(上部为200目的中性氧化铝3cm，下部为大孔吸附树脂7cm，直径1.5cm)上，用水50ml洗脱，弃去水液，再用70％乙醇80ml洗脱，收集70％乙醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，移置10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。同时，取同样量的样品，直接加甲醇50ml超声30min，过滤，滤液蒸干，用甲醇溶解于10ml量瓶中，定容，过滤，取续滤液即得；另取同等量的样品，直接加甲醇超声50分钟，定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
精密吸取供试品溶液各10μl，按拟定条件和方法注入液相色谱仪测定，试验结果请见表16。
表16提取方法的选择试验及结果
Figure BDA0001903966730000132
试验结果表明，用甲醇和过柱子作为人参皂苷的提取溶媒，峰面积比值相差大，未过柱子提取的含量高，但提取的杂质峰很多，分离效果差，故选用过柱子提取作为本品中人参皂苷成分含量测定的提取溶剂和方法。
(3)供试品溶液、对照品溶液及空白对照液的制备
供试品溶液的制备：取同一份样品(批号：150401)内容物30片，除去糖衣，研细，取粉末4g，精密称定，加乙醚50ml，水浴加热回流提取1小时，滤过，滤渣挥尽乙醚后，加甲醇60ml，水浴加热回流提取1小时，滤过，药渣用少量甲醇洗涤3次，每次10ml，合并滤液和洗液，回收甲醇，残渣加水20ml，温热使溶解，用水饱和的正丁醇提取5次，每次30ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次70ml，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣加水10ml使溶解，加入预先处理好的中性氧化铝与D101型大孔吸附树柱(上部为200目的中性氧化铝3cm，下部为大孔吸附树脂7cm，直径1.5cm)上，用水50ml洗脱，弃去水液，再用70％乙醇80ml洗脱，收集70％乙醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，移置10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
对照品溶液的制备：取经五氧化二磷真空干燥24小时的人参皂苷对照品Rg13.62mg和Re10.96mg，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含人参皂苷Rg1 0.362mg/ml和Re 1.096mg/ml)。阴性空白对照液的制备：取除去人参的模拟处方，制成不含人参的空白样品，按供试品溶液制法制成阴性空白对照溶液。
(4)空白干扰试验
分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性空白对照溶液各10μl，按上述色谱条件，注入液相色谱仪，测定峰面积积分值，观察比较。试验结果表明，在阴性空白对照液的HPLC色谱中，与对照品峰相应的保留时间位置上无相应的峰出现，表明阴性空白无干扰。
(5)线性关系的考察
精密称取人参皂苷对照品Rg1为8.26mg和Re为19.31mg，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度Rg1为C＝0.826mg/ml和Re为C＝1.931mg/m的溶液；吸取该溶液5ml，定容于10ml量瓶中，摇匀，得浓度Rg1为C＝0.413mg/ml和Re为C＝0.9655mg/ml的溶液；再吸取该溶液5ml，依次稀释制备成Rg1含量分别为0.2065mg/ml、0.10325mg/ml和0.051625mg/ml的系列对照品溶液和Re含量分别为0.48275mg/ml、0.241375mg/ml和0.1206875mg/ml的系列对照品溶液。精密吸取各溶液10μl，分别注入液相色谱仪，测定峰面积，计算，统计。结果请见表17。以峰面积积分均值为纵坐标，以人参皂苷进样量为横坐标绘制标准曲线图，并进行线性回归，回归方程为Rg1为Y＝3380X-22.10，r＝0.999；Re为Y＝2090X-23.130，r＝0.999。试验结果表明，人参皂苷Rg1进样量在0.52～8.26μg，人参皂苷Re进样量在1.21～19.31μg范围内呈良好的线性关系。
表17人参皂苷线性关系试验及结果
Figure BDA0001903966730000141
(6)精密度试验
分别精密吸取对照品溶液(人参皂苷Rg1C＝0.349mg/ml和人参皂苷ReC＝1.064mg/ml)与供试品溶液(批号：150401)各10μl，连续注入液相色谱仪各5次，按上述色谱条件测定人参皂苷峰面积积分值，计算，统计。试验及结果请分别见表18和表19。
表18人参皂苷对照品精密度试验及结果
Figure BDA0001903966730000151
表19人参皂苷样品精密度试验及结果
Figure BDA0001903966730000152
试验结果表明，人参皂苷Rg1对照品精密度试验的RSD为0.71％和Re对照品精密度试验的RSD为0.73％，样品中人参皂苷Rg1成分精密度试验的RSD为2.11％和Re成分精密度试验的RSD为0.94％，其精密度均良好。
(7)稳定性试验
取对照品溶液(人参皂苷Rg1C＝0.423mg/ml和人参皂苷ReC＝1.001g/ml)与供试品(批号150401)溶液，分别在放置0、4、8、12、24小时的时间间隔，各精密吸取10μl，分别注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定人参皂苷峰面积积分值，计算，统计。结果请见表20。
表20稳定性试验及结果
Figure BDA0001903966730000161
试验结果表明，对照品与样品溶液在24小时内峰面积积分值均变化不大，人参皂苷Rg1RSD值分别为0.94％和2.00％，人参皂苷ReRSD值分别为0.89％和2.31％，说明该方法和其供试品溶液在24小时内稳定性良好。
(8)重复性试验
取本品内容物适量，除去糖衣，精密称定，研细。精密称定，分别取约4g，重复称取样品细粉6份，精密称定，按上述供试品溶液制法制备供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，按拟定条件和方法注入液相色谱仪测定，计算，统计，结果请见表21。
表21重复性试验及结果
Figure BDA0001903966730000171
试验结果表明，6次取样重复测定的平均含量为0.620mg/片，相对标准偏差为RSD＝3.61％和3.41％。说明其重复性良好。
(9)回收率试验
采用加样回收试验法，分别精密称取同批(批号：150401)已知含量(含量：0.620mg/片，平均每片装量为：0.3g/片，折合：2.07mg/g)的本品内容物30片，除去糖衣或薄膜衣，精密称定，研细。取粉末4g，精密称定，平行6份，精密加入人参皂苷Rg1对照品溶液(C＝0.826mg/ml)各1ml，Re对照品溶液(C＝1.205mg/ml)各1ml混匀，以甲醇为溶剂，按上述供试品溶液制法制成供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，按拟定条件和方法注入液相色谱仪测定，计算，统计。按下式计算加样回收率，结果请见表22。
表22加样回收试验结果
Figure BDA0001903966730000172
Figure BDA0001903966730000181
试验结果表明，人参皂苷加样回收试验的平均回收率为97.369％和99.39，说明其回收率良好，测定的相对标准偏差RSD＝4.55％和5.08。
(10)样品中人参皂苷成分的含量测定
经对三批中试生产的参归养血片样品，按正文方法处理，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，照上述色谱条件依法测定，计算样品含量，结果请见表23。
表23三批样品含量测定结果
Figure BDA0001903966730000182
根据三批样品实际测试结果及药材质量不同，造成各批次之间含量差异较大。中试样品含量最高为0.62mg/片，最低为0.55mg/片，故暂定本品每片含人参皂苷Rg1(C42H72O14)及人参皂苷Re(C48H82O18)，总和不得少于0.1mg。
实施例4：参归养血片---薄层鉴别
对参归养血片人参、黄芪、五味子、白术、当归、川芎、大黄、女贞子、枸杞子、何首乌、木香进行薄层鉴别。
1、黄芪薄层色谱鉴别
供试品溶液的制备：取本品10片，除去薄膜衣或糖衣，研细，加甲醇30ml，超声处理30分钟，30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml微热使溶解，用饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用氨试液提取3次，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水3～5ml使溶解，通过D101型大孔吸附树脂柱(内径1.7cm，柱高13cm)上，以水50ml洗脱，弃去水液，再用40％乙醇30ml洗脱，弃去40％乙醇洗脱液，继用70％乙醇50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，作为供试品溶液。
对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。
阴性对照溶液的制备：取方中除黄芪以外的其它药材，按照制法制成阴性对照品。取阴性对照样品3g，余下操作同供试品溶液制备项下操作，作为阴性对照溶液。
薄层层析：照薄层色谱法(中国药典2015版四部通则0502)试验，吸取供试品溶液各5μl，对照品溶液各3μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13:6:2)的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，热风吹至斑点显色清晰。
结果：供试品图谱中，在与对照品色谱相应的位置上，日光下显相同的棕褐色斑点，紫外光灯(365nm)下显相同的橙黄色荧光斑点(见附图5)，且阴性无干扰。
结论：黄芪的薄层色谱鉴别列入质量标准正文。
2、当归、川芎薄层色谱鉴别
供试品溶液的制备：取本品10片，除去糖衣或薄膜衣，研细，加乙醇30ml，超声处理30分钟，30分钟，滤过，滤液浓缩至5ml，作为供试品溶液。
对照药材溶液的制备：取当归、川芎对照药材各1g，同法制成对照药材溶液。
阴性对照溶液的制备：取方中除当归，川芎以外的其它药材，按照制法制成阴性对照品。取阴性对照样品3g，余下操作同供试品溶液制备项下操作，作为阴性对照溶液。
薄层层析：照薄层色谱法(中国药典2015版四部通则0502)试验，吸取上述三种溶液各5μl，对照品溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯(9:1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。
结果：供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的蓝白色荧光斑点(见附图6)，且阴性无干扰。
结论：当归川芎的薄层色谱鉴别列入质量标准正文。
3、大黄、何首乌薄层色谱鉴别
供试品溶液的制备：取本品10片，除去糖衣或薄膜衣，研细，加甲醇30ml，超声处理30分钟，30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml溶解，再加盐酸1ml，水浴水解30分钟，立即冷却，用乙醚提取2次，每次10ml，合并提取液，挥干，残渣加三氯甲烷1ml使溶解，作为供试品溶液。
对照药材溶液的制备：取大黄对照药材及何首乌对照药材各0.2g，分别同法制成对照药材溶液。
对照品溶液的制备：取大黄素对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。
阴性对照溶液的制备：取方中除大黄何首乌以外的其它药材，按照制法制成阴性对照品。取阴性对照样品1g，余下操作同供试品溶液制备项下操作，作为阴性对照溶液。
薄层层析：照薄层色谱法(中国药典2015版四部通则0502)试验，吸取供试品溶液各10μl，对照药材溶液及对照品溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-甲酸乙酯-甲酸(15:5:1)的上层液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。
结果：供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，分别显相同的橙黄色荧光斑点；置氨气中熏后，日光下检视，斑点变为红色(见附图7)，且阴性无干扰。
结论：大黄何首乌的薄层色谱鉴别列入质量标准正文。
4、五味子薄层色谱鉴别
供试品溶液的制备：取本品10片，除去糖衣或薄膜衣，研细，加三氯甲烷40ml，超声处理10分钟，滤过，残渣加三氯甲烷20ml，超声处理10分钟，滤过，合并两次滤液，加入0.3g活性炭粉末，超声处理5分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加三氯甲烷1ml使溶解，作为供试品溶液。
对照品溶液的制备：取五味子醇甲对照品，加三氯甲烷制成每1ml含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。
阴性对照溶液的制备：取方中除五味子以外的其它药材，按照制法制成阴性对照品。取阴性对照样品4g，余下操作同供试品溶液制备项下操作，作为阴性对照溶液。
薄层层析：照薄层色谱法(中国药典2015版四部通则0502)试验，吸取上述溶液各15μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯(5:5)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。
结果：供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；且阴性无干扰(见附图8)。
结论：五味子的薄层色谱鉴别列入质量标准正文。
5、枸杞薄层色谱鉴别
供试品溶液的制备：取除去包衣的本品粉末0.5g，加水35ml，加热煮沸15分钟，放冷，滤过，滤液用乙酸乙酯15ml振摇提取，提取液浓缩至约1ml，作为供试品溶液。
对照药材的制备：另取枸杞子对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液。
阴性对照溶液的制备：取方中除枸杞以外的其它药材，按照制法制成阴性对照品。取阴性对照样品2g，余下操作同供试品溶液制备项下操作，作为阴性对照溶液。
薄层层析：照薄层色谱法(中国药典2015版四部通则0502)试验，吸取上述溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-三氯甲烷-甲酸(3:2:1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。
结果：供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点(见附图9)，且阴性无干扰。
结论：枸杞的薄层色谱鉴别列入质量标准正文。
6、人参薄层色谱鉴别
供试品溶液的制备：取除去包衣的本品粉末1g，加三氯甲烷40ml，加热回流1小时，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，加水0.5ml搅拌湿润，加入水饱和正丁醇10ml，超声处理30分钟，吸取上清液加3倍量氨试液，摇匀，放置分层，取上层液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。
对照药材的制备：另取人参对照药材1g，同法制成对照药材溶液。
对照品溶液的制备：取人参皂苷Rb1，Re，Rf，Rg1对照品，加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。
阴性对照溶液的制备：取方中除人参以外的其它药材，按照制法制成阴性对照品。取阴性对照样品2g，余下操作同供试品溶液制备项下操作，作为阴性对照溶液。
薄层层析：照薄层色谱法(中国药典2015版四部通则0502)试验，吸取上述溶液各1～2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15:40:22:10)10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光和紫外光灯(365nm)下检视。
结果：供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，斑点不清晰；且阴性有干扰(见附图10)。
结论：人参的薄层色谱鉴别不列入质量标准正文。
7、白术薄层色谱鉴别
供试品溶液的制备：取除去包衣后的本品粉末0.5g，加正己烷2ml，超声处理15min，滤过，取滤液作为供试品溶液。
对照药材溶液的制备：取白术对照药材0.5g，余下操作同供试品溶液制备项下操作，作为对照药材溶液。
阴性对照溶液的制备：取方中除白术以外的其它药材，按照制法制成阴性对照品。取阴性对照样品0.5g，余下操作同供试品溶液制备项下操作，作为阴性对照溶液。
薄层层析：照薄层色谱法(中国药典2015版四部通则0502)试验，吸取上述溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(50:1)的为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸试液，加热至斑点显色清晰。
结果：供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，斑点不清晰(见附图11)。
结论：白术的薄层色谱鉴别不列入质量标准正文。
8、木香薄层色谱鉴别
供试品溶液的制备：取除去包衣后的本品粉末0.5g，加甲醇10m1，超声处理30分钟，滤过，取滤液作为供试品溶液。
对照品溶液的制备：取去氢木香内酯，木香烃内酯对照品，加甲醇分别制成每lml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。
阴性对照溶液的制备：取方中除木香以外的其它药材，按照制法制成阴性对照品。取阴性对照样品0.5g，余下操作同供试品溶液制备项下操作，作为阴性对照溶液。
薄层层析：照薄层色谱法(中国药典2015版四部通则0502)试验，吸取上述溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-甲酸乙酯-甲酸(15:5:1)的上层液为展开剂，展开，取出，晾干,喷以1％香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。
结果：供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，斑点不清晰；且阴性有干扰(见附图12)。
结论：木香的薄层色谱鉴别不列入质量标准正文。
9、女贞子薄层色谱鉴别
供试品溶液的制备：取除去包衣后的本品粉末0.5g，加三氯甲烷20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。
对照品溶液的制备：取齐墩果酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。
阴性对照溶液的制备：取方中除女贞子以外的其它药材，按照制法制成阴性对照品。取阴性对照样品0.5g，余下操作同供试品溶液制备项下操作，作为阴性对照溶液。
薄层层析：照薄层色谱法(中国药典2015版四部通则0502)试验，吸取上述溶液各4μl分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸(40:1:1)的为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在110℃加热至斑点显色清晰。
结果：供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，且阴性无干扰(见附图13)。
结论：女贞子的薄层色谱鉴别列入质量标准正文。
实施例5：
1、崩解时限、装量差异检查
按中国药典2015年版四部通则检查项进行水分、崩解时限、装量差异等项检查，结果请见表24。检查结果表明，本品三批样品的检查项目均符合标准规定。
表24三个批号样品的检查及结果
批号 装量差异(±％) 崩解时限(分钟) 结论
150401 6.93 15 符合规定
150402 6.70 13 符合规定
150403 6.29 13 符合规定
2、微生物限度
按《中国药典》2015年版四部微生物限度检查法测定，需氧菌总数不得超过103cfu/g，霉菌和酵母菌数不得超过102cfu/g；大肠埃希菌不得检出，活螨不得检出。三批供试品检测结果请见表25。检查结果表明，本品三批样品的微生物限度均符合标准规定。
表25微生物限度检查及结果
批号 需氧菌数(cfu/g) 霉菌酵母菌数(cfu/g) 大肠埃希菌 活螨 结论
150401 30 <10 未检出 未检出 符合规定
150402 30 <10 未检出 未检出 符合规定
150403 40 <10 未检出 未检出 符合规定
3、参归养血片稳定性研究
为了保证本品在贮藏、运输过程中的质量稳定，按照其药品注册标准草案及《中国药典》2015年版一部片剂的规定，以参归养血片中的主要有效成分以及新药审批办法中有关中药片剂稳定性试验的各项规定为考核指标，在模拟上市包装条件下，采用加速稳定性考察和自然室温条件下留样观察法。考察和检验的主要内容为：药品包装、性状、鉴别、检查、微生物限度、含量测定等项。
加速稳定性试验法：设计时间为0、1、2、3、6个月，在试验期间设计的每个月末，从恒温恒湿箱中取样，每次每个批号各取10盒，按所订药品标准草案和《中国药典》2015年版四部制剂通则对片剂的要求与规定，定期定时取样进行检验。
长期稳定性试验法：设计时间为0、3、6、9、12、18、24个月，在试验期间设计的每个月末，从留样室样品柜中取样，每次每个批号各取10盒，按所订药品标准草案和《中国药典》2015年版四部制剂通则对片剂的要求与规定，定期定时取样进行检验。并将每个月末的检验结果与0月检验结果进行比较，观察其变化情况，同时观察包装材料对药品质量有无影响。
试验用样品：参归养血片，片剂，规格：每片重0.3g；批号：150401、150402、150403；包装情况：铝塑泡罩板，包装规格：每盒60片，包装完整。参归养血片(原工艺)，片剂，规格：每片重0.3g；批号：150501、150502、150503；包装：铝塑泡罩板，包装规格：每盒60片，包装完整。留样数量：每批各留样100盒，其中加速稳定性试验留样每批各60盒，长期稳定性试验留样每批各40盒。试验开始日期为：2015年5月29日。
留样条件：加速试验的温度为40℃±2℃，相对湿度为75％±5％；长期试验的温度为25℃±2℃，相对湿度为60％±10％。分别采用恒温恒湿和自然室温存放法，将新工艺参归养血片150401、150402、150403三个批号各60与40盒，参归养血片(原工艺)150501、150502、150503三个批号各60与40盒，分别放置于留样室恒温恒湿箱中。
试验结果表明，对加速6个月和室温条件下放置12个月后的新、旧工艺参归养血片三个批号的样品，经检验各项指标均符合药品标准草案和《中国药典》对片剂有关的各项规定，结果与0月比较，各项指标均无明显变化，包装材料对参归养血片药品质量亦无明显影响，说明本品的稳定性尚好。故暂定其有效期为24个月。
以上给出的实施例是实现本发明较优的例子，本发明不限于上述实施例。本领域的技术人员根据本发明技术方案的技术特征所做出的任何非本质的添加、替换，均属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种参归养血片中药制剂的制备方法，其特征在于：所述参归养血片的制备包括以下步骤：
(1)制备浸膏A：按质量份，取4～6份人参、20～25份黄芪、4～6份女贞子药材，80％乙醇回流提取三次，合并提取液，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，浓缩至稠膏，备用； (2)制备浸膏B：按质量份，取5～6份枸杞子、4～6份牡蛎，加水回流提取二次，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩至稠膏，备用； (3)制备浸膏C：按质量份，取5～6份白术、2～4份五味子、4～5份当归、5～6份川芎、4～5份何首乌、1～2份大黄、2～3份木香共7味药材，75％乙醇回流提取三次，合并提取液，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味；加入药材质量1倍量的水，混匀，静置24h，过滤，收集沉淀，备用； (4)制片：混合上述浸膏，70℃减压干燥或喷雾干燥，粉碎成细粉，加入淀粉适量，混匀，用95％乙醇作润湿剂，过20目筛网制粒；60℃下干燥，加入3％的硬脂酸镁，混匀，过20目筛网，压片，包糖衣或薄膜衣，即得。
2.根据权利要求1所述的参归养血片中药制剂的制备方法，其特征在于：所述参归养血片原料的质量份组分为：人参5份，黄芪20份，白术5份，五味子3份，当归5份，川芎5份，女贞子5份，牡蛎5份，枸杞子5份，何首乌5份，大黄2份，木香2份。
3.根据权利要求1所述的一种参归养血片中药制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，80％乙醇回流提取，第一次乙醇的加入量是药材质量的8倍，第二次乙醇的加入量是药材质量的6倍，第三次乙醇的加入量是药材质量的4倍，每次提取2小时；所述滤液在-0.04Mpa、70℃下减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1 .10～1 .15的浸膏，该相对密度为60℃下测定的密度。
4.根据权利要求1所述的一种参归养血片中药制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，加水回流提取，第一次水的加入量是药材质量的8倍，第二次水的加入量是药材质量的6倍，每次提取2小时；所述滤液在-0 .04Mpa、70℃下减压浓缩至相对密度为1 .10～1.15的浸膏，该相对密度为60℃下测定的密度。
5.根据权利要求1所述的一种参归养血片中药制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，75％乙醇回流提取，第一次乙醇加入量是药材质量的8倍，第二次乙醇加入量是药材质量的6倍，第三次乙醇加入量是药材质量的4倍，每次提取2小时；所述滤液在-0 .04Mpa、70℃下减压回收乙醇；所述浸膏C的相对密度为1 .08～1 .12，该相对密度为25℃下测定的密度。
6.根据权利要求1所述的一种参归养血片中药制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中喷雾干燥压力为0.05Kpa，主机转速50rpm。
7.根据权利要求1或2所述的一种参归养血片中药制剂的制备方法 制备得到的中药制剂的 检测方法，其特征在于：所述检测方法包括含量测定项目，含量测定是采用高效液相色谱法测定参归养血片中特女贞苷成分的含量，具体步骤为： (1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为35:65的甲醇-0 .8％磷酸溶液为流动相，检测波长为224nm，理论塔板数以特女贞苷峰计算应不低于4000； (2)对照品溶液制备：取经五氧化二磷真空干燥24小时的特女贞苷对照品，精密称定，加30％甲醇溶解稀释至0.04-0.06mg/ml，即得对照品溶液； (3)供试品溶液制备：取装量差异项下同一份样品内容物，研细，混匀，取1 .0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％甲醇50ml，称定重量，在功率250W、频率40kHz条件下超声处理20min，放冷，再称定重量，用30％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液： (4)测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录峰面积，以外标法计算，即得。
8.根据权利要求1或2所述的一种参归养血片中药制剂的制备方法制备得到的中药制剂的 检测方法，其特征在于：所述检测方法包括含量测定项目，含量测定是采用高效液相色谱法测定参归养血片中人参皂苷成分的含量，具体步骤为： (1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为99:400的乙腈-0 .05mol/L磷酸水溶液为流动相，检测波长为203nm，理论塔板数以人参皂苷峰计算应不低于2000； (2)对照品溶液制备：取经五氧化二磷真空干燥24小时的人参皂苷Rg1对照品和人参皂苷Re对照品，精密称定，加甲醇溶解稀释至每1ml中含人参皂苷Rg1 0 .3-0 .5mg/ml和人参皂苷Re 0.8-1.2mg/ml，即得对照品溶液； (3)供试品溶液制备：取同一份样品内容物30片，除去糖衣，研细，取粉末4g，精密称定，加乙醚50ml，水浴加热回流提取1小时，滤过，滤渣挥尽乙醚后，加甲醇60ml，水浴加热回流提取1小时，滤过，药渣用少量甲醇洗涤3次，每次10ml，合并滤液和洗液，回收甲醇，残渣加水20ml，温热使溶解，用水饱和的正丁醇提取5次，每次30ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次70ml，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣加水10ml使溶解，加入预先处理好的直径为1 .5cm，下部为填充高度7cm的D101型大孔吸附树脂，上部为填充高度3cm的200目中性氧化铝的混合柱上，用水50ml洗脱，弃去水液，再用70％乙醇80ml洗脱，收集70％乙醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，移置10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液： (4)测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录峰面积，以外标法计算，即得。
9.根据权利要求1或2所述的一种参归养血片中药制剂的制备方法制备得到的中药制剂的 检测方法，其特征在于：所述检测方法包括对制剂中黄芪、当归、川芎、大黄、何首乌、五味子、枸杞子、女贞子的薄层色谱鉴别，具体如下： (1)黄芪薄层色谱鉴别 取本品10片，除去薄膜衣或糖衣，研细，加甲醇30ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml微热使溶解，用饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用氨试液提取3次，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水3～5ml使溶解，通过内径1 .7cm、柱高13cm的D101型大孔吸附树脂柱，以水50ml洗脱，弃去水液，再用40％乙醇30ml洗脱，弃去40％乙醇洗脱液，继用70％乙醇50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇0 .5ml使溶解，作为供试品溶液；取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液各5μl，对照品溶液各3μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷:甲醇:水＝13:6:2的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，热风吹至斑点显色清晰；供试品图谱中，在与对照品色谱相应的位置上，日光下显相同的棕褐色斑点，紫外光灯365nm下显相同的橙黄色荧光斑点； (2)当归、川芎薄层色谱鉴别 取本品10片，除去糖衣或薄膜衣，研细，加乙醇30ml，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至5ml，作为供试品溶液；取当归、川芎对照药材各1g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液各5μl，对照药材溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷:乙酸乙酯＝9:1为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的蓝白色荧光斑点； (3)大黄、何首乌薄层色谱鉴别 取本品10片，除去糖衣或薄膜衣，研细，加甲醇30ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml溶解，再加盐酸1ml，水浴水解30分钟，立即冷却，用乙醚提取2次，每次10ml，合并提取液，挥干，残渣加三氯甲烷1ml使溶解，作为供试品溶液；取大黄对照药材及何首乌对照药材各0 .2g，分别同法制成对照药材溶液；取大黄素对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液各10μl，对照药材溶液及对照品溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以60～90℃沸程下石油醚:甲酸乙酯:甲酸＝15:5:1的上层液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，分别显相同的橙黄色荧光斑点；置氨气中熏后，日光下检视，斑点变为红色；(4)五味子薄层色谱鉴别 取本品10片，除去糖衣或薄膜衣，研细，加三氯甲烷40ml，超声处理10分钟，滤过，残渣加三氯甲烷20ml，超声处理10分钟，滤过，合并两次滤液，加入0 .3g活性炭粉末，超声处理5分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加三氯甲烷1ml使溶解，作为供试品溶液；取五味子醇甲对照品，加三氯甲烷制成每1ml含0 .1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述溶液各15μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以环己烷:乙酸乙酯＝5:5为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯254nm下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点； (5)枸杞子薄层色谱鉴别 取除去包衣的本品粉末0.5g，加水35ml，加热煮沸15分钟，放冷，滤过，滤液用乙酸乙酯15ml振摇提取，提取液浓缩至约1ml，作为供试品溶液；另取枸杞子对照药材0 .5g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯:三氯甲烷:甲酸＝3:2:1为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点； (6)女贞子薄层色谱鉴别 取除去包衣后的本品粉末0 .5g，加三氯甲烷20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；取齐墩果酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述溶液各4μl分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷:甲醇:甲酸＝40:1:1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，110℃下加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
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