CN111304095A - 牛肝菌菌丝可育培养基及其制备方法和应用纯化方法 - Google Patents

牛肝菌菌丝可育培养基及其制备方法和应用纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及菌株组织培养技术领域，公开了一种牛肝菌菌丝可育培养基，包括马铃薯浸出液，葡萄糖，白萝卜汁，氯化铵或硝酸铵，MgCl2，KCl，丁酸钠，琼脂和水；本发明还公开了该培养基的制备方法和应用纯化方法，易于多种野生牛肝菌细胞在该培养基上筛选与生长，脱离野生环境及条件的依赖，促进牛肝菌菌株培育与人工栽培，提高牛肝菌菌株的存活率。

Description

牛肝菌菌丝可育培养基及其制备方法和应用纯化方法
技术领域
本发明涉及菌株组织培养技术领域，具体是牛肝菌菌丝可育培养基及其制备方法和应用纯化方法。
背景技术
暗褐网柄牛肝菌(Phlebopusportentosus)隶属于牛肝菌目(Boletales)小牛肝菌科(Boletaceae)网柄牛肝菌属(Phlebopus)，主要分布于热带地区。国外主要分布在泰国、越南、印度尼西亚、巴西、墨西哥、澳大利亚、新西兰等地区，国内主要分布在云南、广西、海南等地。暗褐网柄牛肝菌具有丰富营养价值，含有丰富的蛋白质、粗脂肪、总糖、粗纤维、氨基酸和多种矿质元素如钾、钙、镁、铁、锌等。
暗褐网柄牛肝菌菌丝可以利用的碳源有葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、麦芽提取物、可溶性淀粉等，可以利用的氮源有酵母提取物、蛋白胨及一些铵盐、硝酸盐，不能利用尿素。普遍认为最适合菌丝生长的碳源和氮源分别是葡萄糖和酵母提取物，有报道显示碳氮比10∶1的麦芽提取物和酵母提取物是其生长最适的培养基，Kumla等却认为蛋白胨和NH4H2PO4是促进菌丝生长最好的氮源。另外添加适量VB1、KH2PO4和MgSO4有利于菌丝的生长。暗褐网柄牛肝菌菌丝能够适应pH3～9的环境。暗褐网柄牛肝菌菌丝能够生长的温度在10～40℃，40℃时菌丝会死亡，而10℃以下菌丝不能生长，最适培养温度28～30℃。暗褐网柄牛肝菌母种直接转接到原种培养基中生长缓慢，液体发酵成为扩大菌种最主要的方式之一。
暗褐网柄牛肝菌是目前唯一能实现人工栽培的牛肝菌目种类，获得菌种主要方法是从野生或优质栽培子实体中分离出母种菌丝，再进一步筛选出优良菌株。高峰等研究得出暗褐网柄牛肝菌菌丝活性随继代次数递增而减弱，故采用适宜母种培养基进行母种菌丝筛选与获得尤为重要。张春霞(暗褐网柄牛肝菌子实体营养成分分析[J].云南大学学报(自然科学版),2010,32(6).)曾筛选出最佳M1培养基，配方为葡萄糖20g；MgSO41g；KH2PO41g；马铃薯200g；琼脂20g；水1L；酵母膏2g，但依然存在菌丝母种菌丝老化和生长速度缓慢，且菌丝只在组织块生长且并不向培养基中延展的情况。
因此，针对暗褐网柄牛肝菌等牛肝菌，我们亟需一种针对牛肝菌，能够高效率地繁育暗褐网柄牛肝菌的培养基。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种牛肝菌菌丝可育培养基及其应用，以达到提高牛肝菌，尤其是暗褐网柄牛肝菌的繁殖效率。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种牛肝菌菌丝可育培养基，包括马铃薯浸出液，葡萄糖，白萝卜汁，氯化铵或硝酸铵，MgCl2，KCl，丁酸钠，琼脂和水。
优选的，牛肝菌菌丝可育培养基还包括氨苄青霉素和链霉素。
优选的，所述白萝卜汁的制备方法包括以下步骤：将白萝卜榨汁后，经纱布过滤得无渣的白萝卜汁。
优选的，牛肝菌菌丝可育培养基的制备方法，包括以下步骤：
1)称取150-200g去皮马铃薯，加水煮沸20-30分钟后，纱布过滤得马铃薯浸出液，然后加入葡萄糖15.0～20.0g，白萝卜汁5～10mL，氯化铵或硝酸铵1.0～2.0g，MgCl21.0～2.0g，KCl 1.0～2.0g，丁酸钠0.5-1.5g和琼脂20.0～30.0g，最后加去离子水定容至1000mL，制得混合液；
2)将混合液于高温条件下灭菌，然后冷却，加入氨苄青霉素和链霉素，使氨苄青霉素和链霉素的终浓度均为20-150μg/mL，混合均匀后立即倒平板，制得牛肝菌菌丝可育培养基。
其中，马铃薯和水的质量比约为1：1-3左右，以使水可以浸没马铃薯即可。
优选的，步骤2)中的高温条件为121℃，灭菌时间为20min，冷却温度至65℃，然后添加氨苄青霉素和链霉素。上述参数的选择是现有技术的最佳条件，可以依据现有技术和现场试验条件做适应性修改。
优选的，所述培养基的pH为5.5-6.5。除此之外，对pH进行限定能够更好地发挥培养基的缓冲剂作用，达到了稳定各种生化反应的效果。
优选的，所述应用纯化方法包括以下步骤：
1)制备若干组牛肝菌菌丝可育培养基备用；
2)菌丝分离培养：采用组织分离法从牛肝菌子实体上分离出无菌子实体组织块或丝，快速接种于牛肝菌菌丝可育培养基上培养；
3)菌丝纯化培养：在步骤2)的培养基上，选取生长出菌丝的样品，避开杂菌生长菌落，切取菌丝前端约1.0-5.0毫米，然后继续接种到新的牛肝菌菌丝可育培养基上继续培养；
4)菌丝基因测序：在步骤3)的培养基上，选取纯化后的菌丝样品，利用基因测序方法鉴定所测样品的物种；
5)纯化菌丝继代与培养：取步骤4)鉴定后的牛肝菌菌丝块接种于牛肝菌菌丝纯化培养基，倒置培养。
优选的，步骤5)纯化培养的温度为28℃。上述温度可以依据现有技术和实验条件做适应性的调整。
优选的，菌丝基因测序包括以下步骤：
1)菌丝基因提取：选取步骤3)纯化后的菌丝样品，利用DNA提取试剂盒提取样品DNA；
2)菌丝基因测序：采用ITS鉴定法对提取的样品DNA进行ITS1和ITS4聚合酶链反应扩增，得到的扩增DNA片段经回收纯化后连接到T4 Quick Blunt载体，然后转化大肠杆菌后检测测序；
3)菌丝基因鉴定：将步骤4)样品测序结果与GenBank序列数据库或菌类序列数据库比对，获得序列同源性，进行分析比较，判断所测样品的物种。
基因测序技术是一种检测菌株物种的现有技术。具体测序方法和工具的选择可以根据现有技术做适应性调整。
优选的，所述牛肝菌菌丝纯化培养基的制备方法，包括以下步骤：
1)称取150-200g去皮马铃薯，加水煮沸20-30分钟后，纱布过滤得马铃薯浸出液，然后加入葡萄糖15.0～20.0g，白萝卜汁5～10mL，氯化铵或硝酸铵1.0～2.0g，MgCl21.0～2.0g，KCl 1.0～2.0g和琼脂20.0～30.0g，最后加去离子水定容至1000mL，制得混合液；
2)将混合液于高温条件下灭菌，然后冷却，加入氨苄青霉素和链霉素，使氨苄青霉素和链霉素的终浓度均为20-150μg/mL，混合均匀后立即倒平板，制得牛肝菌菌丝可育培养基。
纯化培养基相较于可育培养基减少了丁酸钠，丁酸钠对牛肝菌细胞的刺激及诱导作用，进一步使多种野生牛肝菌细胞在可育培养基上筛选，而纯化培养基提供适宜牛肝菌生长的营养物质即可。
牛肝菌菌丝可育培养基的应用纯化方法，用于牛肝菌的应用纯化。具体的菌类涵盖：暗褐网柄牛肝菌、黑牛肝菌、黑绒盖牛肝菌、茶褐牛肝菌、栗色牛肝菌、褐盖牛肝菌、血红牛肝菌、红脚牛肝菌、灰盖牛肝菌、绒柄牛肝菌、美味牛肝菌、橙黄疣柄牛肝菌、黄皮疣柄牛肝菌、褐环乳牛肝菌、粘盖牛肝菌、褐粘盖牛肝菌、白柄粘盖牛肝菌、松林假牛肝菌、褐圆孔牛肝菌、蓝圆孔牛肝菌等。
通过上述技术方案，白萝卜汁的加入能够有效补充牛肝菌野生状态下需要植物根细胞质及间质中的多种微量元素，再加入氯化铵或硝酸铵等N源物质、MgCl2和KCl等无机盐的共同作用，能够诱导多种牛肝菌菌丝的生长。同时，再配合丁酸钠对牛肝菌细胞的刺激及诱导作用，进一步使多种野生牛肝菌细胞在该培养基上筛选与生长，脱离野生环境及条件的依赖，最终促进牛肝菌菌株培育与人工栽培。
本发明的有益效果是：
本发明制得的牛肝菌菌丝可育培养基使得多种野生牛肝菌细胞在该培养基上筛选与生长，可以脱离野生环境及条件的依赖，促进牛肝菌菌株培育与人工栽培，同时提高牛肝菌菌株的存活率。
附图说明
图1为实施例2暗褐网柄牛肝菌的菌丝生长情况图；
图2为暗褐网柄牛肝菌出菇子实体图；
图3为黑牛肝菌出菇子实体图。
具体实施方式
下面结合附图进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例1
1)制备若干组牛肝菌菌丝可育培养基备用：
称取150g去皮马铃薯，加水煮沸20分钟后，纱布过滤得马铃薯浸出液，然后加入葡萄糖15.0g、白萝卜汁5mL、氯化铵或硝酸铵1.0g、MgCl21.0g、KCl 1.0g，丁酸钠0.5g和琼脂20.0g，最后加去离子水定容至1000mL，制得混合液；
将混合液于121℃条件下灭菌20min，然后冷却至65℃，加入氨苄青霉素和链霉素，使氨苄青霉素和链霉素的终浓度均为20μg/mL，混合均匀后立即倒平板，制得牛肝菌菌丝可育培养基；
2)菌丝分离培养：采用组织分离法从暗褐网柄牛肝菌子实体上分离出无菌子实体组织块或丝，快速接种于牛肝菌菌丝可育培养基上培养；
3)菌丝纯化培养：选取步骤2)生长出菌丝的样品，避开杂菌生长菌落，切取菌丝前端约1.0毫米，然后继续接种到新的牛肝菌菌丝可育培养基上继续培养；
4)菌丝基因提取：选取步骤3)纯化后的菌丝样品，利用DNA提取试剂盒提取样品DNA；
5)菌丝基因测序：采用ITS鉴定法对提取的样品DNA进行ITS1和ITS4聚合酶链反应扩增，得到的扩增DNA片段经回收纯化后连接到T4 Quick Blunt载体，然后转化大肠杆菌后检测测序；
6)菌丝基因鉴定：将步骤4)样品测序结果与GenBank序列数据库或菌类序列数据库比对，获得序列同源性，进行分析比较，判断所测样品的物种；
7)纯化菌丝继代与培养：取纯化后菌丝块接种于牛肝菌菌丝纯化培养基，28℃下倒置培养。菌丝长满时间13～15天(d)，其出菇率(％)70.5％～75.3％。
所述牛肝菌菌丝可育培养基的pH＝6.5。牛肝菌菌丝纯化培养基相较于没有添加丁酸钠，其他组分和含量与本实施例1的牛肝菌菌丝可育培养基均一致。
实施例2
1)制备若干组牛肝菌菌丝可育培养基备用：
称取200g去皮马铃薯，加水煮沸30分钟后，纱布过滤得马铃薯浸出液，然后加入葡萄糖20.0g、白萝卜汁10mL、氯化铵或硝酸铵2.0g、MgCl22.0g、KCl 2.0g，丁酸钠1.5g和琼脂30.0g，最后加去离子水定容至1000mL，制得混合液；
将混合液于121℃条件下灭菌20min，然后冷却至50℃，加入氨苄青霉素和链霉素，使氨苄青霉素和链霉素的终浓度均为150μg/mL，混合均匀后立即倒平板，制得牛肝菌菌丝可育培养基；
2)菌丝分离培养：采用组织分离法从暗褐网柄牛肝菌子实体上分离出无菌子实体组织块或丝，快速接种于牛肝菌菌丝可育培养基上培养；
3)菌丝纯化培养：选取步骤2)生长出菌丝的样品，避开杂菌生长菌落，切取菌丝前端约5.0毫米，然后继续接种到新的牛肝菌菌丝可育培养基上继续培养；
4)菌丝基因提取：选取步骤3)纯化后的菌丝样品，利用DNA提取试剂盒提取样品DNA；
5)菌丝基因测序：采用ITS鉴定法对提取的样品DNA进行ITS1和ITS4聚合酶链反应扩增，得到的扩增DNA片段经回收纯化后连接到T4 Quick Blunt载体，然后转化大肠杆菌后检测测序；
6)菌丝基因鉴定：将步骤4)样品测序结果与GenBank序列数据库或菌类序列数据库比对，获得序列同源性，进行分析比较，判断所测样品的物种；
7)纯化菌丝继代与培养：取纯化后菌丝块接种于牛肝菌菌丝纯化培养基，28℃下倒置培养。菌丝长满时间12～14天(d)，其出菇率(％)72.1％～76.6％。
所述牛肝菌菌丝可育培养基的pH＝5.5。牛肝菌菌丝纯化培养基相较于没有添加丁酸钠，其他组分和含量与本实施例2的牛肝菌菌丝可育培养基均一致。
实施例3
1)制备若干组牛肝菌菌丝可育培养基备用：
称取175g去皮马铃薯，加水煮沸25分钟后，纱布过滤得马铃薯浸出液，然后加入葡萄糖17.5g、白萝卜汁7.5mL、氯化铵或硝酸铵1.5g、MgCl21.5g、KCl1.5g，丁酸钠1g和琼脂25.0g，最后加去离子水定容至1000mL，制得混合液；
将混合液于121℃条件下灭菌20min，然后冷却至60℃，加入氨苄青霉素和链霉素，使氨苄青霉素和链霉素的终浓度均为50μg/mL，混合均匀后立即倒平板，制得牛肝菌菌丝可育培养基；
2)菌丝分离培养：采用组织分离法从暗褐网柄牛肝菌子实体上分离出无菌子实体组织块或丝，快速接种于牛肝菌菌丝可育培养基上培养；
3)菌丝纯化培养：选取步骤2)生长出菌丝的样品，避开杂菌生长菌落，切取菌丝前端约3.0毫米，然后继续接种到新的牛肝菌菌丝可育培养基上继续培养；
4)菌丝基因提取：选取步骤3)纯化后的菌丝样品，利用DNA提取试剂盒提取样品DNA；
5)菌丝基因测序：采用ITS鉴定法对提取的样品DNA进行ITS1和ITS4聚合酶链反应扩增，得到的扩增DNA片段经回收纯化后连接到T4 Quick Blunt载体，然后转化大肠杆菌后检测测序；
6)菌丝基因鉴定：将步骤4)样品测序结果与GenBank序列数据库或菌类序列数据库比对，获得序列同源性，进行分析比较，判断所测样品的物种；
7)纯化菌丝继代与培养：取纯化后菌丝块接种于牛肝菌菌丝纯化培养基，28℃下倒置培养。菌丝长满时间7～9天(d)，其出菇率(％)80.7％～86.5％。
所述牛肝菌菌丝可育培养基的pH＝6.0。牛肝菌菌丝纯化培养基相较于没有添加丁酸钠，其他组分和含量与本实施例3的牛肝菌菌丝可育培养基均一致。
实施例4
1)制备若干组牛肝菌菌丝可育培养基备用：
称取160g去皮马铃薯，加水煮沸20分钟后，纱布过滤得马铃薯浸出液，然后加入葡萄糖15.0g、白萝卜汁5mL、氯化铵或硝酸铵1.0g、MgCl21.0g、KCl 1.0g，丁酸钠0.5g和琼脂20.0g，最后加去离子水定容至1000mL，制得混合液；
将混合液于125℃条件下灭菌17min，然后冷却至55℃，加入氨苄青霉素和链霉素，使氨苄青霉素和链霉素的终浓度均为20μg/mL，混合均匀后立即倒平板，制得牛肝菌菌丝可育培养基；
2)菌丝分离培养：采用组织分离法从黑绒盖牛肝菌子实体上分离出无菌子实体组织块或丝，快速接种于牛肝菌菌丝可育培养基上培养；
3)菌丝纯化培养：选取步骤2)生长出菌丝的样品，避开杂菌生长菌落，切取菌丝前端约1.0毫米，然后继续接种到新的牛肝菌菌丝可育培养基上继续培养；
4)菌丝基因提取：选取步骤3)纯化后的菌丝样品，利用DNA提取试剂盒提取样品DNA；
5)菌丝基因测序：采用ITS鉴定法对提取的样品DNA进行ITS1和ITS4聚合酶链反应扩增，得到的扩增DNA片段经回收纯化后连接到T4 Quick Blunt载体，然后转化大肠杆菌后检测测序；
6)菌丝基因鉴定：将步骤4)样品测序结果与GenBank序列数据库或菌类序列数据库比对，获得序列同源性，进行分析比较，判断所测样品的物种；
7)纯化菌丝继代与培养：取纯化后菌丝块接种于牛肝菌菌丝纯化培养基，28℃下倒置培养。菌丝长满时间13～15天(d)，继代20个月后菌丝活力(％)71.9％～76.4％。
所述牛肝菌菌丝可育培养基的pH＝6.5。牛肝菌菌丝纯化培养基相较于没有添加丁酸钠，其他组分和含量与本实施例4的牛肝菌菌丝可育培养基均一致。
实施例5
1)制备若干组牛肝菌菌丝可育培养基备用：
称取200g去皮马铃薯，加水煮沸30分钟后，纱布过滤得马铃薯浸出液，然后加入葡萄糖20.0g、白萝卜汁10mL、氯化铵或硝酸铵2.0g、MgCl22.0g、KCl 2.0g，丁酸钠1.5g和琼脂30.0g，最后加去离子水定容至1000mL，制得混合液；
将混合液于115℃条件下灭菌30min，然后冷却至65℃，加入氨苄青霉素和链霉素，使氨苄青霉素和链霉素的终浓度均为150μg/mL，混合均匀后立即倒平板，制得牛肝菌菌丝可育培养基；
2)菌丝分离培养：采用组织分离法从黑绒盖牛肝菌子实体上分离出无菌子实体组织块或丝，快速接种于牛肝菌菌丝可育培养基上培养；
3)菌丝纯化培养：选取步骤2)生长出菌丝的样品，避开杂菌生长菌落，切取菌丝前端约5.0毫米，然后继续接种到新的牛肝菌菌丝可育培养基上继续培养；
4)菌丝基因提取：选取步骤3)纯化后的菌丝样品，利用DNA提取试剂盒提取样品DNA；
5)菌丝基因测序：采用ITS鉴定法对提取的样品DNA进行ITS1和ITS4聚合酶链反应扩增，得到的扩增DNA片段经回收纯化后连接到T4 Quick Blunt载体，然后转化大肠杆菌后检测测序；
6)菌丝基因鉴定：将步骤4)样品测序结果与GenBank序列数据库或菌类序列数据库比对，获得序列同源性，进行分析比较，判断所测样品的物种；
7)纯化菌丝继代与培养：取纯化后菌丝块接种于牛肝菌菌丝纯化培养基，28℃下倒置培养。菌丝长满时间12～14天(d)，继代20个月后菌丝活力(％)73.8％～78.6％。
所述牛肝菌菌丝可育培养基的pH＝5.5。牛肝菌菌丝纯化培养基相较于没有添加丁酸钠，其他组分和含量与本实施例5的牛肝菌菌丝可育培养基均一致。
实施例6
1)制备若干组牛肝菌菌丝可育培养基备用：
称取180g去皮马铃薯，加水煮沸25分钟后，纱布过滤得马铃薯浸出液，然后加入葡萄糖18g、白萝卜汁7.5mL、氯化铵或硝酸铵1.5g、MgCl21.5g、KCl 1.5g，丁酸钠1g和琼脂25.0g，最后加去离子水定容至1000mL，制得混合液；
将混合液于130℃条件下灭菌15min，然后冷却至60℃，加入氨苄青霉素和链霉素，使氨苄青霉素和链霉素的终浓度均为50μg/mL，混合均匀后立即倒平板，制得牛肝菌菌丝可育培养基；
2)菌丝分离培养：采用组织分离法从黑绒盖牛肝菌子实体上分离出无菌子实体组织块或丝，快速接种于牛肝菌菌丝可育培养基上培养；
3)菌丝纯化培养：选取步骤2)生长出菌丝的样品，避开杂菌生长菌落，切取菌丝前端约3.0毫米，然后继续接种到新的牛肝菌菌丝可育培养基上继续培养；
4)菌丝基因提取：选取步骤3)纯化后的菌丝样品，利用DNA提取试剂盒提取样品DNA；
5)菌丝基因测序：采用ITS鉴定法对提取的样品DNA进行ITS1和ITS4聚合酶链反应扩增，得到的扩增DNA片段经回收纯化后连接到T4 Quick Blunt载体，然后转化大肠杆菌后检测测序；
6)菌丝基因鉴定：将步骤4)样品测序结果与GenBank序列数据库或菌类序列数据库比对，获得序列同源性，进行分析比较，判断所测样品的物种；
7)纯化菌丝继代与培养：取纯化后菌丝块接种于牛肝菌菌丝纯化培养基，28℃下倒置培养。菌丝长满时间7～9天(d)，继代20个月后菌丝活力(％)78.5％～84.2％。
所述牛肝菌菌丝可育培养基的pH＝5.8。牛肝菌菌丝纯化培养基相较于没有添加丁酸钠，其他组分和含量与本实施例6的牛肝菌菌丝可育培养基均一致。
实施例7
1)制备若干组牛肝菌菌丝可育培养基备用：
称取155g去皮马铃薯，加水煮沸20分钟后，纱布过滤得马铃薯浸出液，然后加入葡萄糖16.0g、白萝卜汁5mL、氯化铵或硝酸铵1.0g、MgCl21.0g、KCl 1.0g，丁酸钠0.5g和琼脂20.0g，最后加去离子水定容至1000mL，制得混合液；
将混合液于121℃条件下灭菌20min，然后冷却至50℃，加入氨苄青霉素和链霉素，使氨苄青霉素和链霉素的终浓度均为20μg/mL，混合均匀后立即倒平板，制得牛肝菌菌丝可育培养基；
2)菌丝分离培养：采用组织分离法从黑牛肝菌子实体上分离出无菌子实体组织块或丝，快速接种于牛肝菌菌丝可育培养基上培养；
3)菌丝纯化培养：选取步骤2)生长出菌丝的样品，避开杂菌生长菌落，切取菌丝前端约1.0毫米，然后继续接种到新的牛肝菌菌丝可育培养基上继续培养；
4)菌丝基因提取：选取步骤3)纯化后的菌丝样品，利用DNA提取试剂盒提取样品DNA；
5)菌丝基因测序：采用ITS鉴定法对提取的样品DNA进行ITS1和ITS4聚合酶链反应扩增，得到的扩增DNA片段经回收纯化后连接到T4 Quick Blunt载体，然后转化大肠杆菌后检测测序；
6)菌丝基因鉴定：将步骤4)样品测序结果与GenBank序列数据库或菌类序列数据库比对，获得序列同源性，进行分析比较，判断所测样品的物种；
7)纯化菌丝继代与培养：取纯化后菌丝块接种于牛肝菌菌丝纯化培养基，28℃下倒置培养。菌丝长满时间13～15天(d)，继代20个月后菌丝活力(％)70.4％～75.8％。
所述牛肝菌菌丝可育培养基的pH＝6.5。牛肝菌菌丝纯化培养基相较于没有添加丁酸钠，其他组分和含量与本实施例7的牛肝菌菌丝可育培养基均一致。
实施例8
1)制备若干组牛肝菌菌丝可育培养基备用：
称取200g去皮马铃薯，加水煮沸30分钟后，纱布过滤得马铃薯浸出液，然后加入葡萄糖20.0g、白萝卜汁10mL、氯化铵或硝酸铵2.0g、MgCl22.0g、KCl 2.0g，丁酸钠1.5g和琼脂30.0g，最后加去离子水定容至1000mL，制得混合液；
将混合液于121℃条件下灭菌20min，然后冷却至65℃，加入氨苄青霉素和链霉素，使氨苄青霉素和链霉素的终浓度均为150μg/mL，混合均匀后立即倒平板，制得牛肝菌菌丝可育培养基；
2)菌丝分离培养：采用组织分离法从黑牛肝菌子实体上分离出无菌子实体组织块或丝，快速接种于牛肝菌菌丝可育培养基上培养；
3)菌丝纯化培养：选取步骤2)生长出菌丝的样品，避开杂菌生长菌落，切取菌丝前端约5.0毫米，然后继续接种到新的牛肝菌菌丝可育培养基上继续培养；
4)菌丝基因提取：选取步骤3)纯化后的菌丝样品，利用DNA提取试剂盒提取样品DNA；
5)菌丝基因测序：采用ITS鉴定法对提取的样品DNA进行ITS1和ITS4聚合酶链反应扩增，得到的扩增DNA片段经回收纯化后连接到T4 Quick Blunt载体，然后转化大肠杆菌后检测测序；
6)菌丝基因鉴定：将步骤4)样品测序结果与GenBank序列数据库或菌类序列数据库比对，获得序列同源性，进行分析比较，判断所测样品的物种；
7)纯化菌丝继代与培养：取纯化后菌丝块接种于牛肝菌菌丝纯化培养基，28℃下倒置培养。菌丝长满时间12～14天(d)，继代20个月后菌丝活力(％)71.7％～77.5％。
所述牛肝菌菌丝可育培养基的pH＝5.5。牛肝菌菌丝纯化培养基相较于没有添加丁酸钠，其他组分和含量与本实施例8的牛肝菌菌丝可育培养基均一致。
实施例9
1)制备若干组牛肝菌菌丝可育培养基备用：
称取185g去皮马铃薯，加水煮沸25分钟后，纱布过滤得马铃薯浸出液，然后加入葡萄糖17.5g、白萝卜汁7.5mL、氯化铵或硝酸铵1.5g、MgCl21.5g、KCl1.5g，丁酸钠1g和琼脂25.0g，最后加去离子水定容至1000mL，制得混合液；
将混合液于121℃条件下灭菌20min，然后冷却至58℃，加入氨苄青霉素和链霉素，使氨苄青霉素和链霉素的终浓度均为50μg/mL，混合均匀后立即倒平板，制得牛肝菌菌丝可育培养基；
2)菌丝分离培养：采用组织分离法从黑牛肝菌子实体上分离出无菌子实体组织块或丝，快速接种于牛肝菌菌丝可育培养基上培养；
3)菌丝纯化培养：选取步骤2)生长出菌丝的样品，避开杂菌生长菌落，切取菌丝前端约3.0毫米，然后继续接种到新的牛肝菌菌丝可育培养基上继续培养；
4)菌丝基因提取：选取步骤3)纯化后的菌丝样品，利用DNA提取试剂盒提取样品DNA；
5)菌丝基因测序：采用ITS鉴定法对提取的样品DNA进行ITS1和ITS4聚合酶链反应扩增，得到的扩增DNA片段经回收纯化后连接到T4 Quick Blunt载体，然后转化大肠杆菌后检测测序；
6)菌丝基因鉴定：将步骤4)样品测序结果与GenBank序列数据库或菌类序列数据库比对，获得序列同源性，进行分析比较，判断所测样品的物种；
7)纯化菌丝继代与培养：取纯化后菌丝块接种于牛肝菌菌丝纯化培养基，28℃下倒置培养。菌丝长满时间7～9天(d)，继代20个月后菌丝活力(％)79.3％～85.1％。
所述牛肝菌菌丝可育培养基的pH＝6.0。牛肝菌菌丝纯化培养基相较于没有添加丁酸钠，其他组分和含量与本实施例9的牛肝菌菌丝可育培养基均一致。
实施例10
1)制备若干组牛肝菌菌丝可育培养基备用：
称取175g去皮马铃薯，加水煮沸25分钟后，纱布过滤得马铃薯浸出液，然后加入葡萄糖17.5g、白萝卜汁7.5mL、氯化铵或硝酸铵1.5g、MgCl21.5g、KCl1.5g，丁酸钠1g和琼脂25.0g，最后加去离子水定容至1000mL，制得混合液；
将混合液于121℃条件下灭菌20min，然后冷却至60℃，加入氨苄青霉素和链霉素，使氨苄青霉素和链霉素的终浓度均为50μg/mL，混合均匀后立即倒平板，制得牛肝菌菌丝可育培养基；
2)菌丝分离培养：采用组织分离法从褐环乳牛肝菌子实体上分离出无菌子实体组织块或丝，快速接种于牛肝菌菌丝可育培养基上培养；
3)菌丝纯化培养：选取步骤2)生长出菌丝的样品，避开杂菌生长菌落，切取菌丝前端约3.0毫米，然后继续接种到新的牛肝菌菌丝可育培养基上继续培养；
4)菌丝基因提取：选取步骤3)纯化后的菌丝样品，利用DNA提取试剂盒提取样品DNA；
5)菌丝基因测序：采用ITS鉴定法对提取的样品DNA进行ITS1和ITS4聚合酶链反应扩增，得到的扩增DNA片段经回收纯化后连接到T4 Quick Blunt载体，然后转化大肠杆菌后检测测序；
6)菌丝基因鉴定：将步骤4)样品测序结果与GenBank序列数据库或菌类序列数据库比对，获得序列同源性，进行分析比较，判断所测样品的物种；
7)纯化菌丝继代与培养：取纯化后菌丝块接种于牛肝菌菌丝纯化培养基，28℃下倒置培养。菌丝长满时间7～9天(d)，继代20个月后菌丝活力(％)81.3％～85.4％。
所述牛肝菌菌丝可育培养基的pH＝6.0。牛肝菌菌丝纯化培养基相较于没有添加丁酸钠，其他组分和含量与本实施例10的牛肝菌菌丝可育培养基均一致。
实施例11
1)制备若干组牛肝菌菌丝可育培养基备用：
称取180g去皮马铃薯，加水煮沸25分钟后，纱布过滤得马铃薯浸出液，然后加入葡萄糖17.0g、白萝卜汁8.0mL、氯化铵或硝酸铵1.5g、MgCl21.5g、KCl 1.5g，丁酸钠1.0g和琼脂25.0g，最后加去离子水定容至1000mL，制得混合液；
将混合液于121℃条件下灭菌20min，然后冷却至60℃，加入氨苄青霉素和链霉素，使氨苄青霉素和链霉素的终浓度均为50μg/mL，混合均匀后立即倒平板，制得牛肝菌菌丝可育培养基；
2)菌丝分离培养：采用组织分离法从美味牛肝菌子实体上分离出无菌子实体组织块或丝，快速接种于牛肝菌菌丝可育培养基上培养；
3)菌丝纯化培养：选取步骤2)生长出菌丝的样品，避开杂菌生长菌落，切取菌丝前端约3.0毫米，然后继续接种到新的牛肝菌菌丝可育培养基上继续培养；
4)菌丝基因提取：选取步骤3)纯化后的菌丝样品，利用DNA提取试剂盒提取样品DNA；
5)菌丝基因测序：采用ITS鉴定法对提取的样品DNA进行ITS1和ITS4聚合酶链反应扩增，得到的扩增DNA片段经回收纯化后连接到T4 Quick Blunt载体，然后转化大肠杆菌后检测测序；
6)菌丝基因鉴定：将步骤4)样品测序结果与GenBank序列数据库或菌类序列数据库比对，获得序列同源性，进行分析比较，判断所测样品的物种；
7)纯化菌丝继代与培养：取纯化后菌丝块接种于牛肝菌菌丝纯化培养基，28℃下倒置培养。菌丝长满时间7～9天(d)，继代20个月后菌丝活力(％)81.8％～86.3％。
所述牛肝菌菌丝可育培养基的pH＝5.8。牛肝菌菌丝纯化培养基相较于没有添加丁酸钠，其他组分和含量与本实施例11的牛肝菌菌丝可育培养基均一致。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (8)

1.一种牛肝菌菌丝可育培养基，其特征在于，包括马铃薯浸出液，葡萄糖，白萝卜汁，氯化铵或硝酸铵，MgCl2，KCl，丁酸钠，琼脂和水。
2.根据权利要求1所述的牛肝菌菌丝可育培养基，其特征在于，还包括氨苄青霉素和链霉素。
3.根据权利要求2所述的牛肝菌菌丝可育培养基，其特征在于，所述白萝卜汁的制备方法为：将白萝卜榨汁后，经纱布过滤得无渣的白萝卜汁。
4.根据权利要求3所述的牛肝菌菌丝可育培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)称取150-200g去皮马铃薯，加水煮沸20-30分钟后，纱布过滤得马铃薯浸出液，然后加入葡萄糖15.0～20.0g，白萝卜汁5～10mL，氯化铵或硝酸铵1.0～2.0g，MgCl21.0～2.0g，KCl 1.0～2.0g，丁酸钠0.5-1.5g和琼脂20.0～30.0g，最后加去离子水定容至1000mL，制得混合液；
2)将混合液于高温条件下灭菌，然后冷却，加入氨苄青霉素和链霉素，使氨苄青霉素和链霉素的终浓度均为20-150μg/mL，混合均匀后立即倒平板，制得牛肝菌菌丝可育培养基。
5.根据权利要求4所述的牛肝菌菌丝可育培养基的制备方法，其特征在于，所述牛肝菌菌丝可育培养基的pH为5.5-6.5。
6.根据权利要求5所述制备方法制得的牛肝菌菌丝可育培养基的应用纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)制备若干组牛肝菌菌丝可育培养基备用；
2)菌丝分离培养：采用组织分离法从牛肝菌子实体上分离出无菌子实体组织块或丝，快速接种于牛肝菌菌丝可育培养基上培养；
3)菌丝纯化培养：在步骤2)的培养基上，避开杂菌生长菌落，选取生长出菌丝的样品，切取菌丝前端约1.0-5.0毫米，然后继续接种到新的牛肝菌菌丝可育培养基上继续培养；
4)菌丝基因测序：在步骤3)的培养基上，选取纯化后的菌丝样品，利用基因测序方法鉴定所测样品的物种；
5)纯化菌丝继代与培养：取步骤4)鉴定后的牛肝菌菌丝块接种于牛肝菌菌丝纯化培养基，倒置培养。
7.根据权利要求6所述的应用纯化方法，其特征在于，所述牛肝菌菌丝纯化培养基的制备方法，包括以下步骤：
1)称取150-200g去皮马铃薯，加水煮沸20-30分钟后，纱布过滤得马铃薯浸出液，然后加入葡萄糖15.0～20.0g，白萝卜汁5～10mL，氯化铵或硝酸铵1.0～2.0g，MgCl21.0～2.0g，KCl 1.0～2.0g和琼脂20.0～30.0g，最后加去离子水定容至1000mL，制得混合液；
2)将混合液于高温条件下灭菌，然后冷却，加入氨苄青霉素和链霉素，使氨苄青霉素和链霉素的终浓度均为20-150μg/mL，混合均匀后立即倒平板，制得牛肝菌菌丝可育培养基。
8.根据权利要求7所述的应用纯化方法，其特征在于，用于牛肝菌的应用纯化。
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