CN111297989A - 一种治疗新型冠状病毒的中药复方 - Google Patents

一种治疗新型冠状病毒的中药复方 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种治疗新型冠状病毒的中药复方，属于中药领域。本发明分离培养出了一株新型冠状病毒，命名为xCov，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC NO.19295，保藏日期：2020年2月14日，分类学命名：冠状病毒。该病毒与2019‑nCoV的S蛋白同源性达92％，而且非常安全，可用于2019‑nCoV病毒的药物筛选与评价、疫苗筛选与评价、减毒及灭活疫苗的制备。本发明利用xCov作为模型，筛选出对其具有明显抑制作用的中药复方，为2019‑nCoV的治疗提供了新的方向和思路。

Description

一种治疗新型冠状病毒的中药复方
技术领域
本发明属于中药领域，尤其涉及一种治疗新型冠状病毒的中药复方。
背景技术
2019-nCov即2019新型冠状病毒，人感染了该冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。目前对于2019新型冠状病毒所致疾病没有有效的治疗药物。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种治疗新型冠状病毒的中药复方。该中药复方包括如下重量份的组分：去核的柯子10-20g、青果8-12g、锦灯笼8-10g、山豆根5-7g、射干 8-12g、栀子8-10g、儿茶2-4g、生麻黄8-12g。
本发明已经从穿山甲中分离培养出一株新型冠状病毒，并将其命名为xCov，全基因组序列分析结果显示：该病毒与2019-nCoV的S蛋白同源性达92％，是迄今为止成功分离培养的与2019-nCoV的S蛋白同源性最高的病毒。进一步实验显示该病毒感染细胞的受体与2019-nCoV一致，均为血管紧张素转化酶2(ACE2)。该病毒不感染人，因此非常安全，可用于2019-nCoV病毒的药物筛选与评价、疫苗筛选与评价、减毒及灭活疫苗的制备。xCov感染哺乳动物细胞Vero(非洲绿猴肾细胞)以后能产生明显的致细胞病变效应，细胞感染后被完全裂解，基于这一特点，本发明预计采用合适滴度的xCov感染293T细胞(MOI＝10)，同时向其中加入不同浓度的各种潜在病毒抑制剂，在2-5天后通过检测病毒在细胞中复制百分比来检测潜在药物对xCov感染细胞的抑制作用。由于xCov与目前的病原体2019-nCoV 高度同源，且xCov感染细胞的受体与2019-nCoV一致，如果药物对xCov感染细胞有抑制作用，则极有可能对2019-nCoV的感染有抑制作用。
本发明所使用的病毒xCov已经在以下两篇文献中公开了：
1.Hua-Hao Fan,Li-Qin Wang,Wen-Li Liu,Xiao-Ping An,Zhen-Dong Liu,Xiao-Qi He, Li-Hua Song,Yi-Gang Tong.Repurposing of clinically approved drugs fortreatment of coronavirus disease 2019 in a 2019-novel coronavirus(2019-nCoV)related coronavirus.
2.Lam TT-Y,Shum MH-H,Zhu H-C,Tong Y-G,Ni X-B,Liao Y-S,etal.Identification of 2019-nCoV related coronaviruses in Malayan pangolins insouthern China.bioRxiv 2020； 2020.2002.2013.945485.doi:10.1101/2020.02.13.945485.
本发明中所使用的xCov先进行的菌种保藏，后发表论文，保藏证明中的xCov即为文献当中的病毒GX_P2V。
本发明以xCov为模型进行药物筛选，经多次试验筛选出本发明提供的中药复方，其对 xCov具有明显的抑制作用。
上述中药复方中以生麻黄为君药，生麻黄辛、微苦，温，归肺、膀胱经，功在发汗散寒，宣肺平喘，利水消肿，多用于治疗风寒感冒，胸闷喘咳，风水浮肿。《本经》："主中风、伤寒头痛，温疟，发表出汗，去邪热气，止咳逆上气，除寒热，破症坚积聚。"《珍珠囊》：" 泄卫中实，去营中寒，发太阳、少阴之汗。"《滇南本草》："治鼻窍闭塞不通、香臭不闻，肺寒咳嗽。"故本方中选取生麻黄宣肺气，止咳平喘。
上述中药复方中以栀子为臣药，栀子性寒，味苦，归心经、肺经、三焦经；泻火除烦、清热利尿、凉血解毒。
上述中药复方中另以射干、山豆根、儿茶、锦灯笼、青果、柯子六药共为佐药，其中射干苦，寒，归肺经，《本经》："主咳逆上气，喉痹咽痛，不得消息，散结气，腹中邪逆，食饮大热。"以射干为佐则可清热解毒，消痰利咽。山豆根苦，寒，归肺、胃经，《本草图经》： "含以解咽喉肿痛。《仁济直指方》"治咽喉上膈热毒患瘰疬者。”故选山豆根清热利咽喉。儿茶苦、涩，微寒，归肺经，《本草纲目》："清上膈热，化痰生津。"《本草正》："降火生津，清痰涎咳嗽，治口疮喉痹，烦热，止消渴。"故选用儿茶清肺化痰，养阴生津。锦灯笼苦，寒，归肺经，《南京民间药草》：治喉痛及肿。《中药材手册》：清肺胃热，消郁结，止喉痛。治咽肿，锁缠喉风，一切疮肿，妇女血崩。现代医学认为：锦灯笼能利咽化痰，可治肝炎，咽喉肿疼，肺热咳嗽等。柯子性平，味苦、酸、涩。归肺经、大肠经。涩肠敛肺、降水利咽。用于肺虚喘咳、久嗽不止、咽痛音哑。青果性平，味甘、酸。归肺经、胃经。清热、利咽、生津、解毒。用治咽喉肿痛、咳嗽、烦渴等症。故选用此六味药性味寒凉为之佐，一在清肺热化湿毒，二在平衡寒热，佐助君臣。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明以xCov为模型为模型进行药物筛选，该病毒与2019-nCoV的S蛋白同源性达92％，是迄今为止成功分离培养的与2019-nCoV的S蛋白同源性最高的病毒，该病毒不感染人，非常安全，可用于2019-nCoV病毒的药物筛选与评价、疫苗筛选与评价、减毒及灭活疫苗的制备。本发明通过xCov筛选出具有明显抑制作用的中药复方，该复方以中医君臣佐使的理论为基础，各组分之间相互配合，达到了极好的使用效果。
所述xCov已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC NO.19295，保藏日期：2020年2月14日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类学命名：冠状病毒。
附图说明
图1为实施例1中中药复方抑制病毒复制有效率的结果图。
具体实施方式
实施例1
本实施例采用的中药复方包括如下重量份的组分：去核的柯子15g、青果10g、锦灯笼 9g、山豆根6g、射干10g、栀子9g、儿茶3g、生麻黄10g。
该中药复方的制备方法包括如下步骤：
①以上药物，分别粉碎成细粉，过7号筛，混匀；
②将混匀的粉末，加入10倍体积的超纯水进行第一次煎煮提取，时间为0.5h，后离心，取上清；
③将经过第一次提取过后的药渣再加入8倍体积的超纯水进行第二次煎煮提取，时间为 0.5h，后离心，取上清；
④将两次提取的上清液进行混合，得到水提液；
⑤将水提液进行旋蒸，将水提液中的水挥发干净，提取出更浓缩的药液，放入器皿(铁饭盒即可)，再放入-80℃冰箱，直至冻成干粉并4℃保存备用。
实施例2
本实施例利用实施例1中制备出的中药复方冻干粉进行病毒抑制试验，其步骤如下：
①取中药复方冻干粉适量并用超纯水进行溶解，配成药物浓度为100mg/ml的药液，过 0.22μm滤膜；
②取步骤①中的药液，按10倍比稀释(即100、10、1、0.1、0.01mg/mL)备用；
③Vero E6细胞在96孔板中培养24h后加入MOI＝10的xCov和不同浓度的药液稀释液，共同处理3天，后检测相关指标。
④Vero细胞收集后使用AxyPrepTM Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit(Axygen, Cat no.AP-MN-BF-VNA-250)and AxyPrepTM Multisource Total RNA MiniprepKit(Axygene, Cat no.AP-MN-MS-RNA-250G)提取病毒RNA。
⑤使用Hifair II 1st Strand cDNA synthesis Kit进行RNA反转录。参照反转录试剂盒说明，去除RNA中的DNA后，以Oligo(dT)为引物反转录合成cDNA第1链，-20℃保存备用。
⑥以β-Actin基因为内参设计上下游引物，其中上游引物SEQ ID NO.1： 5’-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG-3’,下游引物SEQ ID NO.2：5’-ATCCACATCTGCT GGAAGGTGGAC-3’；同样针对病毒反转录合成的cDNA第1链设计上下游引物，其中上游引物SEQ ID NO.3：5’-GGTGATTGCCTTGGTGATATTG-3’，下游引物SEQ ID NO.4： 5’-GCAAGTAGTGCAGAAGTGTATTG-3’。以上述内参和病毒反转录合成的cDNA为模板分别进行RT-PCR，其反应体系为：2×SYBRPremix Ex TaqTM 10μL，10μmol/L上、下游引物各0.4μL，DNA模板2.0μL(原溶液稀释10倍)，RNase-free H2O补足至总体积20μL。反应程序:95℃预变性10min；95℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环。试验重复3次，反应结束后对Ct值采用2-△△Ct法进行定量分析，并计算该中药复方的抑制病毒复制有效率，结果如图1所示，从图1可以得出，EC50值为0.6615mg/mL，抑制效果明显。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 首都医科大学附属北京中医医院（北京市赵炳南皮肤病医疗研究中心）
<120> 一种用于治疗新型冠状病毒的中药复方
<130> 2020.03.27
<141> 2020-03-30
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
agtgtgacgt ggacatccgc aaag 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
atccacatct gctggaaggt ggac 24
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
ggtgattgcc ttggtgatat tg 22
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
gcaagtagtg cagaagtgta ttg 23

Claims (4)

1.一种治疗新型冠状病毒的中药复方，其特征在于，包括如下重量份的组分：去核的柯子10-20g、青果8-12g、锦灯笼8-10g、山豆根5-7g、射干8-12g、栀子8-10g、儿茶2-4g、生麻黄8-12g。
2.根据权利要求1所述的治疗新型冠状病毒的中药复方，其特征在于，包括如下重量份的组分：去核的柯子15g、青果10g、锦灯笼9g、山豆根6g、射干10g、栀子9g、儿茶3g、生麻黄10g。
3.根据权利要求1或2所述的治疗新型冠状病毒的中药复方，其特征在于，所述中药复方的制备方法如下：
(1)称取中药复方中的各组分，分别粉碎成细粉，混匀；
(2)将混匀的粉末，加入适量的水进行第一次煎煮，后离心，取上清；
(3)将经过第一次提取过后的药渣再加入适量的水进行第二次煎煮，后离心，取上清；
(4)将两次提取的上清液进行混合，即得到中药复方的水提液。
4.权利要求1或2所述的中药复方在制备或者治疗2019-nCoV感染的药物中的应用。
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