CN111297878A - 竹节参中的降糖活性成分和降糖组合物及其应用 - Google Patents

竹节参中的降糖活性成分和降糖组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了竹节参中的降糖活性成分及其降糖组合物和应用。本发明从竹节参中分离得到1～12个合物，并发现其中3号、5～12个化合物具有降糖活性；1～12号合物组合物、及其5～8号合物组合物均具有降糖活性；发现竹节参总皂苷、竹节参药材提取物均具有降糖活性。本发明利用体外、体内降糖实验模型，研究得到竹节参中多种降糖活性成分和降糖优势组合物及其糖尿病肾并发症方面的相关活性及应用。筛选出了副作用小，效果好的降糖中药。

Description

竹节参中的降糖活性成分和降糖组合物及其应用
技术领域
本发明书属于中药技术领域，具体涉及竹节参中的降糖活性成分及其降糖优势组合物和 应用。
背景技术
糖尿病是一种常见病、多发病，随着人们生活水平的提高，糖尿病的发病率在逐年升 高。目前国内常用的口服降糖药物分为促胰岛素分泌剂类、胰岛素增敏剂、α-糖苷酶抑制剂 和高糖损伤修复剂等，如格列本脲、二甲双胍类、阿卡波糖和羟苯磺酸钙等，各类型治疗糖 尿病药物或疗效治疗靶点单一，或毒副作用明显，近年来，在中药中寻找多靶点治疗糖尿病 的药物受到人们的青睐。
本研究拟利用体外、体内降糖实验模型，研究竹节参中多种降糖活性成分和降糖优势组 合物及其糖尿病肾并发症方面的相关活性及应用。
发明内容
本发明的目的在于提供从竹节参药材中分离得到的9种化合物在制备降糖药物或/和用于 修复高糖诱导的肾损伤药物中的应用。
本发明的另一目的在于从竹节参药材中分离得到的12种化合物的组合物在制备降糖药物 或/和用于修复高糖诱导的肾损伤药物中的应用。
本发明的又一目的在于从竹节参药材中分离得到的4种化合物中的至少两种组成的组合 物在制备降糖药物或/和用于修复高糖诱导的肾损伤药物中的应用。
本发明的又一目的在于竹节参总皂苷或竹节参药材在制备降糖药物或/和用于修复高糖 诱导的肾损伤药物中的应用。
本发明的又一目的在于提供一种用于降糖或/和修复高糖诱导的肾损伤的药物组合物。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
从竹节参药材中分离得到的化合物在制备降糖药物或/和用于修复高糖诱导的肾损伤药 物中的应用，所述的化合物为人参皂苷Rg2(Ginsenoside Rg2)、竹节参皂苷V(Chikusetsusaponin V)、伪人参皂苷RT1(Pseudoginsenoside RT1)、竹节参皂苷 IV(Chikusetsusaponin IV)、竹节参皂苷IVa(Chikusetsusaponin IVa)、去28-葡萄糖基竹节参皂 苷IVa(Oleanolic acid 3-O-β-D-glucuronopyranoside)、姜状三七皂苷R1(Zingibroside R1)、龙牙 楤木皂苷VI(Tarasaponin VI)和太白木皂苷I(TaibaienosideI)中的任意一种。
从竹节参药材中分离得到的12种化合物的组合物在制备降糖药物或/和用于修复高糖诱 导的肾损伤药物中的应用，所述的12种化合物为人参皂苷Rg1(Ginsenoside Rg1)、人参皂苷 Re(Ginsenoside Re)、人参皂苷Rg2(Ginsenoside Rg2)、人参皂苷Rb1(Ginsenoside Rb1)、竹节 参皂苷V(Chikusetsusaponin V)、伪人参皂苷RT1(Pseudoginsenoside RT1)、竹节参皂苷IV(Chikusetsusaponin IV)、竹节参皂苷IVa(Chikusetsusaponin IVa)、去28-葡萄糖基竹节参皂 苷IVa(Oleanolic acid 3-O-β-D-glucuronopyranoside)、姜状三七皂苷R1(Zingibroside R1)、龙牙 楤木皂苷VI(Tarasaponin VI)和太白木皂苷I(Taibaienoside I)；
按重量份数计，该组合物中12种化合物的配比为：人参皂苷Rg1(GinsenosideRg1)0.8～1.5份、人参皂苷Re(Ginsenoside Re)0.4～0.85份、人参皂苷Rg2(GinsenosideRg2)0.5～1.0份、人参皂苷Rb1(Ginsenoside Rb1)0.9～1.7份、竹节参皂苷V(Chikusetsusaponin V)20～40份、伪人参皂苷RT1(Pseudoginsenoside RT1)8～17份、竹节参皂苷 IV(Chikusetsusaponin IV)10～22份、竹节参皂苷IVa(ChikusetsusaponinIVa)8～17份、去28-葡 萄糖基竹节参皂苷IVa(Oleanolic acid 3-O-β-D-glucuronopyranoside)1～3.5份、姜状三七皂苷 R1(Zingibroside R1)0.9～2份、龙牙楤木皂苷VI(Tarasaponin VI)0.3～1.2份和太白木皂苷I (Taibaienoside I)0.2～0.8份；优选的该组合物为由所述的12种化合物按其在竹节参总皂苷中 的质量比例组成的模拟竹节参总皂苷。
从竹节参药材中分离得到的4种化合物中的至少两种组成的组合物在制备降糖药物或/ 和用于修复高糖诱导的肾损伤药物中的应用，所述的4种化合物为竹节参皂苷V(Chikusetsusaponin V)、伪人参皂苷RT1(Pseudoginsenoside RT1)和竹节参皂苷 IV(Chikusetsusaponin IV)、竹节参皂苷IVa(Chikusetsusaponin IVa)。作为一种优选技术方案， 该组合物为(Ⅰ)～(Ⅺ)中的任意一种：
(Ⅰ)由质量比为(0.1～3):(0.1～3)的竹节参皂苷V(Chikusetsusaponin V)和伪人参 皂苷RT1(Pseudoginsenoside RT1)组成的组合物；
(Ⅱ)由质量比为(0.1～3):(0.1～3)的竹节参皂苷V(Chikusetsusaponin V)和竹节参 皂苷IV(Chikusetsusaponin IV)组成的组合组合物；
(Ⅲ)由质量比为(0.1～3):(0.1～3)的竹节参皂苷V(Chikusetsusaponin V)和竹节参 皂苷IVa(Chikusetsusaponin IVa)组成的组合物；
(Ⅳ)由质量比为(0.1～3):(0.1～3)的伪人参皂苷RT1(Pseudoginsenoside RT1)和竹 节参皂苷IV(Chikusetsusaponin IV)组成的组合物；
(Ⅴ)由质量比为(0.1～3):(0.1～3)的伪人参皂苷RT1(Pseudoginsenoside RT1)和竹 节参皂苷IVa(Chikusetsusaponin IVa)组成的组合物；
(Ⅵ)由质量比为(0.1～3):(0.1～3)的竹节参皂苷IV(Chikusetsusaponin IV)和竹节参 皂苷IVa(Chikusetsusaponin IVa)组成的组合物；
(Ⅶ)由质量比为(0.1～3):(0.1～3):(0.1～3)的竹节参皂苷V(Chikusetsusaponin V)、伪人参皂苷RT1(Pseudoginsenoside RT1)和竹节参皂苷IV(Chikusetsusaponin IV)组成的组 合物；
(Ⅷ)由质量比为(0.1～3):(0.1～3):(0.1～3)的竹节参皂苷V(Chikusetsusaponin V)、伪人参皂苷RT1(Pseudoginsenoside RT1)和竹节参皂苷IVa(Chikusetsusaponin IVa)组成的 组合物；
(Ⅸ)由质量比为(0.1～3):(0.1～3):(0.1～3)的竹节参皂苷V(Chikusetsusaponin V)、竹节参皂苷IV(Chikusetsusaponin IV)和竹节参皂苷IVa(Chikusetsusaponin IVa)组成的组 合物；
(Ⅹ)由质量比为(0.1～3):(0.1～3):(0.1～3)的伪人参皂苷RT1(Pseudoginsenoside RT1)、竹节参皂苷IV(Chikusetsusaponin IV)和竹节参皂苷IVa(Chikusetsusaponin IVa)组成的组合物；
(Ⅺ)由质量比为(0.1～3):(0.1～3):(0.1～3):(0.1～3)的竹节参皂苷V(Chikusetsusaponin V)、伪人参皂苷RT1(Pseudoginsenoside RT1)、竹节参皂苷 IV(Chikusetsusaponin IV)和竹节参皂苷IVa(Chikusetsusaponin IVa)组成的组合物。
进一步优选的，所述的组合物(Ⅷ)中竹节参皂苷V(Chikusetsusaponin V)、竹节参皂苷 IV(Chikusetsusaponin IV)和竹节参皂苷IVa(Chikusetsusaponin IVa)的质量比优选为(1～2)： 1：1；所述的组合物(Ⅺ)中竹节参皂苷V(Chikusetsusaponin V)、伪人参皂苷RT1 (Pseudoginsenoside RT1)、竹节参皂苷IV(Chikusetsusaponin IV)和竹节参皂苷IVa (Chikusetsusaponin IVa)的质量比优选为(1～2)：1：1：1或者模拟其在竹节参总皂苷中的质 量比例。
竹节参总皂苷或竹节参药材在制备降糖药物或/和用于修复高糖诱导的肾损伤药物中的 应用。
上述的药物为由所述的化合物、组合物、竹节参总皂苷或竹节参药材与药学上可接受的 辅料制成的固体制剂和/或液体制剂。
一种用于降糖或/和修复高糖诱导的肾损伤的药物组合物，该药物组合物中包含竹节参 皂苷V(Chikusetsusaponin V)、伪人参皂苷RT1(Pseudoginsenoside RT1)、竹节参皂苷 IV(Chikusetsusaponin IV)和竹节参皂苷IVa(Chikusetsusaponin IVa)中的至少两种。
一种用于降糖或/和修复高糖诱导的肾损伤的药物组合物，该药物组合物中包含人参皂 苷Rg1(Ginsenoside Rg1)、人参皂苷Re(Ginsenoside Re)、人参皂苷Rg2(Ginsenoside Rg2)、人 参皂苷Rb1(Ginsenoside Rb1)、竹节参皂苷V(ChikusetsusaponinV)、伪人参皂苷RT1 (Pseudoginsenoside RT1)、竹节参皂苷IV(Chikusetsusaponin IV)、竹节参皂苷IVa (Chikusetsusaponin IVa)、去28-葡萄糖基竹节参皂苷IVa(Oleanolicacid 3-O-β-D- glucuronopyranoside)、姜状三七皂苷R1(Zingibroside R1)、龙牙楤木皂苷VI(Tarasaponin VI) 和太白木皂苷I(Taibaienoside I)。
本发明的研究目的：研究竹节参中3号、5～12号单体化合物的降糖作用；研究发现具有 优势降糖作用各化合物组合物，使组合物避免拮抗或相减作用，产生协同或加合作用。
本发明的研究方法：采用HepG2细胞胰岛素抵抗模型，以葡萄糖消耗量为指标，考察药 物增加胰岛素敏感性的活性作用。采用高糖诱导的HUVEC损伤细胞模型，以细胞活力、NO 的分泌为指标，考察药物对糖尿病微血管内皮系统损伤的修复作用。采用RIN-M5F细胞模 型，以胰岛素分泌为指标，考察药物促进胰岛素分泌量的活性作用。采用体外酶活性试验， 考察药物对α-葡萄糖苷酶的抑制剂活性。采用II型糖尿病大鼠实验模型，以空腹血糖值 (FBG)、糖基化血红蛋白(HbA1C)含量为指标，考察药物的降糖作用；以24小时尿蛋白、血清中肌酐、尿素氮为指标，考察药物修复糖尿病肾损伤作用。
本发明的研究结果：我们从竹节参中分离得到1～12个合物，并发现这12个化合物均具 有降糖活性，第3号、第5～12号化合物降糖活性为本实验首次发现。
分离得到的1～12号化合物在竹节参总皂苷部位中占80％的质量比(HPLC法测定)，按 1～12号化合物在竹节参总皂苷中的质量比，模拟组成1～12号化合物组合物，该组合物的降 糖活性(P<0.01)优于竹节参总皂苷的降糖活性(P<0.05)，显示竹节参总皂苷中其余 20％的未知成分对1～12号单体化合组成的模拟竹节参总皂苷的降糖作用具有拮抗或者相减 作用，发现1～12号化合物组合物的优势降糖作用具有创新性，故申请专利保护1～12号化合 物组合物的优势降糖活性。
分离得到的5～8号化合物在竹节参总皂苷中占有70％的质量分数比(HPLC法测定)， 按5～8号化合物在竹节参总皂苷中各自占有的质量百分比组成的模拟竹节参总皂苷组合物， 在相同的剂量条件下，该5～8号化合物组合物的降糖活性(P<0.001)优于1～12号化合物 组合物的降糖活性(P<0.01)(详见表3第15号和第13号样品实验结果)，显示1～12号 化合组成的模拟竹节参总皂苷中，存在着降糖作用的拮抗或相减的成分；在相同剂量的条件 下，该5～8号化合物组合物的降糖活性(P<0.001)优于5～8号化合物各自的降糖活性(P< 0.05，P<0.01)(详见表3第15号和第1～12号实验样品的实验结果)，显示5～8号化合物组合物存在着降糖活性的协同或加合作用；5～8号化合物组合物的优势降糖活性(P<0.001)具有独特性，当我们在该组合中加入具有降糖优势(P<0.01)单体化合物Oleanolicacid 3-O-β-D-glucuronopy-ranoside后，降糖活性作用不升反降(详见表3第15号和第28号 样品实验结果)。5～8号化合物组合物避免了1～12号化合物组合物在降糖活性中的拮抗或 相减作用，5～8号化合物组合物产生了降糖活性的协同或加合作用，发现5～8号化合物组合 物的优势降糖活性具有重要创新性。故申请专利保护5～8号化合物组合物的降糖活性。
5～8号化合物组合物是Chikusetsusaponin V、Pseudoginsenoside RT1、Chikuse-tsusaponin IV与Chikusetsusaponin IVa的组合，可以是它们质量比为0～3的任意组合(5～8 号化合物中的三种或四种化合物的含量不能同时为0)，但不限于该比例范围的组合，最佳 质量比例组合为Chikusetsusaponin V：Pseu-doginsenoside RT1：Chikusetsusaponin IV： Chikusetsusaponin IVa＝2:1:1:1及1:1:1:1(详见第25号、26号样品和16～24号、27号样品实 验结果)。
5～8号化合物组合物，质量比为Chikusetsusaponin V：Pseudoginsenoside RT1：Chikusetsusaponin IV：Chikusetsusaponin IVa＝2:0:1:1及1:0:1:1组合物，具有优势降糖活性， 与模型组比较，两种组合物对葡萄糖消耗量的增加率高达63.3％和61.0％，它们的降糖作用 仅次于二甲双胍(64.0％)、15号(66.8％)、25号(72.4％)和26号(68.0％)，而优于各 单体化合物及其组合物(详见表3第29号、30号和16～24号、25、26、27、31号样品实验 结果)。
竹节参总皂苷(第13号样品)和竹节参药材(第31号样品)均具有降糖的显著活性(P<0.05)。
第5号样品组(Chikusetsusaponin V)、第25号样品组(Chikusetsusaponin V：Pseudoginsenoside RT1：Chikusetsusaponin IV：Chikusetsusaponin IVa＝2:1:1:1组合物)、竹节 参总皂苷和竹节参药材各样品均具有显著性或极显著性降低糖尿病模型大鼠血糖、修复高糖 诱导的肾损伤活性。
本发明的竹节参药材、竹节参总皂苷或竹节参总皂苷中的单体化合物或其优势组合物可 分别与医学上可接受的各种辅料制成的固体制剂和/或液体制剂，具有降糖作用。
本发明的研究结论：
1.竹节参中的第3号、5～12号化合物(Ginsenoside Rg2、Chikusetsusaponin V、Pseudoginsenoside RT1、Chikusetsusaponin IV、Chikusetsusaponin IVa、Oleanolicacid 3-O-D- glucuronopyranoside、Zingibroside R1、Tarasaponin VI、TaibaienosideI)具有降糖活性。
2.模拟竹节参总皂苷的1～12号化合物组合物的降糖活性(P<0.01)优于竹节参总皂苷 的降糖活性(P<0.05)，显示竹节参总皂苷中其余20％的未知成分对1～12号化合物组成的 模拟竹节参总皂苷的降糖作用具有拮抗或者相减作用，发现1～12号化合物组合物的优势降 糖作用具有创新性。
3.模拟竹节参总皂苷的5～8号化合物组合物的降糖活性(P<0.001)优于1～12号化合 物组合物的降糖活性(P<0.01)，显示1～12号化合物组合物中，存在着降糖作用的拮抗或 相减的成分；在相同剂量的条件下，该5～8号化合物组合物的降糖活性(P<0.001)优于 5～8号化合物各自的降糖活性(P<0.05或P<0.01)，显示5～8号化合物组合物存在着降糖 活性的协同或加合作用；5～8号化合物组合的降糖活性优势(P<0.001)具有独特性，当我 们在该组合物中加入具有降糖优势(P<0.01)的化合物Oleanolic acid 3-O-β-D-glucuronopyranoside后，降糖活性作用不升反降(详见表3第15号和第28号样品实验结果)。5～8号化合物组合物避免了1～12号化合物组合物在降糖活性中的拮抗或相减作用，5～8号化合物组合物产生了降糖活性的协同或加合作用，发现5～8号化合物组合物的优势降 糖活性具有重要创新性。
4.非模拟竹节参总皂苷的5～8号化合物组合物中Chikusetsusaponin V、Pseudoginsenoside RT1、Chikusetsusaponin IV与Chikusetsusaponin IVa的组合，可以是它们质 量比为0～3的任意组合(5～8号化合物中的三种或四种化合物的含量不能同时为0)，最佳 降糖活性质量比例组合为Chikusetsusaponin V：Pseudoginsenoside RT1：Chikusetsusaponin IV：Chikusetsusaponin IVa＝2:1:1:1及1:1:1:1。
5.在非模拟竹节参总皂苷5～8号化合物组合中，质量比为Chikusetsusaponin V：Pseudoginsenoside RT1：Chikusetsusaponin IV：Chikusetsusaponin IVa＝2:0:1:1及1:0:1:1组合 物具有降糖优势，它们对葡萄糖消耗量的增加率高达63.3％和61.0％，它们的降糖作用仅次 于二甲双胍组、模拟竹节参总皂苷5～8号化合物组合物组(15号)、非模拟竹节参总皂苷 5～8号化合物组合物两组(25号、26号)(上述四组对葡萄糖消耗量的增加率分别为 64.0％、66.8％、72.4％和68.0％)。
6.竹节参总皂苷(第13号样品)和竹节参药材(第31号样品)均具有降糖的显著活性(P<0.05)。
7.从竹节参中分离得到的1～12号化合物、模拟竹节参总皂苷1～12号化合物组合物、模 拟竹节参总皂苷5～8号化合物组合物、非模拟竹节参总皂苷5～8号化合物组合物、非模拟竹 节参总皂苷5～7～8号化合物组合物、竹节参总皂苷和竹节参药材各样品均具有显著性或极显 著性修复高糖诱导的肾损伤活性。
本发明的有益效果：
本发明利用体外、体内降糖实验模型，研究得到竹节参中多种降糖活性成分和降糖优势 组合物及其糖尿病肾并发症方面的相关活性及应用。筛选出了副作用小，效果好的降糖中 药。
附图说明
图1大鼠胰岛素ELISA试剂盒标准曲线。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施 例，对本发明进行进一步详细说明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到或采用已公开 的方法获得。
在“竹节参中多种降糖活性成分和降糖优势组合物及其应用”研究中，涉及以下实验材 料。
1.实验材料和各种实验样品液的配制
1.1实验动物
SD大鼠，雄性，180-220g，88只。
1.2细胞株
人脐静脉内皮细胞(HU-VEC-C)，来源ATCC，中国药科大学国家新药筛选中心惠赠；RIN-M5F大鼠胰岛素瘤细胞，来源ATCC，购自上海行研科技有限公司；肝癌细胞 (HepG2)，来源ATCC，中国药科大学国家新药筛选中心惠赠。
1.3药品试剂
高糖DMEM培养基(批号：914292，Gibco公司)；低糖DMEM培养基(批号： 914292，Gibco公司)；D-葡萄糖(Amresco,USA)；D-甘露醇(Sigma公司)；α-葡萄糖苷酶 (日本TCI，批号:120527)；4-硝基酚-α-D吡喃葡萄糖苷(alfa aesar，批号：110906)；磷酸二 氢钾(南京化学试剂有限公司)；氢氧化钠(南京化学试剂有限公司)；氯化钠(南京化学试 剂有限公司)；无水碳酸钠(南京化学试剂有限公司)。胰蛋白酶(Amresco,USA)；胎牛血清 (赛默飞世尔公司)；MTT(Ameresco，批号：M21128)；冻存用DMSO(Solarbio)；DMSO (南京化学试剂有限公司)；HEPES缓冲盐(sunshine)；青霉素(Solarbio)；链霉素 (Solarbio)；NaHCO3(南京化学试剂有限公司)；Na2HPO4·12H2O(批号：090902，上海凌峰 化学试剂有限公司)；KH2PO4(批号：090922，上海凌峰化学试剂有限公司)；NaCl(批号： 09060310494，南京化学试剂有限公司)；KCl(批号：060960239，南京化学试剂有限公 司)；纯净水(娃哈哈公司)；硝酸还原酶法NO试剂盒(批号：20120508，南京建成生物工 程研究所)；大鼠胰岛素ELISA试剂盒(南京迪兆生物科技有限公司)；胰岛素注射液(江苏 万邦生化医药股份有限公司，批号：1106211)；葡萄糖测定试剂盒(批号：，南京建成生物 工程研究所)；尿链佐菌素(STZ，sigma；批号：S-0130)；柠檬酸(南京化学试剂有限公 司，批号：1209116)；二水合柠檬酸三钠(南京化学试剂有限公司，批号：1209133)；消渴 丸(广州白云山中一药业有限公司，批号：R01252)；阿卡波糖片(拜耳医药保健有限公 司，批号：117893)；格列本脲(天津太平洋制药有限公司)；盐酸二甲双胍(北京京丰药业 有限公司，批号：121155)；羟苯磺酸钙(利君制药有限公司，批号：1202023)；竹节参总 皂苷部位(实验室自制，得率也为7g总皂苷/100g竹节参药材，经HPLC测定：其中有4个 成分的含量约占70％，另外已知8个成分含量约为10％，已知成分的总含量约为80％，批 号：20121020)，Ginsenoside Rg1(中国药品生物制品鉴定所，HPLC纯度≥98％，批号： 703-9307)、Ginsenoside Re(中国药品生物制品鉴定所，HPLC纯度＝88.8％，批号： 110754-200822)、Ginsenoside Rg2(上海生物科技有限公司，HPLC纯度≥98％，批号： A0238)、Ginsenoside Rb1(中国药品生物制品鉴定所，HPLC纯度＝92.6％，批号：110704- 200921)；Chikusetsusaponin V、Pseudoginsenoside RT1、Chikusetsusaponin IV、 Chikusetsusaponin IVa、Oleanolic acid 3-O-β-D-glucuronopyranoside、Zingibroside R1、 Tarasaponin VI、Taibaienoside I(实验室自制，面积归一化法测定HPLC纯度分别为：≥98％、 ≥98％、≥98％、≥98％、91.6％、89.6％、93.4％、90.3％)等。
1.4仪器设备
BSA124S型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；OneTouch UltraEasy型血糖仪及配 套试纸(强生医疗器材有限公司)；酸度计(赛多利斯科学仪器有限公司)等。RT-6000酶标 仪(深圳雷杜生命科技有限公司)，BS124S万分之一电子天平(Sartorius，USA)，79-1型磁力搅 拌器(深圳国华仪器有限公司)，0412-1离心机(上海医疗器械有限公司)，MH-1型振荡器(海门 市其林贝尔仪器制造有限公司)，微量移液器(Thermo ElectronCorporation，USA)，96孔细胞 培养板(Thermo Fisher Scientific)，B260恒温水浴锅(上海亚荣生化仪器厂)，温度计，容量 瓶等。
1.5阳性对照药的选择及及各种实验样品液的配制
本次试验选用羟苯磺酸钙作为治疗DN的阳性对照药之一，是一种改善微循环障碍的药 物。选择格列本脲作为促胰岛素分泌的阳性对照药。选择二甲双胍作为胰岛素曾敏的阳性对 照药。选择阿卡波糖为葡萄糖苷酶的抑制剂的阳性对照药。选择消渴丸为中药降糖的阳性对 照药。
1.5.1体外实验各样品溶液的配制
(1).羟苯磺酸钙溶液的配制：称取1.08mg卡托普利药粉(每粒羟苯磺酸钙胶囊标示量为 500mg，胶囊内容物重量为621mg，每1mg胶囊内容物相当于羟苯磺酸钙0.805mg)，加入 20μL DMSO溶解，再加入1980μL培养基，过滤，即得到0.435mg/mL的羟苯磺酸钙溶液。
(2).格列本脲溶液的配制：取5mg格列本脲药粉(格列本脲的规格为2.5mg，片重为25mg，即1mg药粉含格列本脲0.1mg)，加入200μL DMSO溶解，再加入1800μL培养基即得 到0.25mg/mL的格列本脲溶液，取上述溶液200μL，再加入1800μL培养基，过滤，即得到0.025mg/mL的药液。
(3).二甲双胍样品的配制：十万分之一天平称取5.06mg盐酸二甲双胍粉末(二甲双胍的 规格为0.25g，片重为0.316g，即1mg药粉含格列本脲0.791mg)于10mL容量瓶中，加1640 培养液溶解并定容至10mL，于超净台中用0.22μL微孔滤膜过滤除菌，即得浓度为 400μg/mL的盐酸二甲双胍溶液。
(4).磷酸盐缓冲液(PBS)的配制(pH＝6.8，0.1M)：精密称取1.3613g磷酸二氢钾，加 水定容到50ml，配制0.2mol/L的磷酸二氢钾溶液。精密称取0.4003g氢氧化钠，加水定容到50ml，配制0.2mol/L氢氧化钠溶液。取0.2mol/L的磷酸二氢钾50ml，加入0.2mol/L氢氧化钠溶液23.6ml，再加入0.8506g氯化钠，加纯净水定容到100ml，即得到pH＝6.8浓度为0.1M的磷酸盐缓冲液。
(5).α-糖苷酶溶液的配制(10mg/mL)：精密称取100.3mgα-糖苷酶于10mL容量瓶中， 加入PBS定容到10ml，搅拌2h，3800rpm离心15min，取上清液得到10mg/ml酶溶液。
(6).不同浓度PNPG底物溶液的配制：精密称取60.68mg PNPG于10mL容量瓶中，加入 PBS定容到10ml，漩涡至溶解，得到20mmol/L的PNPG溶液。倍半稀释，制备浓度分别为10、5、2.5mmol/L的PNPG底物溶液。
(7).碳酸钠溶液的配制(0.3mol/L)：精密称取无水碳酸钠1.5913g于50mL容量瓶中， 加水定容到50ml，得到0.3mol/L的碳酸钠溶液。
(8).阿卡波糖溶液的配制(1mg/ml)：已知阿卡波糖片重125mg，其中含有阿卡波糖50mg，取一片阿卡波糖，研磨，精密称取12.7mg(含有阿卡波糖5mg)药物粉末，加水定 容到5ml，3800rpm离心15min，取上清液得到1mg/ml的阿卡波糖溶液。
(9).1-12号各单体化合物给药溶液的配制：精密称取Ginsenoside Rg1、Ginsenoside Re、Ginsenoside Rg2、Ginsenoside Rb1、Chikusetsusaponin V、Pseudoginsenoside RT1、 Chikusetsusaponin IV、Chikusetsusaponin IVa、Oleanolicacid 3-O-β-D-glucuronopyranoside、 Zingibroside R1、Tarasaponin VI、Taibaienoside I(依次编号为1-12号)单体化合物各适量， 各加1％FBS高糖DMEM培养基溶解，得浓度为250μg/mL的各成分溶液。它们分别称为第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12号样品液。
(10).竹节参总皂苷部位给药溶液的配制：验室前期研究已筛选出竹节参总皂苷部位的 最佳作用浓度为250μg/ml，因此称取5mg竹节参总皂苷部位，加10ml 1％FBS高糖DMEM 培养基溶解，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得500μg/ml的竹节参总皂苷部位溶液，加药时 稀释至250μg/ml。称为第13号样品液。
(11).1-12号化合物组合物给药溶液的配制：采用外标法计算得竹节参总皂苷部位中1- 12号化合物的百分含量分别为：1.11％、0.61％、0.78％、1.29％、30.64％、12.12％、 16.59％、12.46％、2.16％、1.40％、0.76％、0.53％。由于实验室前期研究工作已筛选出竹节参 总皂苷部位的最佳作用浓度为250μg/ml，则根据竹节参总皂苷部位相关物质的百分含量数 据，模拟竹节参总皂苷部位样品中1-12号各相关物质与主成分的理论配制浓度应依次为： 2.775、1.525、1.95、3.225、76.575、30.325、41.425、31.175、5.4、3.5、1.9、 1.325μg/ml。
表1.1-12号化合物模拟总皂苷部位的理论浓度与实际浓度
Figure BDA0002356766730000091
1-12号化合物模拟总皂苷部位给药液的配制方法为：按“表1”的称样量，用十万分之一 电子天平，精密称取1、2、3、4、9、10、11、12号8个相关物质单体质量分别为： 1.40mg、0.75mg、1.00mg、1.60mg、2.70mg、1.75mg、0.95mg、0.65mg于离心管(标号：1 号)，加1％FBS高糖DMEM培养基10ml溶解；然后称取5、6、7、8号4个主成分单体分 别为3.85mg、1.50mg、2.05mg、1.55mg于离心管(标号：2号)，先加1号离心管中的8个相关物质混合物溶液1ml，再加1％FBS高糖DMEM培养基9ml溶解，即得相关物质 与主成分浓度相当于竹节参总皂苷部位中各单体浓度5倍的溶液；加药时再稀释5倍， 即得相当于总皂苷部位250μg/ml浓度的1-12号化合物模拟总皂苷部位给药溶液。称为第 14号样品液。
(12).5-8号化合物组合物给药溶液的配制：按表1中5、6、7、8号成分的称样量与稀释倍数进行称量与稀释，即用十万分之一电子天平分别精密称取5、6、7、8号4个成分单 体为3.85mg、1.50mg、2.05mg、1.55mg于离心管，加1％FBS高糖DMEM培养基10ml溶 解，即得各成分浓度相当于竹节参总皂苷部位中各主成分浓度5倍的溶液，加药时再稀释5 倍，即得相当于总皂苷部位250μg/ml浓度的5-8号化合物模拟总皂苷部位给药溶液。称为 第15号样品液。
(13).非物模拟总皂苷部位5-8号化合物组合物(15种组合物)样品给药溶液的配制： 5-8号化合物分别为Chikusetsusaponin V、Pseudoginsenoside RT1、Chikusetsusaponin IV 和Chikusetsusaponin IVa，它们分别简称为：V、RT1、IV和IVa。每份样品中V、RT1、 IV、IVa的比例关系如下。将15份样品分别置于离心管，加1％FBS高糖DMEM培养基 10ml溶解，即得“非物模拟总皂苷部位5-8号化合物组合物的多重组合物(15种组合物) 给药溶液”。该15份样品液的浓度相当于总皂苷部位250μg/ml浓度，分别称为第16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30号组合样品液。
(1).V 3份(3.837)、RT1 1份(1.279)、IV 0份、IVa 3份(3.837)；
(2).V 1份(1.279)、RT1 0份、IV 3份(3.837)、IVa 3份(3.837)；
(3).V 0份、RT1 3份(3.837)、IV 1份(1.279)、IVa 3份(3.837)；
(4).V 3份(5.37)、RT1 1份(1.79)、IV 0份、IVa 1份(1.79)；
(5).V 1份(1.79)、RT1 0份、IV 3份(5.37)、IVa 1份(1.79)；
(6).V 0份、RT1 3份(5.37)、IV 1份(1.79)、IVa 1份(1.79)；
(7).V 3份(6.714)、RT1 1份(2.238)、IV 0份、IVa 0份；
(8).V 1份(2.238)、RT1 0份、IV 3份(6.714)、IVa 0份；
(9).V 0份、RT1 3份(6.714)、IV 1份(2.238)、IVa 0份；
(10).V 2份(3.581)、RT1 1份(1.79)、IV 1份(1.79)、Iva 1份(1.79)；
(11).V 1份(2.238)、RT1 1份(2.238)、IV 1份(2.238)、IVa 1份(2.238)；
(12).V 1份(2.984)、RT1 1份(2.984)、IV 1份(2.984)、IVa 0份；
(13).V 2份(2.984)、RT1 1份(1.492)、IV 1份(1.492)、IVa1份(1.492)、Oleanolic acid 3-O-β-D-glucuronopyranoside 1份(1.492)。
(14).V 2份(4.476)、RT1 0份、IV 1份(2.238)、Iva 1份(2.238)
(15).V 1份(2.984)、RT1 0份、IV 1份(2.984)、Iva 1份(2.984)
(15).竹节参药材给药溶液的配制：按竹节参总皂苷得率约为7g/100g竹节参药材计 算，取竹节参药材粗粉71.42g，用乙醇回流提取3次，分别提取2、1.5、1小时，合并3次 提取液，减压回收乙醇至无醇味，用纯水定容至1000mL，精密量取1mL(相当于称取5mg 竹节参总皂苷部位)，加10ml 1％FBS高糖DMEM培养基溶解，0.22μm微孔滤膜过滤除菌， 即得500μg/ml的竹节参总皂苷部位溶液，加药时稀释至250μg/ml。称为第31号样品液。
1.5.2体内实验各样品溶液的配制
(1).二甲双胍组体内试验供试药液的配制：取研为细粉的盐酸二甲双胍片22片(相当 于盐酸二甲双胍5.4g)，溶解于600mL 0.4％CMC-Na水溶液(W/V，g/100ml)中，超声，得 到浓度为9mg/mL二甲双胍供试样品液。给药剂量为0.18g/kg。
(2).二甲双胍联合羟苯磺酸钙组体内试验供试药液的配制：
羟苯磺酸钙说明书规定成人一般每日用量1.5g。按体表面积法换算，则大鼠给药剂量 为：1.5g×0.021÷0.2＝0.1575g/kg。本实验按0.15g/kg给药。大鼠给药体积为20mL/kg，羟苯 磺酸钙药液的浓度为：0.15g/mL÷20mL/kg＝7.5mg/mL。
二甲双胍联合羟苯磺酸钙组大鼠每日灌胃给予浓度为9mg/mL的盐酸二甲双胍，给药剂 量为0.18g/kg。同时给与浓度为7.5mg/mL的羟苯磺酸钙混悬液，给药剂量为0.15g/kg。
(3).消渴丸体内试验供试药液的配制：称取研为细粉的消渴丸24g，溶解于600mL0.4％CMC-Na水溶液中，超声，得到浓度为40mg/mL消渴丸供试样品液，给药剂量为0.8g/kg。
(4).竹节参总皂苷部位高、中、低剂量组体内试验供试药液的配制：低剂量为0.075g/kg，中剂量为0.15g/kg，高剂量为0.3g/kg。取竹节参总皂苷部位7.5g，以0.4％CMC-Na水溶液定容至500mL，得到浓度为15mg/mL竹节参总皂苷部位高剂量组供试样品液；取 竹节参总皂苷部位3.75g，以0.4％CMC-Na水溶液定容至500mL，得到浓度为7.5mg/mL竹 节参总皂苷部位药液中剂量组供试样品液；取竹节参总皂苷部位1.875g，以0.4％CMC-Na水 溶液定容至500mL，得到浓度为3.75mg/mL竹节参总皂苷部位药液低剂量组供试样品液。
(5).第31号样品(竹节参药材)给药溶液的配制：给药剂量约为2.2g/kg。按竹节参总 皂苷得率约为7g/100g竹节参药材计算，取竹节参药材粗粉53.57g(相当于竹节参总皂苷 3.75g)，用乙醇回流提取3次，分别提取2、1.5、1小时，合并3次提取液，减压回收乙醇 至无醇味，用0.4％CMC-Na水溶液定容至500mL，得到浓度约为0.11g竹节参药材/mL(相 当于7.5mg/mL竹节参总皂苷部位的中剂量浓度)样品液，称为第31号样品液。
(6).第5号样品(Chikusetsusaponin V)给药溶液的配制：给药剂量为0.15g/kg。取 Chikusetsusaponin V样品3.75g，以0.4％CMC-Na水溶液定容至500mL，得到浓度为7.5mg/mL的Chikusetsusaponin V样品供试样品液，称为第5号样品液。
(7).第25号样品(V 2份、RT1 1份、IV 1份、IVa 1份组合)给药溶液的配制：给药剂量为0.15g/kg。取Chikusetsusaponin V样品、Pseudoginsenoside RT1、Chikusetsusaponin IV 和Chikusetsusaponin IVa各适量，按V(2)：RT1(1)：IV(1)：IVa(1)＝3.75g(即V 为1.5g，RT1为0.75g，IV为0.75g，IVa为0.75g，共计3.75g)，以0.4％CMC-Na水溶液定 容至500mL，得到浓度为7.5mg/mL的供试样品液，称为第25号样品液。
1.6各种实验样品(竹节参总皂苷、8种单体化合物竹节参皂苷V(Chikusetsusaponin V)、伪 人参皂苷RT1(Pseudoginsenoside RT1)、竹节参皂苷IV(Chikusetsusaponin IV)、竹节参皂苷 IVa(Chikusetsusaponin IVa)、去28-葡萄糖基竹节参皂苷IVa(Oleanolic acid 3-O-β-D- glucuronopyranoside)、姜状三七皂苷R1(Zingibroside R1)、龙牙楤木皂苷VI(Tarasaponin VI)、太白木皂苷I(TaibaienosideI))的制备：
1.6.1竹节参总皂苷的制备方法(一至五种方法)
方法一：干燥的竹节参药材粉碎成粗颗粒，称取10kg，用70％乙醇回流提取3次，每次2小时，过滤，合并滤液，减压浓缩得到浸膏(取部分干燥，得总提取物1)加水适量混 悬，过滤，上样于D101大孔树脂，从10％、30％、50％、70％、90％乙醇开始梯度洗脱，根 据薄层板TLC显色法监控洗脱液中是否含有竹节参皂苷V、伪人参皂苷RT1、竹节参皂苷 IV、竹节参皂苷IVa，四者任一出现在洗脱液中开始收集，至四者全部从树脂上洗脱完停止 收集，将这部分洗脱液浓缩干燥得竹节参总皂苷1。
方法二：干燥的竹节参药材粉碎成粗颗粒，称取10kg，用90％乙醇浸泡24h，过滤，收集滤液，减压浓缩得到浸膏(取部分干燥，得总提取物2)加水适量混悬，过滤，上样于 LX-38大孔树脂，从10％、30％、50％、70％、90％乙醇开始梯度洗脱，根据薄层板TLC显色 法监控洗脱液中是否含有竹节参皂苷V、伪人参皂苷RT1、竹节参皂苷IV、竹节参皂苷 IVa，四者任一出现在洗脱液中开始收集，至四者全部从树脂上洗脱完停止收集，将这部分 洗脱液浓缩干燥得竹节参总皂苷2。
方法三：干燥的竹节参药材粉碎成粗颗粒，称取10kg，水煮6小时，过滤，收集滤液，减压浓缩得到浸膏(取部分干燥，得总提取物3)加水适量混悬，过滤，上样于LX-38 大孔树脂，从10％、30％、50％、70％、90％乙醇开始梯度洗脱，根据薄层板TLC显色法监控 洗脱液中是否含有竹节参皂苷V、伪人参皂苷RT1、竹节参皂苷IV、竹节参皂苷IVa，四者 任一出现在洗脱液中开始收集，至四者全部从树脂上洗脱完停止收集，将这部分洗脱液浓缩 干燥得竹节参总皂苷3。
方法四：干燥的竹节参药材粉碎成粗颗粒，称取10kg，用70％乙醇回流提取3次，每次2小时，过滤，合并滤液，减压浓缩得到浸膏(取部分干燥，得总提取物4)加水适量混 悬，依次用石油醚、乙酸乙酯、和饱和的正丁醇萃取，正丁醇部位进行正相硅胶柱层析(200-300目)，氯仿-甲醇梯度洗脱(20:1、10:1、5:12:1)，根据薄层板TLC显色法监控洗脱液中是否含有竹节参皂苷V、伪人参皂苷RT1、竹节参皂苷IV、竹节参皂苷IVa，四者任一出现在 洗脱液中开始收集，至四者全部从树脂上洗脱完停止收集，将这部分洗脱液浓缩干燥得竹节参总皂苷4。
方法五：干燥的竹节参药材粉碎成粗颗粒，称取10kg，用70％乙醇回流提取3次，每次2h，过滤，合并滤液，减压回收溶剂得到浸膏(取部分干燥得总提取物5)，加适量水混 悬，依次以石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取。正丁醇部位浸膏进行ODS反相硅胶柱 层析，依次用20％、30％、4 0％、5 0％甲醇水梯度洗脱，根据薄层板TLC显色法监 控洗脱液中是否含有竹节参皂苷V、伪人参皂苷RT1、竹节参皂苷IV、竹节参皂苷IVa，四 者任一出现在洗脱液中开始收集，至四者全部从树脂上洗脱完停止收集，将这部分洗脱液浓 缩干燥得竹节参总皂苷5。
用H PLC-EL SD法测定上述5种不同制备方法制备的总提取物1-5以及富含竹节参皂苷 V、伪人参皂苷RT1、竹节参皂苷IV、竹节参皂苷IVa的竹节参总皂苷1-5，其中的竹节参皂苷V、伪人参皂苷RT1、竹节参皂苷IV、竹节参皂苷IVa总质量百分含量，结果如下表。
表2用H PLC-EL SD法测定5种不同制备方法制备的产物的总质量百分含量
Figure BDA0002356766730000131
1.6.2竹节参中8个单体化合物的制备方法：
竹节参药材中8个单体化合物：竹节参皂苷V(Chikusetsusaponin V)、伪人参皂苷RT1 (Pseudoginsenoside RT1)、竹节参皂苷IV(Chikusetsusaponin IV)、竹节参皂苷IVa(Chikusetsusaponin IVa)、去28-葡萄糖基竹节参皂苷IVa(Oleanolic acid 3-O-β-D-glucuronopyranoside)、姜状三七皂苷R1(Zingibroside R1)、龙牙楤木皂苷VI(Tarasaponin VI)、太白木皂苷I(Taibaienoside I)的制备方法：取上述竹节参总皂苷提取物，乙醇溶解，采 用ODS制备柱，用制备液相仪，用乙腈-甲醇-水不同比例的溶剂系统洗脱，制备上述8种单 体化合物，它们的纯度分别是：≥98％、≥98％、≥98％、≥98％、91.6％、89.6％、93.4％、 90.3％。
1.6.3竹节参中4个单体化合物的购买：
Ginsenoside Rg1(中国药品生物制品鉴定所，HPLC纯度≥98％)、Ginsenoside Re(中 国药品生物制品鉴定所，HPLC纯度＝88.8％)、Ginsenoside Rg2(上海生物科技有限公司，HPLC纯度≥98％)、Ginsenoside Rb1(中国药品生物制品鉴定所，HPLC纯度＝92.6％)。
实施例一
1.竹节参总皂苷部位对HePG2细胞胰岛素抵抗模型葡萄糖消耗量的影响实验[1]
培养瓶内孵育细胞长至80～90％融合时，倒掉培养基，用PBS清洗2遍；将细胞以0.25％的胰蛋白酶消化约1min，胰酶倒掉，加入含10％血清的培养基终止消化，倒掉培养基，加入新的含10％胎牛血清的培养基，轻轻吹打细胞；进行细胞计数，将细胞稀释至 8×104个/mL，接种于96孔板中，每孔接种200μL，周围每孔加入200μLD-Hank's溶液。将接 种细胞后96孔板置于5％CO2、37℃恒温培养箱中培养，待细胞生长至80-90％融合时，吸出 培养液，将细胞分为：(1)空白组180μL高糖DMEM和20μL 10％BSA的PBS溶液；(2)模 型组：180μL高糖DMEM和20μL1mmol/L棕榈酸并含10％BSA的PBS诱导液；(3)阳性对照 组：高糖DMEM，诱导液和150μL盐酸二甲双胍药液；(4)组方给药组：高糖DMEM，诱导 液和不同药液(药液终浓度为0.25mg/mL)。各组细胞加高糖DMEM培养液和药液孵育 30min后再加诱导液，诱导20h后，将含药培养液取出，每孔加入新鲜的含10-9mol/L胰岛 素并含1％FBS的低糖培养基200μL，继续培养12h，然后每孔吸取20μl培养液于1.5mLEP管 中，备用。向盛有待测培养的Ep管中加入1000μL的葡萄糖浓度测定工作液，充分混匀，置 于37℃水浴15min。显色后，在波长492nm处，测定各样品的吸光值。按照如下公式计算 葡萄糖含量：葡萄糖(mmol/L)＝样本管吸光度÷校准管吸光度×标准液浓度。并按照如下公式 计算葡萄糖消耗量：葡萄糖消耗量(mmol/L)＝C培养液0h×V培养液0h－C培养液20h×V培 养液20h。
各样品对HePG2细胞胰岛素抵抗模型葡萄糖消耗量的影响实验结果，按照如下公式计 算：
Figure RE-GDA0002483265770000141
表3各样品对HePG2胰岛素抵抗模型葡萄糖消耗量的影响作用研究结果
Figure BDA0002356766730000142
Figure BDA0002356766730000143
Figure BDA0002356766730000151
注：与空白组比较，###P<0.001；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
1.竹节参中的第3号、5～12号化合物(Ginsenoside Rg2、Chikusetsusaponin V、Pseudoginsenoside RT1、Chikusetsusaponin IV、Chikusetsusaponin IVa、Oleanolicacid 3-O-D- glucuronopyranoside、Zingibroside R1、Tarasaponin VI、TaibaienosideI)具有降糖的确切活 性。
2.模拟竹节参总皂苷的1～12号化合物组合物的降糖活性(P<0.01)优于竹节参总皂苷 的降糖活性(P<0.05)，显示竹节参总皂苷中其余20％的未知成分对1～12号化合物组成的 模拟竹节参总皂苷的降糖作用具有拮抗或者相减作用，发现1～12号化合物组合物的优势降 糖作用具有创新性。
3.模拟竹节参总皂苷的5～8号化合物组成的降糖活性(P<0.001)优于1～12号化合物 组合物的降糖活性(P<0.01)，显示1～12号化合物组合物中，存在着降糖作用的拮抗或相 减的成分；在相同剂量的条件下，该5～8号化合物组合物的降糖活性(P<0.001)优于5～8 号化合物各自的降糖活性(P<0.05)，显示5～8号化合物组合物存在着降糖活性的协同或 加合作用；5～8号化合物组合的降糖活性优势(P<0.001)具有独特性，当我们在该组合物 中加入具有降糖优势(P<0.01)的化合物Oleanolic acid 3-O-β-D-glucuronopyranoside后，降 糖活性作用不升反降(详见表3第15号和第28号样品实验结果)。5～8号化合物组合物避 免了1～12号化合物组合物在降糖活性中的拮抗或相减作用，5～8号化合物组合物产生了降 糖活性的协同或加合作用，发现5～8号化合物组合物的优势降糖活性具有重要创新性。
4.非模拟竹节参总皂苷的5～8号化合物组合物中Chikusetsusaponin V、Pseudoginsenoside RT1、Chikusetsusaponin IV与Chikusetsusaponin IVa的组合，可以是它们质 量比为0～3的任意组合(5～8号化合物中的三种或四种化合物的含量不能同时为0)，最佳 质量比例组合为Chikusetsusaponin V：Pseudoginsenoside RT1：Chikusetsusaponin IV： Chikusetsusaponin IVa＝2:1:1:1及1:1:1:1。
5.在非模拟竹节参总皂苷5～8号化合物组合中，又有一组降糖优势质量比为Chikusetsusaponin V：Pseudoginsenoside RT1：Chikusetsusaponin IV：Chikusetsu -saponin IVa＝2:0:1:1及1:0:1:1组合物，它们与模型组比较，对葡萄糖消耗量的增加率高达 63.3％和61.0％，它们的降糖作用仅次于二甲双胍组、模拟竹节参总皂苷5～8号化合物组合 物组(15号)、非模拟竹节参总皂苷5～8号化合物组合物两组(25号、26号)的对葡萄糖消耗量的增加率64.0％、66.8％、72.4％和68.0％。
6.竹节参总皂苷(第13号样品)和竹节参药材(第31号样品)均具有降糖的显著活性(P<0.05)。
实施例二
2.竹节参总皂苷部位对高糖诱导的HUVEC损伤模型的细胞活力与NO分泌量的影响实验[2-6]
培养瓶内孵育细胞长至90％融合时，倒掉培养基，用PBS清洗2遍；将细胞以0.25％的 胰蛋白酶消化约1min，胰酶倒掉，加入含10％血清(w/v，g/100ml)的培养基终止消化，倒掉培 养基，加入新的含10％胎牛血清(w/v)的培养基4mL，轻轻吹打细胞；进行细胞计数，将细胞 稀释至3×104个/mL，接种于96孔板中，每孔接种200μL。
将96孔板置于5％CO2、37℃恒温培养箱中培养，待细胞生长至90％融合时，换用含1％胎牛血清的低糖DMEM培养基培养24h使细胞同步化。将细胞分为空白对照组、模型对 照组和给药组(每组6个复孔，在2块96孔板上进行)：空白对照组，含1％FBS的低糖 DMEM培养基培养；模型对照组，用葡萄糖浓度为33mmol/L的并含有1％FBS的DMEM培 养基培养；给药组，用葡萄糖浓度为33mmol/L的并含有1％FBS的DMEM培养基培养的同 时给予不同药液(药液终浓度为0.25mg/mL)。培养72h后，将含药培养液取出，每孔加入 新鲜的培养基200μL，再加入20μL 5mg/mL的MTT，继续培养4h，然后将孔内液体吸除， 每孔中加入200μL DMSO并振摇10min，于492nm下检测每孔的吸光值，以吸光值表示细胞 活力大小。
各样品对高糖诱导的HUVEC损伤模型的细胞活力的影响结果详见下表。细胞的活力用 OD值表示，并按照如下公式计算组方对高糖诱导的HUVEC损伤模型的细胞活力的影响。
Figure RE-GDA0002483265770000161
表4各样品对高糖诱导的HUVEC损伤模型的细胞活力的影响实验结果
Figure BDA0002356766730000162
Figure BDA0002356766730000163
Figure BDA0002356766730000171
注：与空白组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。
实验结果显示，羟苯磺酸钙组、二甲双胍+羟苯磺酸钙联合组、第5号样品(Chikusetsusaponin V)组、第13号样品(竹节参总皂苷)组、第25号样品(V：RT1： IV：IVa＝2:1:1:1)和第29号样品(竹节参药材)均对高糖诱导的内皮细胞活力降低有极显著 性抑制作用或显著抑制作用(P<0.01，P<0.05)，而二甲双胍对内皮细胞的活力影响不显 著。
按照上述方法接板，给药。给药后细胞培养72h后(36h时换液1次)，将培养液取出，4000rpm离心10min，取上清液，按照试剂盒要求，于570nm测吸光值，按照如下公式 计算NO含量。
Figure RE-GDA0002483265770000172
表5各样品对高糖诱导的HUVEC损伤模型的NO分泌的影响
Figure BDA0002356766730000173
Figure BDA0002356766730000174
注：与空白组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。
实验结果显示，羟苯磺酸钙组、二甲双胍+羟苯磺酸钙联合组、第5号样品(Chikusetsusaponin V)组、第13号样品(竹节参总皂苷)组、第25号样品(V：RT1：IV： IVa＝2:1:1:1)和第29号样品(竹节参药材)均能够显著性或极显著性增加高糖诱导的受损细 胞NO的分泌(P<0.01，P<0.05)，而二甲双胍则影响不显著。
实施例三
3.竹节参总皂苷部位对RIN-M5F细胞胰岛素分泌的影响实验[7]
RIN-M5F细胞培养至约80～90％融合时，去除培养基，用PBS液清洗2遍；将细胞以0.25％的胰蛋白酶溶液消化约8min，去除胰酶，加入含10％血清的培养基终止消化，去除培养基，加入新的含10％胎牛血清的培养基并吹打细胞至均匀，将细胞稀释至1×105个/mL，接种于96孔板中，每孔接种200μL，将96孔板置于5％CO2、37℃恒温培养箱中培养24h， 将细胞分为空白组和样品组，每组分别为6个复孔。空白对照组加入含10％FBS的高糖 DMEM培养基180μL和不含血清的高糖DMEM培养基20μL；阳性药组加入含10％FBS的高 糖DMEM培养基180μL和0.025mg/mL格列本脲溶液20μL；给药组加入含10％FBS的高糖 DMEM培养基180μL和浓度为250μg/mL竹节参总皂苷部位样品液20μL。上述给药后细胞培 养48h后，将板中培养液吸出，-20℃冷冻备用。将每组6个孔培养液合并，再分为3份样 品，按照试剂盒说明书的要求，在450nm处检测各孔的OD值。根据试剂盒提供的标准品浓 度及其吸光值计算标准曲线，根据标准曲线计算每孔胰岛素含量。
按照大鼠胰岛素ELISA试剂盒说明书对各组细胞胰岛素含量进行测定：①将样品室温下 解冻，3000rpm离心10min，取上清，待用；②将胰岛素测定试剂盒取出，室温平衡20min，取出所需板条；③设置标准孔和样品孔，标准孔加入不同浓度的标准品50μL；④ 待测样品孔加入样品10μL，再加样品稀释液40μL；空白孔不加；⑤除空白孔外，标准孔和 样品孔每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃恒温孵 育60min；⑥每孔加入底物A、B各50μL，37℃恒温孵育15min；⑦每孔加入终止液50μL， 15min内，在450nm处检测各孔的OD值。
Figure RE-GDA0002483265770000181
根据试剂盒提供的标准品浓度及测定的吸光度值建立标准曲线为：y(OD450nm)＝0.0342C胰岛素+0.0812，R2＝0.9914，线性关系良好。所绘制的标准曲线见图1。利用标准曲线计算样品 中胰岛素的浓度，求出胰岛素的分泌量，在求出药物对RIN-M5F细胞胰岛素分泌的增加率测 定结果，详见下表。计量数据以均数±标准差
Figure BDA0002356766730000182
表示，用方差分析进行显著性分析。
表6各样品对RIN细胞胰岛素分泌的影响
Figure BDA0002356766730000183
Figure BDA0002356766730000184
Figure BDA0002356766730000191
注：与空白组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。
实验结果显示，格列本脲组、第5号样品(Chikusetsusaponin V)组、第13号样品(竹节 参总皂苷)组、第25号样品(V：RT1：IV：IVa＝2:1:1:1)和第29号样品(竹节参药材)均能够显著性或极显著性促进RIN细胞分泌胰岛素(P<0.01，P<0.05)，而羟苯磺酸钙组、二 甲双胍+羟苯磺酸钙联合组则影响不显著。
实施例四
4.竹节参总皂苷部位对α-葡萄糖苷酶的抑制活性实验[8]
食物中大多数糖类为麦芽糖、淀粉等双糖或多糖，需要α糖苷酶分解成单糖后被吸收， α糖苷酶抑制剂可以竞争性抑制小肠中各种α-糖苷酶，使得多糖分解为单糖的速度减慢，从 而减缓肠道内葡萄糖的吸收，从而降低餐后高血糖。
4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)是麦芽糖类似物，在pH 6.8时，α-葡萄糖苷酶使 PNPG水解释放出硝基酚，硝基酚在405nm处有最大吸光值。本节实验计划以PNPG为底物，在pH为6.8的反应条件下催化反应，于405nm处检测生成的硝基酚的吸光值，吸光值 越大说明酶的活性越大。α-糖苷酶抑制剂可竞争性抑制α糖苷酶的活性，使反应后释放出的硝基酚减少，吸光值降低，其吸光值越低说明该抑制剂的对α-糖苷酶的抑制率越高。α-糖苷酶抑制剂的抑制率可按下式计算。
Figure RE-GDA0002483265770000191
实验条件为将1mg/Lα-葡萄糖苷酶PBS溶液100μL与各样品50μL加入96孔板中，摇匀，在37℃水浴中孵育10min后加入浓度10mmol/L的PNPG溶液50μL，摇匀，37℃反应 45min后，加入0.3mol·L-1的Na2CO3 100μL，终止反应。于405nm处测定并记录吸光值计算 抑制率。结果见下表。
表7各样品对α-糖苷酶抑制作用
Figure BDA0002356766730000193
Figure BDA0002356766730000194
注：与空白组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
实验结果显示，阿卡波糖组、第5号样品(Chikusetsusaponin V)组、第13号样品(竹节 参总皂苷)组、第25号样品(V：RT1：IV：IVa＝2:1:1:1)和第29号样品(竹节参药材)均能够显著性或极显著性抑制α-糖苷酶的活性(P<0.01，P<0.05)，而羟苯磺酸钙组、二甲双胍+羟苯磺酸钙联合组则影响不显著。
实施例五
5.竹节参总皂苷部位对II型糖尿病模型大鼠降糖等活性实验研究[9]
本实验采用高糖高脂饲料喂养和注射小剂量STZ的方法制备糖尿病大鼠模型。该模型被 广泛认为为近似II型糖尿病模型，与单纯STZ造模的大鼠相比较该模型具有明显的高脂和胰 岛素抵抗的特征；与只用高脂饲料制备的II型糖尿病模型相比较该模型的实验周期更短，适 合研究糖尿病的各种并发症。该模型的具体制备方法：高糖高脂饲料(组成为普通饲料+蛋 黄粉+脂肪+葡萄糖)喂养SD大鼠4周；第5周腹腔注射STZ 30mg/kg造模，测定造模后大 鼠的随机血糖，选取血糖值大于16.7mol/l的大鼠作为糖尿病模型大鼠；将糖尿病模型大鼠 按血糖分组，于第6周开始灌服给药，造模、给药同时各糖尿病模型大鼠持续用高糖高脂饲 料喂养。灌服给药。给药体积均为20mL/kg。给药剂量分别为：空白对照组和模型对照组均 给予等体积的0.4％CMC-Na水溶液；西药阳性对照药盐酸二甲双胍片药剂量为0.18g/kg；二 甲双胍+羟苯磺酸钙联合西药阳性对照组的给药剂量为盐酸二甲双胍片为0.18g/kg+羟苯磺酸 钙0.15g/kg[10,11,12]。
二甲双胍的给药剂量为0.18g/kg；二甲双胍联合羟苯磺酸钙组盐酸二甲双胍给药剂量为 0.18g/kg，羟苯磺酸钙给药剂量为0.15g/kg；消渴丸给药剂量为0.8g/kg；竹节参总皂苷部位 低、中、高剂量组的给药剂量分别为0.075g/kg、0.15g/kg、0.3g/kg；第29号样品(竹节参 药材)的给药剂量约为2.2g/kg(相当于竹节参总皂苷中剂量组0.15g/kg)；第5号样品 (Chikusetsusaponin V)的给药剂量为0.15g/kg；第25号样品(V 2份、RT11份、IV1份、IVa 1份组合)的给药剂量为0.15g/kg。灌胃给药。连续给药12周。分别采取和收集实验大鼠的血样、尿样和相应的脏器组织，分别测定糖尿病的相关指标：空腹血糖值(FBG)、糖基化血红蛋白(HbA1C)等；测定糖尿病肾的相关指标：24小时尿蛋白、肌酐(SCR)、尿素氮(BUN)等。以便考察受试药物在降糖方面以及修复糖尿病肾损伤方面的活性作用。
各样品对II型糖尿病模型大鼠降糖等活性实验研究结果，见表8～12。
1.降糖相关指标的测定及其结果
1.1空腹血糖(FBG)测定结果
血糖升高是糖尿病最直接的表现，也是糖尿病并发症的最原始的诱因之一。本实验测量 大鼠的空腹血糖值，该空腹血糖值的变化情况可以显示各受试药物的降糖活性作用。
表8各样品对糖尿病大鼠血糖值的影响实验研究结果
Figure BDA0002356766730000201
Figure BDA0002356766730000202
Figure BDA0002356766730000211
注：与空白组比较，###P<0.001；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
实验结果显示，与空白对照组比较，模型组的空腹血糖值极显著性升高(P<0.001)， 显示造模成功；与模型组比较，竹节参总皂苷部位高、中剂量组的空腹血糖值均显著性降低 (P<0.01)，竹节参总皂苷部位低剂量组的空腹血糖值显著降低(P<0.05)，显示竹节参总 皂苷部位具有确切的降低II型糖尿病模型大鼠血糖的活性作用；竹节参药材组具有降低实验 大鼠空腹血糖值的显著作用(P<0.05)，它的剂量相当于竹节参总皂苷部位的中剂量组，其 活性作用仅相当于竹节参总皂苷部位的低剂量组，显示提取得到的竹节参总皂苷部位相对降 低了竹节参药材中具有降糖拮抗或减低作用的那部分成分；第25号样品是非模拟竹节参总皂 苷的5～8号化合物组合物样品，它具有降低实验大鼠空腹血糖值的极其显著性作用(P< 0.001)，它的剂量相当于竹节参总皂苷部位的中剂量组，但其活性作用高于竹节参总皂苷部 位的高剂量组，显示这4个成分的组合物相对降低了竹节参总皂苷部位中具有降糖拮抗或减 低作用的那部分成分，或者证明4个成分的组合物起到了降糖的协同作用或者增强作用，这 一发现具有重要的创新意义；第5号样品组(Chikusetsusaponin V)具有降低实验大鼠空腹血 糖值的显著作用(P<0.05)，它的剂量相当于竹节参总皂苷部位的中剂量组，它是竹节参药 材、竹节参总皂苷部位和第25号样品(非模拟竹节参总皂苷的5～8号化合物组合物)中的含 量最高的主要成分，但是它的降糖作用远不如相同剂量下的竹节参总皂苷部位和第25号样品 (非模拟竹节参总皂苷的5～8号化合物组合物)，显示竹节参总皂苷部位和第25号样品(非模 拟竹节参总皂苷的5～8号化合物组合物)的成分之间存在着降糖的协同作用或者增强作用。
显示消渴丸、二甲双胍、二甲双胍与羟苯磺酸钙联合、竹节参药材、竹节参总皂苷部 位、5号样品(Chikusetsusaponin V)及其25号样品(Chikusetsusaponin V：Pseudoginsenoside RT1：Chikusetsusaponin IV：Chikusetsusaponin IVa＝2:1:1:1的组合物)均具 有确切的降糖活性作用。在相同剂量下25号样品组合物的作用极其显著性(P<0.001)，显 示25号样品中各成分之间存在协同或增强作用。
1.2糖基化血红蛋白(GHb)测定结果
在体内葡萄糖能够与血红蛋白结合生成GHb，血糖越高被糖基化的血红蛋白越多，而且GHb的半衰期很长，因此GHb可以反映患者在一段较长时间内的血糖控制情况，血糖控制 不良，糖基化血红蛋白的比例就会升高，由此可以反映出受试药物降血糖的活性作用。给药 结束后，取血，按试剂盒说明书测定GHb。
表9各样品对糖尿病大鼠GHb的影响实验研究结果(mean±sd，n＝8)
Figure BDA0002356766730000221
注：与空白组比较，###P<0.001；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
实验结果显示，与空白对照组比较，模型组的糖基化血红蛋白极显著性升高(P<0.001)，显示造模成功；与模型组比较，竹节参总皂苷部位高、中剂量组的糖基化血红蛋白值均显著性降低(P<0.01)，竹节参总皂苷部位低剂量组的糖基化血红蛋白值显著降低(P<0.05)，显示竹节参总皂苷部位具有确切的降低II型糖尿病模型大鼠糖基化血红蛋白的活性作 用；竹节参药材组具有降低实验大鼠糖基化血红蛋白值的显著作用(P<0.05)，它的剂量相 当于竹节参总皂苷部位的中剂量组，其活性作用仅相当于竹节参总皂苷部位的低剂量组，显 示提取得到的竹节参总皂苷部位相对降低了竹节参药材中具有降糖基化血红蛋白的拮抗或减 低作用的那部分成分；第25号样品是非模拟竹节参总皂苷的5～8号化合物组合物 (Chikusetsusaponin V：Pseudoginsenoside RT1：Chikusetsusaponin IV：Chikusetsusaponin IVa＝2:1:1:1组合物)，它具有降低实验大鼠糖基化血红蛋白值的极其显著性作用(P< 0.001)，它的剂量相当于竹节参总皂苷部位的中剂量组，但其活性高过竹节参总皂苷部位的 高剂量组，显示这4个成分的组合物相对降低了竹节参总皂苷部位中具有降糖基化血红蛋白 拮抗或减低作用的那部分成分，或者证明4个成分的组合物起到了降糖基化血红蛋白的协同 作用或者增强作用，这一发现具有重要的创新意义；第5号样品组(Chikusetsusaponin V)具 有降低实验大鼠糖基化血红蛋白值的显著作用(P<0.05)，它的剂量相当于竹节参总皂苷部 位的中剂量组，它是竹节参药材、竹节参总皂苷部位和第25号样品中的含量最高的主要成 分，但是它的降糖基化血红蛋白作用远不如相同剂量下的竹节参总皂苷部位和第25号样品， 显示竹节参总皂苷部位和第25号样品的成分之间存在着降糖基化血红蛋白的协同作用或者增 强作用。
显示消渴丸、二甲双胍、二甲双胍与羟苯磺酸钙联合、竹节参药材、竹节参总皂苷部 位、5号样品(Chikusetsusaponin V)及其25号样品(Chikusetsusaponin V、Pseudoginsenoside RT1、Chikusetsusaponin IV和Chikusetsusaponin IVa的组合物)均具有确切 的降低糖基化血红蛋白活性作用。在相同剂量下25号样品(ChikusetsusaponinV： Pseudoginsenoside RT1：Chikusetsusaponin IV：Chikusetsusaponin IVa＝2:1:1:1的组合物)的作 用具有极显著性，显示25号样品中各成分之间存在协同或增强作用。
2.糖尿病肾病相关指标测定结果
2.1 24h尿蛋白测定结果
尿蛋白是肾脏疾病最主要的临床表现。将大鼠置于代谢笼中，收集24h尿液，测量体 积，离心，取上清液，按试剂盒说明测定尿液中蛋白含量。
表10各样品对糖尿病大鼠尿蛋白(PRO)的影响实验研究结果(mean±sd，n＝8)
Figure BDA0002356766730000231
注：与空白组比较，###P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
实验结果显示，与空白对照组比较，模型组的24h尿液蛋白含量极显著性升高(P<0.001)，显示造模成功；阳性对照组消渴丸组、二甲双胍组、二甲双胍与羟苯磺酸钙联合组均无降低实验大鼠24h尿液蛋白含量的活性作用；与模型组比较，竹节参总皂苷部位高、中剂量组对24h尿液蛋白含量均显著性降低(P<0.01)，竹节参总皂苷部位低剂量组对24h尿液蛋白含量显著降低(P<0.05)，显示竹节参总皂苷部位具有确切的降低II型糖尿病模型大鼠糖24h尿液蛋白含量的活性作用；竹节参药材组具有降低实验大鼠24h尿液蛋白含量的显著作 用(P<0.05)，它的剂量相当于竹节参总皂苷部位的中剂量组，其活性作用仅相当于竹节参 总皂苷部位的低剂量组，显示提取得到的竹节参总皂苷部位相对降低了竹节参药材中具有降 24h尿液蛋白含量的拮抗或减低作用的那部分成分；第25号样品是(Chikusetsusaponin V： Pseudoginsenoside RT1：Chikusetsusaponin IV：Chikusetsusaponin IVa＝2:1:1:1的组合物)竹节 参总皂苷部位中的几个成分按一定的质量比组合成样品，它具有降低实验大鼠24h尿液蛋白 含量的极其显著性作用(P<0.001)，它的剂量相当于竹节参总皂苷部位的中剂量组，但其 活性高过竹节参总皂苷部位的高剂量组，显示这4个成分的组合物相对降低了竹节参总皂苷 部位中具有降24h尿液蛋白含量的拮抗或减低作用的那部分成分，或者证明4个成分的组合物 起到了降24h尿液蛋白含量的协同作用或者增强作用，这一发现具有重要的创新意义；第5号 样品组(Chikusetsusaponin V)具有降低实验大鼠24h尿液蛋白含量的显著作用(P<0.05)， 它的剂量相当于竹节参总皂苷部位的中剂量组，它是竹节参药材、竹节参总皂苷部位和第25 号样品中的含量最高的主要成分，但是它的24h尿液蛋白含量作用远不如相同剂量下的竹节参总皂苷部位和第25号样品，显示竹节参总皂苷部位和第25号样品的成分之间存在着降24h 尿液蛋白含量的协同作用或者增强作用。
显示竹节参药材、竹节参总皂苷部位、5号样品(Chikusetsusaponin V)及其25号样品 (Chikusetsusaponin V、Pseudoginsenoside RT1、Chikusetsusaponin IV和Chikusetsusaponin IVa 的组合物)均具有确切的修复II型糖尿病模型大鼠肾损伤的活性作用。在相同剂量下25号 样品的作用极显著性，显示，25号样品中各成分之间存在协同或增强作用。
2.2糖尿病大鼠血清肌酐(Scr)测定结果
表11各样品对糖尿病大鼠血清肌酐(Scr)的影响实验研究结果(mean±sd，n＝8)
Figure BDA0002356766730000241
注：与空白组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
实验结果显示，与空白对照组比较，模型组的血清中肌酐含量显著性升高(P<0.01)， 显示造模成功；阳性对照组消渴丸组、二甲双胍组、二甲双胍与羟苯磺酸钙联合组均无降低 实验大鼠血清中肌酐含量的活性作用；与模型组比较，竹节参总皂苷部位高、中剂量组对血 清中肌酐含量均显著性降低(P<0.01)，竹节参总皂苷部位低剂量组对血清中肌酐含量显著 降低(P<0.05)，显示竹节参总皂苷部位具有确切的降低II型糖尿病模型大鼠糖2血清中肌酐 含量的活性作用；竹节参药材组具有降低实验大鼠血清中肌酐含量的显著作用(P<0.05)， 它的剂量相当于竹节参总皂苷部位的中剂量组，其活性作用仅相当于竹节参总皂苷部位的低 剂量组，显示提取得到的竹节参总皂苷部位相对降低了竹节参药材中具有降血清中肌酐含量 的拮抗或减低作用的那部分成分；第25号样品是竹节参总皂苷部位中的几个成分按一定的质 量比组合成样品(Chikusetsusaponin V、Pseudoginsenoside RT1、Chikusetsusaponin IV和 Chikusetsusaponin IVa的组合物)，它具有降低实验大鼠血清中肌酐含量的极其显著性作用(P <0.001)，它的剂量相当于竹节参总皂苷部位的中剂量组，但其活性高过竹节参总皂苷部位 的高剂量组，显示这4个成分的组合物相对降低了竹节参总皂苷部位中具有降血清中肌酐含 量的拮抗或减低作用的那部分成分，或者证明4个成分的组合物起到了降血清中肌酐含量的 协同作用或者增强作用，这一发现具有重要的创新意义；第5号样品组(Chikusetsusaponin V)具有降低实验大鼠血清中肌酐含量的显著作用(P<0.05)，它的剂量相当于竹节参总皂 苷部位的中剂量组，它是竹节参药材、竹节参总皂苷部位和第25号样品中的含量最高的主要 成分，但是它降低血清中肌酐含量作用远不如相同剂量下的竹节参总皂苷部位和第25号样 品，显示竹节参总皂苷部位和第25号样品的成分之间存在着降低血清中肌酐含量的协同作用 或者增强作用。
显示消渴丸、二甲双胍、二甲双胍与羟苯磺酸钙联合不具有降低血清中肌酐含量的活性 作用。竹节参药材、竹节参总皂苷部位、5号样品(Chikusetsusaponin V)及其25号样品 (Chikusetsusaponin V、Pseudoginsenoside RT1、Chikusetsusaponin IV和Chikusetsusaponin IVa 的组合物)均具有确切的降低血清中肌酐含量修复肾损伤的活性作用。在相同剂量下25号样 品(Chikusetsusaponin V、Pseudoginsenoside RT1、Chikusetsusaponin IV和Chikusetsusaponin IVa的组合物)的作用极显著性，显示，25号样品中各成分之间存在协同或增强作用。
2.3糖尿病大鼠血清尿素氮(BUN)测定结果
肌酐是肾脏疾病最主要的临床表现之一。在给药结束后，取血，离心得到血清，按试剂 盒说明测定血清中尿素氮的含量。
表12各样品对糖尿病大鼠血液尿素氮(BUN)的影响实验研究结果(mean±sd，n＝8)
Figure BDA0002356766730000251
Figure BDA0002356766730000261
注：与空白组比较，###P<0.001；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
实验结果显示，与空白对照组比较，模型组的血清中尿素氮含量极显著性升高(P<0.001)，显示造模成功；阳性对照组消渴丸组、二甲双胍组、二甲双胍与羟苯磺酸钙联合组均无降低实验大鼠血清中尿素氮含量的活性作用；与模型组比较，竹节参总皂苷部位高、中剂量组对血清中尿素氮含量均显著性降低(P<0.01)，竹节参总皂苷部位低剂量组对血清中尿素氮含量显著降低(P<0.05)，显示竹节参总皂苷部位具有确切的降低II型糖尿病模型大鼠血清中尿素氮含量的活性作用；竹节参药材组具有降低实验大鼠血清中尿素氮含量的显著 作用(P<0.05)，它的剂量相当于竹节参总皂苷部位的中剂量组，其活性作用仅相当于竹节 参总皂苷部位的低剂量组，显示提取得到的竹节参总皂苷部位相对降低了竹节参药材中具有 降血清中尿素氮含量的拮抗或减低作用的那部分成分；第25号样品是竹节参总皂苷部位中的 几个成分按一定的质量比组合成样品(Chikusetsusaponin V、Pseudoginsenoside RT1、 Chikusetsusaponin IV和Chikusetsusaponin IVa的组合物)，它具有降低实验大鼠血清中尿素氮 含量的极其显著性作用(P<0.001)，它的剂量相当于竹节参总皂苷部位的中剂量组，但其 活性高过竹节参总皂苷部位的高剂量组，显示这4个成分的组合物相对降低了竹节参总皂苷 部位中具有降低血清中尿素氮含量的拮抗或减低作用的那部分成分，或者证明4个成分的组 合物起到了降低血清中尿素氮含量的协同作用或者增强作用，这一发现具有重要的创新意 义；第5号样品组(Chikusetsusaponin V)具有降低实验大鼠血清中尿素氮含量的显著作用 (P<0.05)，它的剂量相当于竹节参总皂苷部位的中剂量组，它是竹节参药材、竹节参总皂 苷部位和第25号样品中的含量最高的主要成分，但是它降低血清中肌酐含量作用远不如相同 剂量下的竹节参总皂苷部位和第25号样品，显示竹节参总皂苷部位和第25号样品的成分之间 存在着降低血清中肌酐含量的协同作用或者增强作用。
实验结果显示消渴丸、二甲双胍、二甲双胍与羟苯磺酸钙联合不具有降低血清中尿素氮 含量的活性作用。竹节参药材、竹节参总皂苷部位、5号样品(ChikusetsusaponinV)及其25 号样品(Chikusetsusaponin V、Pseudoginsenoside RT1、ChikusetsusaponinIV和 Chikusetsusaponin IVa的组合物)均具有确切的降低血清中尿素氮含量修复肾损伤的活性作 用。在相同剂量下25号样品(Chikusetsusaponin V、Pseudoginsenoside RT1、Chikusetsusaponin IV和Chikusetsusaponin IVa的组合物)的作用具有极其显著性，显示25号样 品中各成分之间存在协同或增强作用。
第5号样品组(Chikusetsusaponin V)、第25号样品组(Chikusetsusaponin V：Pseudoginsenoside RT1：Chikusetsusaponin IV：Chikusetsusaponin IVa＝2:1:1:1组合物)、竹节 参总皂苷和竹节参药材各样品均具有显著性或极显著性降低糖尿病模型大鼠血糖、修复高糖 诱导的肾损伤活性。
实施例六
从竹节参中分离得到的1～12号化合物、模拟竹节参总皂苷1～12号化合物组合物、模拟 竹节参总皂苷5～8号化合物组合物、非模拟竹节参总皂苷5～8号化合物组合物、非模拟竹节 参总皂苷5～7～8号化合物组合物、竹节参总皂苷和竹节参药材各样品，与医学上可接受的各 种辅料制成的固体制剂和/或液体制剂，具有降糖作用。
现已非模拟竹节参总皂苷5～8号化合物组合物为例进行硬胶囊剂制粒。取非模拟竹节参 总皂苷5～8号化合物组合物500g，加入5～10％淀粉，干法制粒/或湿法制粒，过筛，干燥， 装入1号硬胶囊，粒重0.275g/粒。成人每日3次，每次2粒。
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Claims (10)

1.从竹节参药材中分离得到的化合物在制备降糖药物或/和用于修复高糖诱导的肾损伤药物中的应用，其特征在于，所述的化合物为人参皂苷Rg2、竹节参皂苷V、伪人参皂苷RT1、竹节参皂苷IV、竹节参皂苷IVa、去28-葡萄糖基竹节参皂苷IVa、姜状三七皂苷R1、龙牙楤木皂苷VI和太白木皂苷I中的任意一种。
2.从竹节参药材中分离得到的12种化合物的组合物在制备降糖药物或/和用于修复高糖诱导的肾损伤药物中的应用，其特征在于，所述的12种化合物为人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rg2、人参皂苷Rb1、竹节参皂苷V、伪人参皂苷RT1、竹节参皂苷IV、竹节参皂苷IVa、去28-葡萄糖基竹节参皂苷IVa、姜状三七皂苷R1、龙牙楤木皂苷VI和太白木皂苷I；
按重量份数计，该组合物中12种化合物的配比为：人参皂苷Rg1 0.8～1.5份、人参皂苷Re 0.4～0.85份、人参皂苷Rg2 0.5～1.0份、人参皂苷Rb1 0.9～1.7份、竹节参皂苷V 20～40份、伪人参皂苷RT1 8～17份、竹节参皂苷IV 10～22份、竹节参皂苷IVa 8～17份、去28-葡萄糖基竹节参皂苷IVa 1～3.5份、姜状三七皂苷R1 0.9～2份、龙牙楤木皂苷VI 0.3～1.2份和太白木皂苷I 0.2～0.8份；优选的该组合物为由所述的12种化合物按其在竹节参总皂苷中的质量比例组成的模拟竹节参总皂苷。
3.从竹节参药材中分离得到的4种化合物中的至少两种组成的组合物在制备降糖药物或/和用于修复高糖诱导的肾损伤药物中的应用，其特征在于，所述的4种化合物为竹节参皂苷V、伪人参皂苷RT1和竹节参皂苷IV、竹节参皂苷IVa。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的组合物为(Ⅰ)～(Ⅺ)中的任意一种：
(Ⅰ)由质量比为(0.1～3):(0.1～3)的竹节参皂苷V和伪人参皂苷RT1组成的组合物；
(Ⅱ)由质量比为(0.1～3):(0.1～3)的竹节参皂苷V和竹节参皂苷IV组成的组合组合物；
(Ⅲ)由质量比为(0.1～3):(0.1～3)的竹节参皂苷V和竹节参皂苷IVa组成的组合物；
(Ⅳ)由质量比为(0.1～3):(0.1～3)的伪人参皂苷RT1和竹节参皂苷IV组成的组合物；
(Ⅴ)由质量比为(0.1～3):(0.1～3)的伪人参皂苷RT1和竹节参皂苷IVa组成的组合物；
(Ⅵ)由质量比为(0.1～3):(0.1～3)的竹节参皂苷IV和竹节参皂苷IVa组成的组合物；
(Ⅶ)由质量比为(0.1～3):(0.1～3):(0.1～3)的竹节参皂苷V、伪人参皂苷RT1和竹节参皂苷IV组成的组合物；
(Ⅷ)由质量比为(0.1～3):(0.1～3):(0.1～3)的竹节参皂苷V、伪人参皂苷RT1和竹节参皂苷IVa组成的组合物；
(Ⅸ)由质量比为(0.1～3):(0.1～3):(0.1～3)的竹节参皂苷V、竹节参皂苷IV和竹节参皂苷IVa组成的组合物；
(Ⅹ)由质量比为(0.1～3):(0.1～3):(0.1～3)的伪人参皂苷RT1、竹节参皂苷IV和竹节参皂苷IVa组成的组合物；
(Ⅺ)由质量比为(0.1～3):(0.1～3):(0.1～3):(0.1～3)的竹节参皂苷V、伪人参皂苷RT1、竹节参皂苷IV和竹节参皂苷IVa组成的组合物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的组合物(Ⅷ)中竹节参皂苷V、竹节参皂苷IV和竹节参皂苷IVa的质量比优选为(1～3)：(1～2)：(1～2)；所述的组合物(Ⅺ)中竹节参皂苷V、伪人参皂苷RT1、竹节参皂苷IV和竹节参皂苷IVa的质量比优选为(1～3)：(1～2)：(1～2)：(1～2)或者模拟其在竹节参总皂苷中的质量比例；优选的，所述的组合物(Ⅷ)中竹节参皂苷V、竹节参皂苷IV和竹节参皂苷IVa的质量比为(1～2)：1：1；所述的组合物(Ⅺ)中竹节参皂苷V、伪人参皂苷RT1、竹节参皂苷IV和竹节参皂苷IVa的质量比为(1～2)：1：1：1或者模拟其在竹节参总皂苷中的质量比例。
6.竹节参总皂苷或竹节参药材在制备降糖药物或/和用于修复高糖诱导的肾损伤药物中的应用。
7.根据权利要求1～6中任一所述的应用，其特征在于所述的药物由所述的化合物、组合物、竹节参总皂苷或竹节参药材与药学上可接受的辅料制成的固体制剂和/或液体制剂。
8.一种用于降糖或/和修复高糖诱导的肾损伤的药物组合物，其特征在于该药物组合物中包含竹节参皂苷V、伪人参皂苷RT1、竹节参皂苷IV和竹节参皂苷IVa中的至少两种。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于所述的药物组合物为(Ⅰ)～(Ⅺ)中的任意一种：
(Ⅰ)由质量比为(0.1～3):(0.1～3)的竹节参皂苷V和伪人参皂苷RT1组成的组合物；
(Ⅱ)由质量比为(0.1～3):(0.1～3)的竹节参皂苷V和竹节参皂苷IV组成的组合组合物；
(Ⅲ)由质量比为(0.1～3):(0.1～3)的竹节参皂苷V和竹节参皂苷IVa组成的组合物；
(Ⅳ)由质量比为(0.1～3):(0.1～3)的伪人参皂苷RT1和竹节参皂苷IV组成的组合物；
(Ⅴ)由质量比为(0.1～3):(0.1～3)的伪人参皂苷RT1和竹节参皂苷IVa组成的组合物；
(Ⅵ)由质量比为(0.1～3):(0.1～3)的竹节参皂苷IV和竹节参皂苷IVa组成的组合物；
(Ⅶ)由质量比为(0.1～3):(0.1～3):(0.1～3)的竹节参皂苷V、伪人参皂苷RT1和竹节参皂苷IV组成的组合物；
(Ⅷ)由质量比为(0.1～3):(0.1～3):(0.1～3)的竹节参皂苷V、伪人参皂苷RT1和竹节参皂苷IVa组成的组合物；
(Ⅸ)由质量比为(0.1～3):(0.1～3):(0.1～3)的竹节参皂苷V、竹节参皂苷IV和竹节参皂苷IVa组成的组合物；
(Ⅹ)由质量比为(0.1～3):(0.1～3):(0.1～3)的伪人参皂苷RT1、竹节参皂苷IV和竹节参皂苷IVa组成的组合物；
(Ⅺ)由质量比为(0.1～3):(0.1～3):(0.1～3):(0.1～3)的竹节参皂苷V、伪人参皂苷RT1、竹节参皂苷IV和竹节参皂苷IVa组成的组合物。
10.一种用于降糖或/和修复高糖诱导的肾损伤的药物组合物，其特征在于该药物组合物中包含人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rg2、人参皂苷Rb1、竹节参皂苷V、伪人参皂苷RT1、竹节参皂苷IV、竹节参皂苷IVa、去28-葡萄糖基竹节参皂苷IVa、姜状三七皂苷R1、龙牙楤木皂苷VI和太白木皂苷I。
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