CN106389452A

CN106389452A - 具有dpp‑4抑制活性的中药活性化合物及其制备方法与用途

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Publication number: CN106389452A
Application number: CN201611065126.2A
Authority: CN
Inventors: 赵筱萍; 王毅; 邹敬韬; 华正喜
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-11-28
Filing date: 2016-11-28
Publication date: 2017-02-15

Abstract

本发明属于中药化学领域，更具体地说涉及从中药消渴安胶囊中筛选发现的一种具二肽基肽酶4（DPP‑4）抑制活性的活性化合物，该活性化合物及其制剂具有潜在的预防和治疗餐后高血糖症、糖尿病综合症中的高血糖症的作用。具有DPP‑4抑制活性的中药活性化合物，该活性化合物为人参皂苷Ro。具有DPP‑4抑制活性的中药活性化合物在制备治疗糖尿病药物中的应用。本发明提供的中药有效组分化学成分简单明确，在药理研究上更易于阐明其作用机制。本发明提供的方法首次从消渴安胶囊中得到具有DPP‑4抑制活性的人参皂苷Ro，为糖尿病的防治提供新的药物选择。

Description

具有DPP-4抑制活性的中药活性化合物及其制备方法与用途

技术领域

本发明属于中药化学领域，更具体地说涉及从中药消渴安胶囊中筛选发现的一种具二肽基肽酶4（DPP-4）抑制活性的活性化合物，该活性化合物及其制剂具有潜在的预防和治疗餐后高血糖症、糖尿病综合症中的高血糖症的作用。

背景技术

糖尿病、肥胖症和高脂血症在世界范围人口中的发病频率很高并且继续增加。在一般人群中，糖尿病是最慢性的疾病之一，其随着肥胖和年龄的增多而发生。虽然有用于治疗糖尿病综合症所开发的药物，但是今天在对糖尿病病人的治疗中最具有挑战的目标仍然是使血糖水平尽可能地接近正常。另外，餐后高血糖症和高胰岛素血症是发生糖尿病大血管并发症的独立危险因素。糖尿病是一种慢性代谢紊乱性疾病，其主要的干预方法是控制饮食、减少摄入性碳水化合物的含量、药物治疗等。人体摄入的碳水化合物经过小肠上皮细胞的酶（如淀粉酶和α-葡萄糖苷酶）的水解作用生成葡萄糖之后，才被吸收进入血液循环。而DPP-4作为一种丝氨酸蛋白酶，在肠道中高表达，它能够分解肠道细胞分泌的肠促胰岛素（GLP-1）。通过抑制DPP-4活性，而阻断其分解GLP-1，使GLP-1能够持续发挥刺激胰岛素分泌、抑制升糖素、抑制胃排空和让胰岛细胞重生等作用，从而降低血糖。目前，西格列汀、阿格列汀等DPP-4抑制剂可以抑制DPP-4活性，成为一类临床常用的糖尿病治疗药物。但现有的DPP-4抑制剂大多为化学合成小分子，源于中药的DPP-4抑制剂还少见报道。

消渴安胶囊是能清热生津、益气养阴、活血化瘀的治疗2型糖尿病的临床经验方，具有一定的降血糖作用。其处方包括地黄、知母、黄连、人参、丹参、地骨皮、玉竹和枸杞八味药材。

本发明涉及从消渴安胶囊中筛选具有显著DPP-4抑制作用的化合物及其制剂，其可用于制备治疗糖尿病药物。消渴安胶囊的药品文号为：国药准字Z19991067，处方为：地黄知母黄连地骨皮枸杞子玉竹人参丹参。

发明内容

本发明的目的是提供具有DPP-4抑制活性的中药活性化合物及其制备方法与用途，发现的新物质人参皂苷Ro，在制备治疗糖尿病药物中的应用。

具有DPP-4抑制活性的中药活性化合物，其特征是：该活性化合物为人参皂苷Ro。

具有DPP-4抑制活性的中药活性化合物在制备治疗糖尿病药物中的应用。

治疗糖尿病的药物，其特征在于由上述中药活性化合物（人参皂苷Ro）加入药剂学上可接受的辅料，按照药剂学上记载的制剂制备方法制成。

治疗糖尿病的药物，其特征在于所述的制剂包括液体制剂或固体制剂，但不限于此，包括其它常规剂型，不一一罗列。

具有DPP-4抑制活性的中药活性化合物，其特征在于人参皂苷Ro从消渴安胶囊中提取。但不限于此，也可以是其它药材中提取。

具有DPP-4抑制活性的中药活性化合物，其特征在于人参皂苷Ro浓度为35－50 μmol/L。

具有DPP-4抑制活性的中药活性化合物，其特征在于人参皂苷Ro浓度为50 μmol/L。

消渴安胶囊为临床验证安全有效的抗糖尿病药物，从中发现活性化合物用于制备治疗糖尿病药物，在有效性、安全性上能够得到保障。采用制备液相色谱从消渴安胶囊中获得人参皂苷Ro，简单易得。

人参皂苷Ro制备方法步骤如下：

（1）原料：消渴安胶囊内容物。

（2）取消渴安胶囊内容物120 g，加入10倍量甲醇超声提取1h。过滤，50℃下旋蒸至浸膏状，用100mL超纯水复溶。复溶液用大孔树脂进行分离，依次用水、40%乙醇和95%乙醇洗脱，分别得到B01、B02和B03组分。B03组分进一步用制备液相进行分离，流动相：水（A）-乙腈（B）；流速：10 mL • min^-1；柱温：30℃；洗脱梯度：0 ~ 60 min（30% ~ 75% B），60 ~ 63min（75% ~ 85% B），63 ~ 65 min（80% ~ 100% B），65 ~ 75 min（100% ~ 100% B）。取保留时间为37分钟的色谱峰，即得。

本发明的有益效果为：

1、本发明提供的中药有效组分化学成分简单明确，在药理研究上更易于阐明其作用机制。

2、本发明提供的方法首次从消渴安胶囊中得到具有DPP-4抑制活性的人参皂苷Ro，为糖尿病的防治提供新的药物选择。

3、消渴安胶囊为临床验证安全有效的抗糖尿病药物，从中发现活性化合物用于制备治疗糖尿病药物，在有效性、安全性上能够得到保障。

附图说明

图1为人参皂苷Ro对DPP-4的抑制作用。

图2为人参皂苷Ro抑制DPP-4量效关系。

图3为人参皂苷Ro对3T3-L1前脂肪细胞诱导分化的影响。

图4为人参皂苷Ro对3T3-L1脂肪细胞总胆固醇含量的影响。

图5为人参皂苷Ro对3T3-L1脂肪细胞甘油三酯含量的影响。

图6为人参皂苷Ro对胰岛素抵抗的BNL CL.2细胞葡萄糖消耗作用的影响。

具体实施方式

本发明结合实施例进一步详细说明本发明的实质内容，该实施例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。

实施例一DPP-4抑制活性的测定

采用课题组建立的DPP-4抑制剂筛选方法，将人参皂苷Ro制成1 mmol/L浓度的溶液；将阳性药抑二肽素A制成1 mmol/L浓度的溶液。取96孔板，加50 μmol/L 底物20µL，人参皂苷Ro溶液5 µL，0.1 U/mL DPP-4酶溶液5 µL，混匀后37℃下孵育30min，在激发波长320 nm，发射波长450 nm处测定其荧光强度值。计算人参皂苷Ro对DPP-4活性的抑制率。其中酶溶液，样品溶液，反应底物溶液均以0.5 mmol/L，pH 7.0 HEPES缓冲液配制。

I_给药组：含底物和酶，并且加入待测样品反应后的荧光强度值；

I_{给药空白组}：含底物和待测样品，不加酶的荧光强度值；

I_对照组：含底物和酶，但不加入待测样品反应后的荧光强度值；

I_空白组：只含有底物，不含酶和待测样品的荧光强度值。

人参皂苷Ro在50 μmol/L浓度下抑制率为55.73%。相同条件下，阳性药物抑二肽素A在5 μmol/L浓度下抑制率为48.60%。见图1。

实施例二中药活性化合物制剂

取实施例一的中药活性化合物0.5g与10.5g聚乙二醇-6000混合均匀，加热熔融，化料后移至滴丸滴灌中，药液滴至6~8℃液体石蜡中，除油，制得滴丸400粒。

实施例三中药活性化合物制剂

取实施例以的中药活性化合物0.5g、葡萄糖4.5g、硫代硫酸钠0.9g和蒸馏水1L，上述组分混合均匀后，冷冻干燥，分装500支，即得。

实施例四人参皂苷Ro对DPP-4抑制活性的量效考察

取96孔板，加50 μmol/L 底物20µL，0.1 U/mL DPP-4酶溶液5 µL以及一定体积浓度为1mmol/L人参皂苷Ro溶液，使得人参皂苷Ro终浓度分别为5、10、25、35、50 μmol/L，反应总体积为100 µL。混匀后37℃下孵育30min，在激发波长320 nm，发射波长450 nm处测定其荧光强度值。计算人参皂苷Ro各浓度对DPP-4活性的抑制率。其中酶溶液，样品溶液，反应底物溶液均以0.5 mmol/L，pH 7.0 HEPES缓冲液配制。

人参皂苷Ro在5、10、25、35、50 μmol/L浓度下抑制率分别为5.49%、13.48%、32.55%、46.65%、56.76%。见图2。

实施例五对3T3-L1前脂肪细胞诱导分化的影响

3T3-L1前脂肪细胞以2×10⁴个/孔接种于24孔板，置于37℃、含5% CO₂细胞培养箱内进行孵育。当细胞汇合度达到80%左右时，将培养液换成3T3-L1前脂肪细胞成脂诱导液1培养48 h；随后，换成3T3-L1前脂肪细胞成脂诱导液2继续培养48 h；之后将培养液换成3T3-L1前脂肪细胞成脂诱导液3，每48 h换液一次，直至模型组约有75%的细胞分化为成熟脂肪细胞，共诱导分化10-12天。在更换诱导液的同时加入一定体积含人参皂苷Ro的培养液，使得人参皂苷Ro浓度为25 μmol·L^-1。实验另设对照组（不进行诱导分化）、模型组和阳性药组（含有300 μmol·L^-1西他列汀）。

诱导分化为成熟脂肪细胞后，弃去旧培养液，PBS漂洗1次，4%多聚甲醛固定1 h，之后PBS漂洗1次，油红O染色0.5-1 h后，70%乙醇水溶液清洗2次，吸尽液体后，于显微镜下拍摄图片。

人参皂苷Ro在25 μmol/L浓度下能抑制3T3-L1前脂肪细胞的诱导分化。见图3。

实施例六对3T3-L1脂肪细胞总胆固醇和甘油三酯含量的影响

诱导分化为成熟脂肪细胞后，吸去原培养液，PBS漂洗1次，每孔加入250 μL细胞裂解液（所有操作于冰上完成）。反复吹打细胞，使得细胞裂解完全，然后吸出每孔液体，4℃、12000rpm离心10 min，取上清用于细胞蛋白定量及甘油三酯、总胆固醇含量的测定。

甘油三酯和总胆固醇含量测定：取100 μL细胞蛋白于96孔板中，加入100 μL甘油三酯（或总胆固醇）含量测定工作液，37℃振摇5 min，于550 nm处测定吸光度。

最后结果以甘油三酯（或总胆固醇）含量除以细胞蛋白含量表示。

25 μmol/L人参皂苷Ro能显著降低脂肪细胞中总胆固醇和甘油三酯含量，使得3T3-L1脂肪细胞中总胆固醇和甘油三酯含量分别为0.63mmol/g蛋白和0.66mmol/g蛋白，与模型组相比有显著性差异（P<0.01）。见图4、5。

实施例七对胰岛素抵抗的BNL CL.2细胞葡萄糖消耗作用的影响

取对数生长期的BNL CL.2细胞消化计数，2×10⁴个/孔接种于96孔板，置于细胞培养箱中孵育，使细胞贴壁。24 h后，弃去旧培养液，PBS漂洗1次，之后加入一定体积的含胰岛素和各药物的DMEM，总体积为100 μL，使得胰岛素浓度为1 μmol·L^-1、人参皂苷Ro浓度为25μmol·L^-1。实验另设无细胞空白组（不含细胞）、溶剂对照组（含0.1% DMSO）、模型组（含1μmol·L^-1胰岛素）和阳性对照组（含300μmol·L^-1西他列汀和1μmol·L^-1胰岛素）。细胞培养箱中孵育24 h后，取各孔10 μL上清于新的96孔板中，用于测定葡萄糖含量。之后将原96孔板中的培养基吸尽，避光加入100 μL含0.5 mg · mL^-1MTT的培养液，继续于细胞培养箱内培养。4 h后，吸去含MTT的培养液，每孔加入100 μL DMSO，37℃震摇10 min后，酶标仪580nm处测定各孔吸光度。本部分实验使用的DMEM均为不含血清的低糖无酚红DMEM。

葡萄糖含量测定：将葡萄糖测定试剂盒中的R₁工作液和R₂工作液等体积混合后，取200 μL混合液加入含有10 μL上清的96孔板中，37℃孵育30 min后，酶标仪492 nm处测定各孔吸光度。以无细胞空白组的葡萄糖含量减去其他各组葡萄糖含量即为各组细胞的葡萄糖消耗量，最后除以各组细胞MTT实验的吸光度进行细胞数量的校正。

25 μmol/L人参皂苷Ro作用于胰岛素抵抗的BNL CL.2细胞后，葡萄糖消耗量增加，且与模型组相比有显著性差异（P<0.01）。见图6。

Claims

1.具有DPP-4抑制活性的中药活性化合物，其特征是：该活性化合物为人参皂苷Ro。

2.根据权利要求1所述的具有DPP-4抑制活性的中药活性化合物在制备治疗糖尿病药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的药物，其特征在于由中药活性化合物加入药剂学上可接受的辅料，按照药剂学上记载的制剂制备方法制成。

4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于所述的制剂包括液体制剂或固体制剂。

5.根据权利要求1所述的具有DPP-4抑制活性的中药活性化合物，其特征在于人参皂苷Ro从消渴安胶囊中提取。

6.根据权利要求1所述的具有DPP-4抑制活性的中药活性化合物，其特征在于人参皂苷Ro浓度为35－50 μmol/L。

7.根据权利要求6所述的具有DPP-4抑制活性的中药活性化合物，其特征在于人参皂苷Ro浓度为50 μmol/L。

8.根据权利要求4所述的具有DPP-4抑制活性的中药活性化合物，其特征在由以下原料制成：人参皂苷Ro 0.5g，与10.5g聚乙二醇-6000混合均匀，加热熔融，化料后移至滴丸滴灌中，药液滴至6~8℃液体石蜡中，除油，制得滴丸400粒。

9.根据权利要求4所述的具有DPP-4抑制活性的中药活性化合物，其特征在由以下原料制成：人参皂苷Ro 0.5g、葡萄糖4.5g、硫代硫酸钠0.9g和蒸馏水1L，上述组分混合均匀后，冷冻干燥，分装500支，即得。