CN111296445A - 青枯劳尔氏菌靶向纳米药剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

青枯劳尔氏菌靶向纳米药剂及其制备方法和应用，采用可降解高聚物为载体，以咖啡酸及其酯类衍生物为药效成分，选择对青枯劳尔氏菌具有高度特异性的单克隆抗体，构建青枯劳尔氏菌靶向纳米药剂。本纳米药剂能靶向结合青枯劳尔氏菌并破坏其细胞膜，使缓慢释放的药物能够进入青枯劳尔氏菌细胞内部，实现对青枯劳尔氏菌的特异性抑制作用。本发明提高了药效分子的抑菌性能，同时延长了对青枯劳尔氏菌的抑制作用时效，用于农作物青枯病的靶向防治将会有巨大的推广潜力。

Description

青枯劳尔氏菌靶向纳米药剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于植物保护领域，具体涉及一种青枯劳尔氏菌靶向纳米药剂及其制备方法和应用。
背景技术
植物青枯病是一种广泛分布于热带、亚热带和某些温带地区的世界性病害，是多种农作物如番茄、茄子、辣椒、马铃薯等茄科蔬菜的主要病害，也是经济作物减产的主要原因之一。青枯病的主要症状是植株迅速萎蔫、枯死，茎叶仍保持绿色，发病十分迅猛，青枯病的防治一直以来都是各国农作物植保重点研究的课题。植物青枯病的致病菌是青枯劳尔氏菌(拉丁名：Ralstonia solanacearum)，目前主要采用药剂防控和生物防控，农用化学药剂虽有一定的防治效果，但随着施用时间的延长，药效逐渐降低，且大量使用往往伴随着土壤及环境污染等问题。另外，对于有众多种内变异的青枯劳尔氏菌来说，生物防控如生防菌及培育抗病树种等方法防治效果有限。专利WO 2016/145908 A1公布了一种纳米农药杀菌剂的制备方法，其不仅通过提高有效利用率节省了农药的用量，降低了成本，而且残留农药、有害溶剂和助剂以及环境污染也可以显著减少，从而确保粮食、食品和生态安全。目前尚未有研究将纳米药剂运用到青枯病防治中，因此载有天然源绿色药效分子的纳米药剂将有望解决青枯病防治工作中遇到的此类问题。
近年来，纳米技术在农药研究中的运用逐渐增多，显著提高了农药的药效和使用安全性，并且降低了对环境的污染(农药市场信息2010,37(5):97-100)。如，纳米农药已经开始应用在一些植物病害的防治中，例如：多壁碳纳米管接枝复合材料有机合成农药由于高生物活性而被广泛应用于农业生产(世界农药.2015,37(6):46-49)。专利WO 2018/175445 A1公布了一种利用聚乳酸-羟基乙酸共聚物(Poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)制备载药颗粒的方法。 PLGA是可生物降解的聚合物中应用最广泛的一种，它的水解代谢产物的单体为乳酸和乙醇，而这两个单体是内源性的，在药物递送或生物材料的应用方面的毒性较小，广泛应用于纳米药剂的研制。因此，纳米农用药剂的开发在今后的农用药剂领域具有极大的潜力，极具研发和应用价值。
天然源药物经常用作药剂制备的主要药效成分，在新型农用药剂开发行业内倍受关注，如咖啡酸及其衍生物是一类广泛存在于植物组织中的酚类化合物，具有多种生物学功能，如抗氧化、抗肿瘤，免疫调节等，专利CN104365598A公开了咖啡酸甲酯(Methylcaffeate,MC) 和咖啡酸苯乙酯(Caffeic acid phenethyl ester,CAPE)对青枯劳尔氏菌具有良好的抑菌效果，该类化合物可以造成青枯劳尔氏菌细胞的变形、破损，以及对其泳动性和细胞膜形成形成抑制。因此，采用此类天然源药物制备新型的纳米药剂，有望获得高效、低成本的防治桑青枯病药剂。
高聚物纳米颗粒可通过多种方法制备，主要有溶剂蒸发，盐析，透析，超临界流体技术，微乳液，微乳液，无表面活性剂乳液和界面聚合(Progress in Polymer Science,2011, 36(7):887-913.)。利用乳化溶剂蒸发法制备出载有维生素B1的壳聚糖纳米药剂，一方面可以刺激鹰嘴豆的生长，另一方面还可用于萎蔫病的防控(Carbohydrate Polymers,2019, 212:169–177.)。另外，上述高聚物纳米颗粒的制备方法中，还可结合两种或两种以上方法进行使用。盐析法和单乳液相结合制备出的聚碳酸三亚甲基酯和单甲氧基聚(乙二醇)嵌段聚 (碳酸三亚甲基酯)两种纳米颗粒，可通过调节搅拌速度来控制纳米颗粒的平均尺寸，且两者对地塞米松的载药率分别为54％和88％(Journal of Controlled Release,2006,111: 263–270.)。使用乳化溶剂挥发法所制成的纳米颗粒外观圆整，大小均匀，粒径可控，包封率多数可达50％以上(生物技术通讯.2008,19(4):562-565)。另外，高聚物纳米颗粒还可经过适当的修饰，如靶向抗肿瘤药物、pH响应纳米药剂等，可赋予农用药剂新的特性以适应不同的用药需求，实现精准用药。
靶向纳米颗粒，即纳米颗粒具有靶向性，能直接向靶器官、靶细胞或细胞内靶结构输送药物，同时具有缓释、提高疗效、降低毒副作用等优点。高聚物纳米颗粒作为靶向药物的载体材料可将药物选择性地投放至病变部位，可以有效降低其对正常组织的毒副作用，提高药物的生物利用度(European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics,2002,53(1):57-63)。为了提高药效，降低其毒副作用，靶向纳米技术被广泛的应用到药物制剂的研发当中。因此，将青枯劳尔氏菌的特异性抗体结合于纳米载药颗粒，将有望实现天然源药物的精准释放。本发明将利用高聚物纳米颗粒将天然源药物进行包埋，并赋予纳米颗粒青枯劳尔氏菌的靶向能力，从而达到精准释放天然源药物类药物，而这种纳米化包埋的方法可以减少天然源药物的使用量，并提高天然源药物的利用率。
发明内容
解决的技术问题：本发明针对上述技术问题，提供一种青枯劳尔氏菌靶向纳米药剂及其制备方法和应用，旨在利用高聚物纳米颗粒包埋天然源药物并使其能够精准释放，达到最大化利用药物的目的。
技术方案：青枯劳尔氏菌靶向纳米药剂的制备方法，步骤为：按浓度1-500mg/ml将高聚物溶解于有机溶剂，将高聚物分散于有机溶剂中得高聚物溶液，所述高聚物为聚乳酸-羟基乙酸共聚物(Poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)、壳聚糖、PLA(polylacticacid)，PCL (poly(ε-caprolactum))、PEO(poly(ethylene oxide))、PEG(poly(ethyleneglycol))、PS(polystyrene)、 PI(polyisoprene)中的至少一种，再将高聚物溶液与分散于无水乙醇中的复配咖啡酸或其酯类衍生物中的至少一种，按照体积比1:(6-2)混合作为有机相，表面活性剂与水混合构成水相，将有机相与水相按照体积比0.1-2混合，超声乳化形成白色乳液；搅拌使乳液中的有机溶剂挥发，离心收集纳米颗粒，重新悬浮于水中制成纳米粒分散体系，冻干成白色絮状；采用碳化二亚胺法，将单克隆抗体与纳米颗粒进行偶联，离心后重新悬浮于PBS中，PBS的pH值为 5.7-8.0，得到青枯劳尔氏菌靶向纳米药剂。
上述咖啡酸酯类衍生物为咖啡酸甲酯(Methyl caffeate，MC)、咖啡酸乙酯(Ethylcaffeate， EC)、咖啡酸苯乙酯(Caffeic acid phenethyl ester，CAPE)咖啡酸酯丙酯(Propyl caffeate， PC)、咖啡酸异丙酯(Isopropyl caffeate,IpC)、咖啡酸丁酯(Butylcaffeate，BC)、咖啡酸戊酯(Amyl caffeate，AC)、咖啡酸异戊酯(Isoamyl caffeate，IaC)、咖啡酸己酯(Hexyl caffeate， HexC)、咖啡酸庚酯(Heptyl caffeate，HepC)或咖啡酸辛酯(Octyl caffeate，OCC)。
上述有机容剂为二氯甲烷、丙酮、乙醇、三氯甲烷、乙腈或四氢呋喃。
上述水相为表面活性剂与水溶液按照质量比1-10％比例的混合物，所述表面活性剂为 PVA、Poloxamine 908、聚乙烯、Pluronic F-108、吐温80、吐温20或司盘20。
上述超声功率为65-650W，时间为1-15min。
上述碳化二亚胺法为：将碳化二亚胺类化合物和纳米颗粒按照质量比0.1-2混合，所述碳化二亚胺类化合物为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、1-环已基-2-吗啉乙基碳二亚胺(CMC)、N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)和N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)，再添加稳定剂，碳化二亚胺类化合物与稳定剂的摩尔比例为1/9-9/1，所述稳定剂为N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)或N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)，得到活化的纳米颗粒，活化反应过程是在室温下搅拌反应5-10min，静置5-55min，然后加入对青枯劳尔氏菌具有特异性的单克隆抗体，单克隆抗体的稀释倍数为100-100000倍，偶联反应时间为10-60min，得偶联抗体的纳米颗粒。
上述单克隆抗体为经活体菌株免疫或杂交瘤构建制备出的对青枯劳尔氏菌具有特异性识别能力的单克隆抗体。
上述制备方法制得的产物。
上述产物在制备青枯劳尔氏菌靶向纳米产品中的应用。
有益效果：本发明利用高聚物纳米颗粒包埋天然源药物并使其能够精准释放，达到最大化利用药物的目的。本发明一方面强化天然源药物对青枯劳尔氏菌的抑制作用效果，另一方面其靶向作用将有利于对土壤微环境中有益微生物保护，降低了造成环境损伤的风险。因此构建了一种绿色安全、精准作用的药物输送体系，从而实现农用药剂的绿色用药、精准用药。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
本实施例说明利用高聚物纳米颗粒包埋天然源药物的制备过程，其中高聚物以PLGA，天然源药物以MC和CAPE为例。
取聚乙烯醇加入纯水形成水相得3wt.％PVA，将27.5mg 1:1等质量混合的CAPE和MC 加入0.5mL乙醇溶液，与溶有100mg PLGA的1.5mL二氯甲烷溶液在乳化前混合形成有机相，将有机相与4mL水相混合采用超声乳化，超声时间为2min，功率为325W，超声间隔2s，乳化后磁力搅拌6h；洗涤过程采用1500r/min，离心5min，离心结束后取上层液体，再次离心，12000r/min，离心30min，结束后弃上层液体取下层白色固体，加入1mL纯水，重旋。最后冻干，得到包埋了天然源药物的PLGA纳米颗粒，并用于后续实施例中。
实施例2
本实施例说明纳米颗粒与桑树青枯抗体的偶联过程。
取质量比为1:1、4:1、9:1、1:4、1:9的EDC和NHS配制成5mg/mL的EDC和NHS混合溶液(溶液现配现用)，溶剂为50mmol/L的MES溶液，将纳米颗粒置于其中活化30min。离心收集纳米颗粒，离心时间5min，转速8000g。用pH＝7.0的PB溶液洗涤纳米颗粒一次，取等体积抗体与纳米颗粒溶液混合后加入连接反应液，重旋。室温条件下进行连接反应40 min，收集后用pH＝7.4的PBS缓冲溶液洗涤纳米颗粒一次，将纳米颗粒重旋到PBS缓冲溶液中。最后冻干制得偶联了桑树青枯抗体的纳米颗粒。将制得的纳米颗粒以4mg/mL、3.2 mg/mL、1.6mg/mL、0.8mg/mL、0.4mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL浓度稀释后对青枯劳尔氏菌进行抑菌作用，得到抑菌率结果如表1所示，药剂浓度从4-0.1mg/mL对青枯劳尔氏菌的抑制效果逐渐下降。当EDC与NHS的摩尔比为1:1，药剂浓度为4mg/mL时，PLGA复配纳米药剂对青枯劳尔氏菌的抑菌率为90.4％。
表1不同EDC与NHS比例下PLGA复配纳米药剂对青枯劳尔氏菌的抑菌率
Figure BDA0002423075940000051
实施例3
本实施例说明纳米颗粒与桑树青枯抗体的偶联过程。
取质量比为1:1的EDC和NHS配制成5mg/mL的EDC和NHS混合溶液(溶液现配现用)，溶剂为50mmol/L的MES溶液,将纳米颗粒置于其中分别活化10min、20min、30min、 40min、50min、60min。离心收集纳米颗粒，离心时间5min，转速8000g。用pH＝7.0的 PB溶液洗涤纳米颗粒一次，取等体积抗体与纳米颗粒溶液混合后加入连接反应液，重旋。室温条件下进行连接反应40min，收集后用pH＝7.4的PBS缓冲溶液洗涤纳米颗粒一次，将纳米颗粒重旋到PBS缓冲溶液中。最后冻干制得偶联了桑树青枯抗体的纳米颗粒。将制得的纳米颗粒以4mg/mL、3.2mg/mL、1.6mg/mL、0.8mg/mL、0.4mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL 浓度稀释后对青枯劳尔氏菌进行抑菌作用，得到抑菌率结果如表2所示，纳米颗粒活化10-60 min的情况下PLGA复配纳米药剂对青枯劳尔氏菌的抑菌效果先逐渐增强，然后逐渐降低。纳米颗粒活化时间30min，药剂浓度为4mg/mL时，PLGA复配纳米药剂对青枯劳尔氏菌的抑制率为92.26％。
表2不同纳米颗粒活化时间下PLGA复配纳米药剂对青枯劳尔氏菌的抑菌率
Figure BDA0002423075940000052
Figure BDA0002423075940000061
实施例4
本实施例说明纳米颗粒与桑树青枯抗体的偶联过程。
取质量比为1:1的EDC和NHS配制成5mg/mL的EDC和NHS混合溶液(溶液现配现用)，溶剂为50mmol/L的MES溶液，将纳米颗粒置于其中活化30min。离心收集纳米颗粒，离心时间5min，转速8000g。用pH＝7.0的PB溶液洗涤纳米颗粒一次，取等体积抗体与纳米颗粒溶液混合后加入连接反应液，重旋。室温条件下分别进行连接反应10min、20min、 30min、40min、50min、60min，收集后用pH＝7.4的PBS缓冲溶液洗涤纳米颗粒一次，将纳米颗粒重旋到PBS缓冲溶液中。最后冻干制得偶联了桑树青枯抗体的纳米颗粒。将制得的纳米颗粒以4mg/mL、3.2mg/mL、1.6mg/mL、0.8mg/mL、0.4mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL 浓度稀释后对青枯劳尔氏菌进行抑菌作用，得到抑菌率结果如表3所示，抗体与纳米颗粒偶联反应时间为40min，药剂浓度为4mg/mL时PLGA复配纳米药剂对青枯劳尔氏菌的抑制率为82.68％。
表3不同的抗体与纳米颗粒偶联反应的时间下PLGA复配纳米药剂对青枯劳尔氏菌的抑菌率
Figure BDA0002423075940000062
实施例5
本实施例说明纳米颗粒与桑树青枯抗体的偶联过程。
取质量比为1:1的EDC和NHS配制成5mg/mL的EDC和NHS混合溶液(溶液现配现用)，溶剂为50mmol/L的MES溶液,将纳米颗粒置于其中活化30。离心收集纳米颗粒，离心时间5min，转速8000g。用0.1mmol/L、pH＝8.0、pH＝7.5、pH＝7.0、pH＝6.5、pH＝6.0、 pH＝5.7的PB溶液洗涤纳米颗粒一次，取等体积抗体与纳米颗粒溶液混合后加入连接反应液，重旋。室温条件下进行连接反应40min，收集后用pH＝7.4的PBS缓冲溶液洗涤纳米颗粒2 次，将纳米颗粒重旋到PBS缓冲溶液中。最后冻干制得偶联了桑树青枯抗体的纳米颗粒。将制得的纳米颗粒以4mg/mL、3.2mg/mL、1.6mg/mL、0.8mg/mL、0.4mg/mL、0.2mg/mL、 0.1mg/mL浓度稀释后对青枯劳尔氏菌进行抑菌作用，得到抑菌率结果如表4所示，当PB缓冲溶液的pH为7.0且药剂浓度为4mg/mL时PLGA复方纳米药剂对青枯劳尔氏菌的抑制率为73.48％。
表4不同的PB缓冲溶液的pH下PLGA复配纳米药剂对青枯劳尔氏菌的抑菌率
Figure BDA0002423075940000071
实施例6
本实施例说明纳米颗粒与桑树青枯抗体的偶联过程。
取质量比为1:1的EDC和NHS配制成5mg/mL的EDC和NHS混合溶液(溶液现配现用)，溶剂为50mmol/L的MES溶液,将纳米颗粒置于其中活化30min。离心收集纳米颗粒，离心时间5min，转速8000g。用pH＝7.0的PB溶液洗涤纳米颗粒一次，取等体积稀释1000 倍的抗体与纳米颗粒溶液混合后加入连接反应液，重旋。室温条件下进行连接反应40min，收集后用pH＝7.4的PBS缓冲溶液洗涤纳米颗粒一次，将纳米颗粒重旋到PBS缓冲溶液中。最后冻干制得偶联了桑树青枯抗体的纳米颗粒。将制得的纳米颗粒以4mg/mL、3.2mg/mL、 1.6mg/mL、0.8mg/mL、0.4mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL浓度稀释后对青枯劳尔氏菌进行抑菌作用，得到抑菌率结果如表5所示，抗体稀释倍数为1000倍时PLGA复配纳米药剂对青枯劳尔氏菌的抑菌率为85.71％。
表5不同抗体稀释倍数下PLGA复配纳米药剂对青枯劳尔氏菌的抑菌率
抗体稀释倍数 1000 2000 4000 8000 16000
抑菌率(％) 85.71±1.15 80.01±0.42 77.8±1.00 78.29±1.31 75.03±1.34
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但本发明的保护范围并不局限于此，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

Claims (9)

1.青枯劳尔氏菌靶向纳米药剂的制备方法，其特征在于步骤为：按浓度1-500mg/ml将高聚物溶解于有机溶剂，将高聚物分散于有机溶剂中得高聚物溶液，所述高聚物为聚乳酸-羟基乙酸共聚物(Poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)、壳聚糖、PLA(polylacticacid)，PCL(poly(ε-caprolactum))、PEO(poly(ethylene oxide))、PEG(poly(ethyleneglycol))、PS(polystyrene)、PI(polyisoprene)中的至少一种，再将高聚物溶液与分散于无水乙醇中的复配咖啡酸或其酯类衍生物中的至少一种，按照体积比1:(6-2)混合作为有机相，表面活性剂与水混合构成水相，将有机相与水相按照体积比0.1-2混合，超声乳化形成白色乳液；搅拌使乳液中的有机溶剂挥发，离心收集纳米颗粒，重新悬浮于水中制成纳米粒分散体系，冻干成白色絮状；采用碳化二亚胺法，将单克隆抗体与纳米颗粒进行偶联，离心后重新悬浮于PBS中，PBS的pH值为5.7-8.0，得到青枯劳尔氏菌靶向纳米药剂。
2.根据权利要求1所述青枯劳尔氏菌靶向纳米药剂的制备方法，其特征在于所述咖啡酸酯类衍生物为咖啡酸甲酯(Methyl caffeate，MC)、咖啡酸乙酯(Ethyl caffeate，EC)、咖啡酸苯乙酯(Caffeic acid phenethyl ester，CAPE)咖啡酸酯丙酯(Propyl caffeate，PC)、咖啡酸异丙酯(Isopropyl caffeate,IpC)、咖啡酸丁酯(Butyl caffeate，BC)、咖啡酸戊酯(Amyl caffeate，AC)、咖啡酸异戊酯(Isoamyl caffeate，IaC)、咖啡酸己酯(Hexylcaffeate，HexC)、咖啡酸庚酯(Heptyl caffeate，HepC)或咖啡酸辛酯(Octyl caffeate，OCC)。
3.根据权利要求1所述青枯劳尔氏菌靶向纳米药剂的制备方法，其特征在于所述有机容剂为二氯甲烷、丙酮、乙醇、三氯甲烷、乙腈或四氢呋喃。
4.根据权利要求1所述青枯劳尔氏菌靶向纳米药剂的制备方法，其特征在于所述水相为表面活性剂与水溶液按照质量比1-10％比例的混合物，所述表面活性剂为PVA、Poloxamine 908、聚乙烯、Pluronic F-108、吐温80、吐温20或司盘20。
5.根据权利要求1所述青枯劳尔氏菌靶向纳米药剂的制备方法，其特征在于所述超声功率为65-650W，时间为1-15min。
6.根据权利要求1所述青枯劳尔氏菌靶向纳米药剂的制备方法，其特征在于所述碳化二亚胺法为：将碳化二亚胺类化合物和纳米颗粒按照质量比0.1-2混合，所述碳化二亚胺类化合物为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、1-环已基-2-吗啉乙基碳二亚胺(CMC)、N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)和N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)，再添加稳定剂，碳化二亚胺类化合物与稳定剂的摩尔比例为1/9-9/1，所述稳定剂为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)，得到活化的纳米颗粒，活化反应过程是在室温下搅拌反应5-10min，静置5-55min，然后加入对青枯劳尔氏菌具有特异性的单克隆抗体，单克隆抗体的稀释倍数为100-100000倍，偶联反应时间为10-60min，得偶联抗体的纳米颗粒。
7.根据权利要求1所述青枯劳尔氏菌靶向纳米药剂的制备方法，其特征在于所述单克隆抗体为经活体菌株免疫或杂交瘤构建制备出的对青枯劳尔氏菌具有特异性识别能力的单克隆抗体。
8.权利要求1-7任一所述制备方法制得的产物。
9.权利要求8所述产物在制备青枯劳尔氏菌靶向纳米产品中的应用。
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