CN111285938A - 九香虫粗多糖的提取方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种九香虫粗多糖的提取方法及其应用，提取粗多糖时，将已粉碎的九香虫粉使用沸程60～90℃的石油醚回流浸提，去除油脂，再将脱脂九香虫粉使用NaOH溶液加热回流，得到碱液提取物。将碱液提取物用乙醇沉淀，离心得到沉淀物后用无水乙醇洗涤，冷冻干燥得到粗多糖醇沉物，每10g九香虫脱脂虫粉可以至少提取多糖粗提物0.25g，通过苯酚‑硫酸法测定多糖样品的葡萄糖含量为20％，本方法简单易行，且提取粗多糖在体外有良好的抑制乳腺癌细胞增殖的效果。属于昆虫粗提物技术领域。

Description

九香虫粗多糖的提取方法及其应用
技术领域
本发明涉及九香虫粗多糖的提取方法及其应用，属于昆虫粗提物技术领域。
背景技术
九香虫Aspongopus chinensis Dallas,1851为半翅目Hemiptera兜蝽科Dinidoridae昆虫，俗称黑兜虫、瓜黑蝽、屁板虫、蜣螂虫、打屁虫和屁巴虫等，分布于贵州、安徽、福建、广东、江苏、江西、四川、上海、云南、西藏、中国台湾、越南、老挝、印尼、日本、缅甸、马来半岛及印度。2015年版中国药典，九香虫以药材和饮片类别写入，具理气止痛，温中助阳功效。
中药九香虫为九香虫干燥成体，始记载于《本草纲目》，“产于贵州永宁卫赤水河中……至惊蛰后即飞出，不可用矣。气味：咸，温，无毒，主治膈脘滞气，脾肾亏损，壮元阳”。九香虫配伍方药在临床上用于胃脘痛、子宫内膜异位症等多种疾病的治疗，也用于治疗癌痛，均有较好疗效。目前使用的九香虫多糖提取方法水提醇沉法能够提取到九香虫水溶性多糖，无法提取到其碱溶性多糖，实用性较差。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有抗肿瘤活性的九香虫粗多糖的提取方法，以解决现有九香虫提取方法仅能提取其水溶性多糖，无法提取到其碱溶性多糖，实用性较差的问题。
本发明的另一个目的在于提供一种具有抗肿瘤活性的九香虫粗多糖在抑制小鼠乳腺癌4T1和人乳腺癌HCC-1937细胞系增殖的应用。
为解决上述问题，拟采用这样一种九香虫粗多糖的提取方法，包括如下步骤：
1)九香虫的采集及预处理：将九香虫用清水清洗干净后，置于冰箱保存；
2)九香虫粗多糖提取：
A、将冰冻后的九香虫拿出，烘干水分后，将虫体粉碎，得到九香虫粉；
B、将九香虫粉以沸程为60～90℃的石油醚在60-90℃下回流提取2-5h，去除虫体油脂，得到脱脂九香虫粉；
C、使用NaOH溶液回流提取，提取液中即得到碱液总提取物，将碱溶液浓缩至一定体积，加入一定体积的乙醇，使混合后溶液的醇浓度在75％-85％，密封后于2-6℃静置8-12h沉淀多糖，离心得到沉淀物后，用无水乙醇洗涤，得到九香虫多糖碱液提取物，冷冻干燥，即得九香虫粗多糖。
上述步骤1)中，将九香虫用清水清洗干净后，置于-80℃冰箱保存；
上述步骤2)A中，将冰冻后的九香虫拿出后，放入60-80℃烘箱烘干8-12h；
上述步骤2)C中，使用0.1-0.4mol/L的NaOH溶液加热回流提取；
上述步骤2)C中，使用NaOH溶液加热回流提取温度为60-90℃；
上述步骤2)中，得到九香虫粗多糖后，将所得粗多糖加水溶解并用0.22μ m滤头过滤除菌，用于乳腺癌的体外实验。
所述九香虫粗多糖应用于体外抑制乳腺癌细胞增殖，具有很好的抑制效果。
与现有技术相比，本发明所述方法能够有效提取九香虫碱溶性多糖，简单易行，每10g九香虫脱脂粉末可以至少提取多糖粗提物0.25g，通过苯酚-硫酸法测定多糖样品的葡萄糖含量为20％，所提取的九香虫粗多糖在体外有良好的抑制乳腺癌细胞增殖的效果。
附图说明
图1为本发明的流程图；
图2为九香虫粗多糖对小鼠乳腺癌细胞4T1细胞活力的影响；
图3为九香虫粗多糖对人乳腺癌细胞HCC-1937细胞活力的影响。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
参照图1至图3，本实施例提供一种九香虫粗多糖的提取方法，包括如下步骤：
1)九香虫的采集及预处理：将九香虫用清水清洗干净后，置于-80℃冰箱保存；
2)九香虫粗多糖提取：
A、将冰冻后的九香虫拿出放入60-80℃烘箱烘干8-12h，烘干水分后，将虫体粉碎，得到九香虫粉。
B、将九香虫粉以沸程为60～90℃的石油醚回流提取，去除虫体油脂，得到脱脂九香虫粉。
C、使用0.1-0.4mol/L的NaOH溶液于60-90℃加热回流提取，提取液中即得到碱液总提取物，将碱溶液浓缩至一定体积，加入一定体积的乙醇，使混合后溶液的醇浓度在75％-85％，密封后于2-6℃静置8-12h沉淀多糖，洗涤并离心，得到九香虫多糖醇提物。
3)再将步骤2)获得的九香虫粗多糖在-80℃冰箱预冻12h以上，将预冻后的九香虫粗多糖放入真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥，获得九香虫粗多糖粉末。
冷冻干燥的温度为-35℃，采用培养皿，厚度为2mm，干燥时间为4-8h，冷冻干燥成冻干粉后，避光常温干燥条件下保存。
将提取的九香虫粗多糖应用于体外抑制乳腺癌细胞增殖。
为了进一步验证本发明的效果，申请人进行了如下实验：
九香虫多糖对乳腺癌细胞体外增殖的影响，培养小鼠乳腺癌细胞系4T1和人乳腺癌细胞HCC-1937，使用PBS溶液溶解上述实验步骤所提取的九香虫粗多糖粉末，用培养液将所溶解的多糖溶液分别稀释至浓度为0、2、4、6、8mg/mL，将所得多糖溶液使用0.22μm除菌滤头过滤除菌，分别用不同浓度的无菌多糖处理两种细胞系，采用MTT法和全波长酶标仪Multiskan GO测定570nm的吸光度值，计算细胞活力。结果显示，九香虫粗多糖可以抑制两种乳腺癌细胞的细胞增殖，并呈剂量依赖性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.九香虫粗多糖的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)九香虫的采集及预处理：将九香虫用清水清洗干净后，置于冰箱保存；
2)九香虫粗多糖提取：
A、将冰冻后的九香虫拿出，烘干水分后，将虫体粉碎，得到九香虫粉；
B、将九香虫粉以沸程为60～90℃的石油醚在60-90℃下回流提取2-5h，去除虫体油脂，得到脱脂九香虫粉；
C、使用NaOH溶液回流提取，提取液中即得到碱液总提取物，将碱溶液浓缩至一定体积，加入一定体积的乙醇，使混合后溶液的醇浓度在75％-85％，密封后于2-6℃静置8-12h沉淀多糖，离心得到沉淀物后，用无水乙醇洗涤，得到九香虫多糖碱液提取物，冷冻干燥，即得九香虫粗多糖。
2.根据权利要求1所述九香虫粗多糖的提取方法，其特征在于：步骤1)中，将九香虫用清水清洗干净后，置于-80℃冰箱保存。
3.根据权利要求1所述九香虫粗多糖的提取方法，其特征在于：步骤2)A中，将冰冻后的九香虫拿出后，放入60-80℃烘箱烘干6-12h。
4.根据权利要求1所述九香虫粗多糖的提取方法，其特征在于：步骤2)C中，使用0.1-0.4mol/L的NaOH溶液加热回流提取。
5.根据权利要求4所述九香虫粗多糖的提取方法，其特征在于：步骤2)C中，使用NaOH溶液加热回流提取温度为60-90℃。
6.根据权利要求1所述九香虫粗多糖的提取方法，其特征在于：步骤2)中，得到九香虫粗多糖后，将所得粗多糖加水溶解并用0.22μm滤头过滤除菌。
7.九香虫粗多糖的应用，其特征在于：九香虫粗多糖应用于体外抑制乳腺癌细胞增殖。
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