CN111249531A - 一种高活性植物酶制备胶原蛋白支架的方法 - Google Patents

一种高活性植物酶制备胶原蛋白支架的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高活性植物酶制备胶原蛋白支架的方法，主要包括浸泡清洁剂、酸膨胀、去表皮、脱脂、脱细胞、透析、真空干燥处理和双水相纯化等步骤。本发明方法在制备材料时不使用常规的酸碱法，而是用更加温和的酶法，且完全使用植物酶，减少胶原结构的破坏。首次使用双水相纯化对产品进行纯化，双水相纯化能够达到清除“边角料”的功效，使得得到的材料杂质更少，更加干净。

Description

一种高活性植物酶制备胶原蛋白支架的方法
技术领域
本发明涉及生物支架材料制备技术领域，具体涉及一种高活性植物酶制备胶原蛋白支架的方法。
背景技术
大面积深度烧伤创面修复的难题是供皮区的资源紧张以及创面愈合时间长，创面的长时间不愈合会导致机体免疫能力降低、水电解质平衡紊乱甚至会导致多器官衰竭危及生命。因此，尽早使创面愈合是救治的关键。微粒皮移植技术是目前救治大面积烧伤创面修复最好的方法之一。微粒皮移植后需要覆盖物的保护，以防止细菌感染和营养成分的流失，提供微粒皮生长的良好环境。因此，覆盖物的选择对创面修复效果至关重要。
目前，覆盖物的选择大多是异种皮。异种皮制备方法较多，选择余地较大，异种皮最常用的是脱细胞猪皮，因为猪皮从组织结构上较接近人的皮肤，胶原成分、含量与人体皮肤相似，猪皮在粘附性、止血性能、减轻疼痛等方面也与人体皮肤相近。同时，研究表明，脱细胞猪皮的结构是胶原蛋白纤维体。因此，其胶原蛋白物覆盖在创面上可以起到与人体皮肤相似的保护作用，是同种异体皮肤较理想的替代物。
脱细胞胶原蛋白纤维体的传统制作方法有三种：第一种是酶消化-去污剂法：在4℃或者37℃条件下，利用外源性蛋白酶(如胰酶或DispaseII)作用去除表皮结构，再辅助去污剂处理得到胶原蛋白纤维体。第二种是高渗盐-去污剂法：利用高渗盐NaCl溶液使锚着细丝与表皮基底细胞的半桥粒分离，完整去除表皮，再用去污剂SDS处理使真皮无细胞化。这两种方法中应用的去污剂(例如SDS、磷脂酰胆碱)具有极强的细胞裂解作用，且难以彻底洗除，会降低创面复合移殖物的成活率。第三类是平衡盐溶液法：将无菌皮片放置于37℃磷酸缓冲盐溶液中，使皮肤内源性蛋白酶激活，从而分离表皮和真皮，再用反复冻融、伽马射线照射等方法去除全部真皮内存活细胞。该方法的缺点是处理时间过长，操作时容易引起污染，整个过程比较复杂。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明提供一种高活性植物酶制备胶原蛋白支架的方法，该方法将传统的动物酶替换成植物酶，将化学试剂改变成脂肪酶，并使用双水相纯化，能够将胶原蛋白的结构完整保留，并且容易洗涤，处理时间较短。相对于传统方法而言得到的产品有较好的生物相容性以及更好的移植成活率。
本发明采取的技术方案如下：
一种高活性植物酶制备胶原蛋白支架的方法，包括以下步骤：
1)浸泡清洁剂
将新鲜猪皮浸泡在清洁剂中1.5～2.5h，取出后用超纯水清洗；
2)酸膨胀
按料液比1g:(20～25)ml，将步骤1)处理后的猪皮浸泡于体积浓度20～25％的冰乙酸中，浸泡结束后弃掉废液，然后用PBS和超纯水分别至少清洗两次；
3)去表皮
将膨胀清洗后猪皮去表皮，只保留真皮部分，超纯水清洗，-30～-40℃保藏备用；
4)脱脂
加入表面活性剂，配置木瓜脂肪酶水溶液，酶与表面活性剂的质量比为1:(1.5～2.0)，得脱脂液；按料液比1g:(3～4)ml，将步骤3)所得真皮与脱脂液搅拌混合0.5～2h，弃废液，用PBS和超纯水分别至少清洗两次；
5)脱细胞
按料液比1g:(20～30)ml，将步骤4)所得物料与复合酶液混合搅拌2～3.5h，弃废液，用PBS和超纯水分别至少清洗两次；所述复合酶包括木瓜蛋白酶和木瓜脂肪酶；
6)透析处理
将步骤5)处理过后的脱细胞真皮放入透析袋中，浸泡在超纯水中进行1～3天透析，去除真皮上的酶附着，每2～2.5h更换超纯水一次；取出脱细胞真皮后在-30～-40℃预冻2～3天；
7)真空冷冻干燥处理
将预冻后的脱细胞真皮取出进行冻干处理后取出，保存在干燥箱中；
8)双水相纯化脱细胞真皮
将PEG4000、(NH4)2SO4与水混合，之后加入步骤7)处理后的脱细胞真皮，搅拌混合，之后静置分层，得产品。
优选的，步骤2)，浸泡温度35～45℃，浸泡时间8～10h，每3～4h换一次乙酸。
优选的，步骤4)，脱脂液中木瓜脂肪酶的活力为(1～1.2)U/ml。
优选的，所述表面活性剂为TritonX-100。
优选的，步骤5)，复合酶液中木瓜蛋白酶和木瓜脂肪酶的活力均为(1～1.2)U/ml。
优选的，步骤7)，冻干温度-80℃，冻干时间48h。
优选的，步骤8)，搅拌混合20～30min。
优选的，步骤8)，PEG4000、(NH4)2SO4与水混合，其中，PEG4000的质量浓度为46～48％，(NH4)2SO4的质量浓度为48～50％，余量为水。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明方法在制备材料时不使用常规的酸碱法，而是用更加温和的酶法，且完全使用植物酶，减少胶原结构的破坏。
(2)发明首次使用双水相纯化对产品进行纯化，双水相纯化能够达到清除“边角料”的功效，使得得到的材料杂质更少，更加干净。
附图说明
图1为原始猪皮；
图2为对比例1处理后所得产品；
图3为实施例1处理后所得产品。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
实施例1
一种高活性植物酶制备胶原蛋白支架的方法，包括以下步骤：
1)浸泡清洁剂
将新鲜猪皮浸泡在清洁剂中1.5h，取出后用超纯水清洗；
2)酸膨胀
按料液比1g:20ml，将步骤1)处理后的猪皮浸泡于体积浓度20％的冰乙酸中，浸泡结束后弃掉废液，然后用PBS和超纯水分别至少清洗两次；浸泡温度35℃，浸泡时间8h，每3h换一次乙酸
3)去表皮
将膨胀清洗后猪皮去表皮，只保留真皮部分，超纯水清洗，-30℃保藏备用；
4)脱脂
加入表面活性剂，配置木瓜脂肪酶水溶液，酶与表面活性剂的质量比为1:1.5，得脱脂液；按料液比1g:3ml，将步骤3)所得真皮与脱脂液搅拌混合0.5h，弃废液，用PBS和超纯水分别至少清洗两次；脱脂液中木瓜脂肪酶的活力为(1～1.2)U/ml。
5)脱细胞
按料液比1g:20ml，将步骤4)所得物料与复合酶液混合搅拌2h，弃废液，用PBS和超纯水分别至少清洗两次；所述复合酶包括木瓜蛋白酶和木瓜脂肪酶；复合酶液中木瓜蛋白酶和木瓜脂肪酶的活力均为(1～1.2)U/ml
6)透析处理
将步骤5)处理过后的脱细胞真皮放入透析袋中，浸泡在超纯水中进行至少3天透析，去除真皮上的酶附着，每2h更换超纯水一次；取出脱细胞真皮后在-30℃预冻2天；
7)真空冷冻干燥处理
将预冻后的脱细胞真皮取出进行冻干处理后取出，保存在干燥箱中；
8)双水相纯化脱细胞真皮
将PEG4000、(NH4)2SO4与水混合，其中，PEG4000的质量浓度为46％，(NH4)2SO4的质量浓度为48％，余量为水。之后加入步骤7)处理后的脱细胞真皮，搅拌混合20min，之后静置分层，得产品。
实施例2
一种高活性植物酶制备胶原蛋白支架的方法，包括以下步骤：
1)浸泡清洁剂
将新鲜猪皮浸泡在清洁剂中2.5h，取出后用超纯水清洗；
2)酸膨胀
按料液比1g:25)ml，将步骤1)处理后的猪皮浸泡于体积浓度25％的冰乙酸中，浸泡结束后弃掉废液，然后用PBS和超纯水分别至少清洗两次；浸泡温度45℃，浸泡时间10h，每4h换一次乙酸
3)去表皮
将膨胀清洗后猪皮去表皮，只保留真皮部分，超纯水清洗，-40℃保藏备用；
4)脱脂
加入表面活性剂，配置木瓜脂肪酶水溶液，酶与表面活性剂的质量比为1:2.0，得脱脂液；按料液比1g:4ml，将步骤3)所得真皮与脱脂液搅拌混合2h，弃废液，用PBS和超纯水分别至少清洗两次；脱脂液中木瓜脂肪酶的活力为(1～1.2)U/ml。
5)脱细胞
按料液比1g:30ml，将步骤4)所得物料与复合酶液混合搅拌2.5h，弃废液，用PBS和超纯水分别至少清洗两次；所述复合酶包括木瓜蛋白酶和木瓜脂肪酶；复合酶液中木瓜蛋白酶和木瓜脂肪酶的活力均为(1～1.2)U/ml
6)透析处理
将步骤5)处理过后的脱细胞真皮放入透析袋中，浸泡在超纯水中进行至少3天透析，去除真皮上的酶附着，每2.5h更换超纯水一次；取出脱细胞真皮后在-40℃预冻3天；
7)真空冷冻干燥处理
将预冻后的脱细胞真皮取出进行冻干处理后取出，保存在干燥箱中；
8)双水相纯化脱细胞真皮
将PEG4000、(NH4)2SO4与水混合，PEG4000的质量浓度为48％，(NH4)2SO4的质量浓度为50％，余量为水。之后加入步骤7)处理后的脱细胞真皮，搅拌混合30min，之后静置分层，得产品。
对比例1
对比例1与实施例1的主要区别是：未进行双水相纯化处理。
实验例：
将实施例与对比例试样按照扫描电镜样品的制作程序制作成扫描电镜样品，用扫描电镜观察试样微观结构。图1为原始猪皮，图2为对比例1处理后所得产品，图3为实施例1处理后所得产品。结果显示，采用本发明方法处理后的产品包含大量呈交错排列的胶原纤维，表面无明显细胞碎裂残片，说明本发明脱细胞的效果良好。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims (8)

1.一种高活性植物酶制备胶原蛋白支架的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)浸泡清洁剂
将新鲜猪皮浸泡在清洁剂中1.5～2.5h，取出后用超纯水清洗；
2)酸膨胀
按料液比1g:(20～25)ml，将步骤1)处理后的猪皮浸泡于体积浓度20～25％的冰乙酸中，浸泡结束后弃掉废液，然后用PBS和超纯水分别至少清洗两次；
3)去表皮
将膨胀清洗后猪皮去表皮，只保留真皮部分，超纯水清洗，-30～-40℃保藏备用；
4)脱脂
加入表面活性剂，配置木瓜脂肪酶水溶液，酶与表面活性剂的质量比为1:(1.5～2.0)，得脱脂液；按料液比1g:(3～4)ml，将步骤3)所得真皮与脱脂液搅拌混合0.5～2h，弃废液，用PBS和超纯水分别至少清洗两次；
5)脱细胞
按料液比1g:(20～30)ml，将步骤4)所得物料与复合酶液混合搅拌2～3.5h，弃废液，用PBS和超纯水分别至少清洗两次；所述复合酶包括木瓜蛋白酶和木瓜脂肪酶；
6)透析处理
将步骤5)处理过后的脱细胞真皮放入透析袋中，浸泡在超纯水中进行1～3天透析，去除真皮上的酶附着，每2～2.5h更换超纯水一次；取出脱细胞真皮后在-30～-40℃预冻2～3天；
7)真空冷冻干燥处理
将预冻后的脱细胞真皮取出进行冻干处理后取出，保存在干燥箱中；
8)双水相纯化脱细胞真皮
将PEG4000、(NH4)2SO4与水混合，之后加入步骤7)处理后的脱细胞真皮，搅拌混合，之后静置分层，得产品。
2.根据权利要求1所述的高活性植物酶制备胶原蛋白支架的方法，其特征在于，步骤2)，浸泡温度35～45℃，浸泡时间8～10h，每3～4h换一次乙酸。
3.根据权利要求1所述的高活性植物酶制备胶原蛋白支架的方法，其特征在于，步骤4)，脱脂液中木瓜脂肪酶的活力为(1～1.2)U/ml。
4.根据权利要求1所述的高活性植物酶制备胶原蛋白支架的方法，其特征在于，所述表面活性剂为TritonX-100。
5.根据权利要求1所述的高活性植物酶制备胶原蛋白支架的方法，其特征在于，步骤5)，复合酶液中木瓜蛋白酶和木瓜脂肪酶的活力均为(1～1.2)U/ml。
6.根据权利要求1所述的高活性植物酶制备胶原蛋白支架的方法，其特征在于，步骤7)，冻干温度-80℃，冻干时间48h。
7.根据权利要求1所述的高活性植物酶制备胶原蛋白支架的方法，其特征在于，步骤8)，搅拌混合20～30min。
8.根据权利要求1所述的高活性植物酶制备胶原蛋白支架的方法，其特征在于，步骤8)，PEG4000、(NH4)2SO4与水混合，其中，PEG4000的质量浓度为46～48％，(NH4)2SO4的质量浓度为48～50％，余量为水。
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