CN111249535A - 一种制备生医支架处理剂的配方 - Google Patents

一种制备生医支架处理剂的配方 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种制备生医支架处理剂的配方，其主要包括木瓜蛋白酶1～100份和木瓜脂肪酶1～100份；和/或，菠萝蛋白酶1～100份和菠萝脂肪酶1～100份；还包括：界面活性剂、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠等成分。采用本发明处理剂，在处理过程中全部使用植物酶，能够将胶原蛋白的结构完整保留，并且容易洗涤，处理时间较短。

Description

一种制备生医支架处理剂的配方
技术领域
本发明涉及生物支架材料制备技术领域，具体涉及一种制备生医支架处理剂的配方。
背景技术
目前，脱细胞胶原蛋白纤维体的传统制作方法有三种：第一种是酶消化-去污剂法：在4℃或者37℃条件下，利用外源性蛋白酶(如胰酶或DispaseII)作用去除表皮结构，再辅助去污剂处理得到胶原蛋白纤维体。第二种是高渗盐-去污剂法：利用高渗盐NaCl溶液使锚着细丝与表皮基底细胞的半桥粒分离，完整去除表皮，再用去污剂SDS处理使真皮无细胞化。这两种方法中应用的去污剂(例如SDS、磷脂酰胆碱)具有极强的细胞裂解作用，且难以彻底洗除，会降低创面复合移殖物的成活率。第三类是平衡盐溶液法：将无菌皮片放置于37℃磷酸缓冲盐溶液中，使皮肤内源性蛋白酶激活，从而分离表皮和真皮，再用反复冻融、伽马射线照射等方法去除全部真皮内存活细胞。该方法的缺点是处理时间过长，操作时容易引起污染，整个过程比较复杂。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明提供一种制备生医支架处理剂的配方，将传统的动物酶替换成植物酶，能够将胶原蛋白的结构完整保留，并且容易洗涤，处理时间较短。相对于传统方法而言得到的产品有较好的生物相容性以及更好的移植成活率。
本发明采取的技术方案如下：
一种制备生医支架处理剂的配方，按重量份计，包括以下成分：
木瓜蛋白酶1～100份和木瓜脂肪酶1～100份；
和/或，菠萝蛋白酶1～100份和菠萝脂肪酶1～100份；
还包括：
界面活性剂 0～0.5份，
磷酸二氢钠 0～20份，
磷酸氢二钠 0～20份。
优选的，所述界面活性剂为TritionX-100。
为了更简便、快速的得到高活性的植物脂肪酶，本发明提供了以下方法：
木瓜脂肪酶由以下方法制得：称取木瓜酶粗酶100g，加入400～450ml100～120mM pH7.2～7.5磷酸缓冲液，在冰水中缓慢搅拌30～35min后，取出在10000～12000rpm 4～5℃下离心10～15min，去除上清液，将沉淀继续加入磷酸缓冲液，上述操作重复至少3次；收集沉淀于-35～-40℃冷藏12～14h，于-70～-80℃下冷冻干燥48～50h，得到木瓜脂肪酶酶粉。
菠萝脂肪酶由以下方法制得：称取粗酶50g，加入300～350ml 100～120mM pH6.5～6.8磷酸缓冲液，在冰水中缓慢搅拌50～60min后，取出在10000～12000rpm4～5℃下离心15～20min，去除上清液，将沉淀继续加入磷酸缓冲液，上述操作重复至少3次；收集沉淀于-35～-40℃冷藏12～13h，于-70～-80℃下冷冻干燥48～50h，得到菠萝脂肪酶酶粉。
优选的，本发明处理剂中，木瓜蛋白酶：木瓜脂肪酶：菠萝蛋白酶：菠萝脂肪酶：界面活性剂：磷酸二氢钠：磷酸氢二钠的质量比为20：20：10：10：5：3：1。
优选的，木瓜蛋白酶的活性为500～1000U/mg。木瓜脂肪酶活性为1000～2000U/mg。菠萝蛋白酶的活性为800～1000U/mg。菠萝脂肪酶的活性为1000～2000U/mg。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1)本发明以纯天然的植物酶为处理剂，开发了一种用于制备生医支架的植物酶-离子复合处理剂，改变传统处理方法，不使用现有的关键技术，在处理过程中全部使用植物酶，能够将胶原蛋白的结构完整保留，并且容易洗涤，处理时间较短。相对于传统方法而言得到的产品有较好的生物相容性以及更好的移植成活率。
2)本发明处理剂中加入磷酸氢二钠和磷酸二氢钠可将脱细胞处理时间缩短至0.3h，透析处理时间缩短至1天。
附图说明
图1为本发明实施例1处理剂处理所得试样的扫描电镜图；
图2为本发明对比例1处理剂处理所得试样的扫描电镜图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
实施例1-10
一种制备生医支架处理剂的配方，各成分重量份配比如表1所示。
表1
Figure BDA0002373747270000031
木瓜蛋白酶的活性为1000U/mg，木瓜脂肪酶活性为2000U/mg，菠萝蛋白酶的活性为1000U/mg，菠萝脂肪酶的活性为2000U/mg。
木瓜脂肪酶由以下方法制得：称取木瓜酶粗酶100g，加入400ml 100mM pH7.5磷酸缓冲液，在冰水中缓慢搅拌30min后，取出在10000rpm 4～5℃下离心10min，去除上清液，将沉淀继续加入磷酸缓冲液，上述操作重复至少3次；收集沉淀于-40℃冷藏12h，于-80℃下冷冻干燥48h，得到活性为2000U/mg的木瓜脂肪酶酶粉。
菠萝脂肪酶由以下方法制得：称取粗酶50g，加入300ml 100mM pH6.5磷酸缓冲液，在冰水中缓慢搅拌50min后，取出在10000rpm 4～5℃下离心15min，去除上清液，将沉淀继续加入磷酸缓冲液，上述操作重复至少3次；收集沉淀于-40℃冷藏12h，于-80℃下冷冻干燥48h，得到活性为2000U/mg的菠萝脂肪酶酶粉。
实施例11
实施例11与实施例9的区别是：
木瓜脂肪酶由以下方法制得：称取木瓜酶粗酶100g，加入450ml 120mM pH7.2磷酸缓冲液，在冰水中缓慢搅拌35min后，取出在12000rpm 4～5℃下离心15min，去除上清液，将沉淀继续加入磷酸缓冲液，上述操作重复至少3次；收集沉淀于-35℃冷藏14h，于-70℃下冷冻干燥50h，得到木瓜脂肪酶酶粉。
菠萝脂肪酶由以下方法制得：称取粗酶50g，加入350ml 120mM pH6.8磷酸缓冲液，在冰水中缓慢搅拌60min后，取出在12000rpm 4～5℃下离心20min，去除上清液，将沉淀继续加入磷酸缓冲液，上述操作重复至少3次；收集沉淀于-35℃冷藏13h，于-70℃下冷冻干燥50h，得到菠萝脂肪酶酶粉。
木瓜蛋白酶的活性为500U/mg，木瓜脂肪酶活性为1000U/mg，菠萝蛋白酶的活性为800U/mg，菠萝脂肪酶的活性为1000U/mg。
对比例1
对比例1与实施例1的区别在于，使用的是胃蛋白酶和脂肪酶(猪胰)，胃蛋白酶的活性是1000U/mg，脂肪酶的活性是2000U/mg。
实施例与对比例中，处理剂的使用方法是：
1)浸泡清洁剂
将新鲜猪皮浸泡在清洁剂中2h，取出后用超纯水清洗2次；
2)酸膨胀
按料液比1g:20ml，将步骤1)处理后的猪皮浸泡于体积浓度20％的冰乙酸中，浸泡结束后弃掉废液，然后用PBS和超纯水分别至少清洗两次；浸泡温度35℃，浸泡时间10h，每3h换一次乙酸。
3)去表皮
将膨胀清洗后猪皮去表皮，只保留真皮部分，超纯水清洗，-40℃保藏备用；
4)脱脂
加入表面活性剂TritonX-100，配置木瓜脂肪酶水溶液，酶与表面活性剂的质量比为1:2.0，得脱脂液；按料液比1g:4ml，将步骤3)所得真皮与脱脂液搅拌混合2h，弃废液，用PBS和超纯水分别清洗两次；脱脂液中木瓜脂肪酶的活力为1U/ml。
5)脱细胞
按料液比1g:20ml，将步骤4)所得物料与处理剂水溶液混合搅拌，弃废液，用PBS和超纯水分别清洗两次；处理剂水溶液中蛋白酶的活力为3～5U/ml，脂肪酶的活力为1～2.5U/ml。
6)透析处理
将步骤5)处理过后的脱细胞真皮放入透析袋中，浸泡在超纯水中进行透析，去除真皮上的酶附着，每2h更换超纯水一次；取出脱细胞真皮后在-40℃预冻2天；
7)真空冷冻干燥处理
将预冻后的脱细胞真皮取出进行冻干处理后取出，保存在干燥箱中；冻干温度-80℃，冻干时间48h。
实验例：
1、将实施例与对比例处理剂处理后的试样按照扫描电镜样品的制作程序制作成扫描电镜样品，用扫描电镜观察试样微观结构。结果见图1和图2。图1为实施例1试样的扫描电镜图，图2为对比例1试样的扫描电镜图。结果显示，本发明处理剂处理后的试样均能保持较为完整的胶原纤维网络结构。
2、经统计，在相似处理效果且满足移植成活率大于80％的情况下，各实施例和对比例所需的脱细胞处理时间和透析处理时间分别如下：
Figure BDA0002373747270000051
Figure BDA0002373747270000061
结果显示，采用本发明处理剂，不仅能够将胶原蛋白的结构完整保留，并且容易洗涤，处理时间较短。对比实施例3和实施例4结果可知，加入磷酸氢二钠和磷酸二氢钠可将脱细胞处理时间由2h缩短至1h，透析处理时间由2.5天缩短至2天。采用实施例9的配方，脱细胞处理时间可缩短至0.3h，透析处理时间可缩短至1天。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims (9)

1.一种制备生医支架处理剂的配方，其特征在于，按重量份计，包括以下成分：
木瓜蛋白酶1～100份和木瓜脂肪酶1～100份；
和/或，菠萝蛋白酶1～100份和菠萝脂肪酶1～100份；
还包括：
界面活性剂 0～0.5份，
磷酸二氢钠 0～20份，
磷酸氢二钠 0～20份。
2.根据权利要求1所述的制备生医支架处理剂的配方，其特征在于，所述界面活性剂为TritionX-100。
3.根据权利要求1所述的制备生医支架处理剂的配方，其特征在于，木瓜脂肪酶由以下方法制得：称取木瓜酶粗酶100g，加入400～450ml 100～120mMpH7.2～7.5磷酸缓冲液，在冰水中缓慢搅拌30～35min后，取出在10000～12000rpm4～5℃下离心10～15min，去除上清液，将沉淀继续加入磷酸缓冲液，上述操作重复至少3次；收集沉淀于-35～-40℃冷藏12～14h，于-70～-80℃下冷冻干燥48～50h，得到木瓜脂肪酶酶粉。
4.根据权利要求1所述的制备生医支架处理剂的配方，其特征在于，菠萝脂肪酶由以下方法制得：称取粗酶50g，加入300～350ml 100～120mM pH6.5～6.8磷酸缓冲液，在冰水中缓慢搅拌50～60min后，取出在10000～12000rpm 4～5℃下离心15～20min，去除上清液，将沉淀继续加入磷酸缓冲液，上述操作重复至少3次；收集沉淀于-35～-40℃冷藏12～13h，于-70～-80℃下冷冻干燥48～50h，得到菠萝脂肪酶酶粉。
5.根据权利要求1所述的制备生医支架处理剂的配方，其特征在于，木瓜蛋白酶：木瓜脂肪酶：菠萝蛋白酶：菠萝脂肪酶：界面活性剂：磷酸二氢钠：磷酸氢二钠的质量比为20：20：10：10：5：3：1。
6.根据权利要求1所述的制备生医支架处理剂的配方，其特征在于，木瓜蛋白酶的活性为500～1000U/mg。
7.根据权利要求1所述的制备生医支架处理剂的配方，其特征在于，木瓜脂肪酶活性为1000～2000U/mg。
8.根据权利要求1所述的制备生医支架处理剂的配方，其特征在于，菠萝蛋白酶的活性为800～1000U/mg。
9.根据权利要求1所述的制备生医支架处理剂的配方，其特征在于，菠萝脂肪酶的活性为1000～2000U/mg。
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