CN111249280A - 9-氨基吖啶的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及9‑氨基吖啶的应用，尤其涉及9‑氨基吖啶在制备治疗缺血性脑卒中药物的用途，属于医药技术领域。本发明在筛选出潜在的用于脑卒中治疗的药物的基础上，进一步研制治疗脑卒中的药物制剂。本发明包括具有脑靶向和长循环两种功能的脂质体，其组成部分包括磷脂、胆固醇、PEG功能化磷脂、脑靶向多肽。本发明还包括包载9‑氨基吖啶(9‑AA)的脂质体，以磷脂酰胆碱和胆固醇为主体，附加DSPE‑MPEG2000、DSPE‑MPEG2000‑SH两种功能化磷脂和cRGDyk靶向多肽。本发明的具有长循环和脑靶向双功能的脂质体，可以显著延长9‑AA的半衰期，增加9‑AA在脑损伤部位的浓度，提高药物的生物利用度。同时，脂质体减少9‑AA造成的肺损伤，减轻了不良反应，使得9‑AA用于缺血性脑损伤的治疗成为可能。

Description

9-氨基吖啶的应用
技术领域
本发明涉及9-氨基吖啶的应用，尤其涉及9-氨基吖啶在制备治疗缺血性脑卒中药物的用途，属于医药技术领域。
背景技术
缺血性脑卒中是一种脑血管疾病，具有高发病率、高复发率和高死亡率的特点，严重危害人类健康1。美国食品药品监督管理局(FDA)仅批准了重组人组织型纤溶酶原激活剂(tPA)这一款药物，用于缺血性脑卒中的溶栓治疗。tPA必须在患者发病3-4.5h内给药，且伴有颅内出血的风险，因此很少有患者可从中受益2。对于缺血性脑卒中的治疗，开发新的药物或新的制剂迫在眉睫。缺血性脑损伤会激活脑部驻留的小胶质细胞和浸润的巨噬细胞3。活化的小胶质细胞/巨噬细胞在损伤区可以通过在促炎和抗炎激活状态之间进行切换4。促炎激活状态的小胶质细胞/巨噬细胞会产生多种促炎因子，包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，白介素-1β(IL-1β)，IL-6和环氧合酶2(COX-2)，它们会进一步加重缺血后损伤区域的神经炎症。而它们的抗炎激活状态可以产生抗炎因子，例如IL-4和IL-10，防止神经炎症和神经细胞死亡，促进组织重塑和修复，因此，在亚急性期将小胶质细胞/巨噬细胞调节为抗炎激活状态是一种非常有希望的治疗方法。研究指出，多种信号通路参与了缺血后小胶质细胞/巨噬细胞的活化。孤核受体是指没有配体或者尚未发现配体的核受体，其中，孤核受体NR4A1(核受体亚家族4，A组成员1)在多种炎症疾病中调节小胶质和巨噬细胞的活化5。NR4A1的激动剂可以减少促炎因子的产生，从而保护神经元细胞6。老药新用是近年来比较热门的研究方向，在老药的原适应症以外开发新用途，减少药物研发的成本和时间，使患者尽早受益。随着科学技术的进步和研究的深入，目前对于缺血性脑卒中的发病机制有了更深的了解。但是，目前临床上获批的药物还是仅有tPA一种。如果治疗不及时，极易留下后遗症或是造成死亡。缺血性脑卒中依然威胁着人类的健康。随着对脑缺血损伤机制的逐步深入，神经炎症因其持续时间长，作用范围广，同时具有促修复的双面功能，被新药研发者重点关注，新型神经炎症调控药物的发现，有望为缺血性脑卒中的治疗带来更多的可能。孤核受体NR4A1是一类尚未发现内源性配体的受体。有研究指出NR4A1可以转移至线粒体，与Bcl-2结合促进细胞凋亡；也有研究发现NR4A1可以在细胞核内充当转录因子，调节下游基因的表达；此外，还能对其他转录因子产生影响，起到共激活因子或共抑制因子的作用。所以，目前药物调控NR4A1的策略主要以影响它的表达水平为主，有多项研究指出提高NR4A1的表达可以抑制免疫细胞的炎症反应。因此，如何在已上市的药物中筛选出NR4A1的激动剂，并制备出合适的制剂用于缺血性脑卒中的治疗或成为新的研究方向。
参考文献：
1.Hankey GJ.Stroke.Lancet.2017；389:641-54.
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3.Hu X,Li P,Guo Y,Wang H,Leak RK,Chen S,et al.Microglia/macrophagepolarization dynamics reveal novel mechanism of injury expansion after focalcerebral ischemia.Stroke.2012；43:3063-70.
4.Hu XM,Leak RK,Shi YJ,Suenaga J,Gao YQ,Zheng P,et al.Microglial andmacrophage polarization—new prospects for brain repair.Nat Rev Neurol.2015；11:56-64.
5.Hanna RN,Shaked I,Hubbeling HG,Punt JA,Wu RP,Herrley E,et al.NR4A1(Nur77)deletion polarizes macrophages toward an inflammatory phenotype andincreases atherosclerosis.Circ Res.2012；110:416-27.
6.Liu TY,Yang XY,Zheng LT,Wang GH,Zhen XC.Activation of Nur77inmicroglia attenuates proinflammatory mediators production and protectsdopaminergic neurons from inflammation-induced cell death.J Neurochem.2017；140:589-604.
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的缺陷，提出一种NR4A1的激动剂，以及该激动剂在制备用于治疗缺血性脑卒中的药物的应用。
本发明的首要目的是选择合适的NR4A1激动剂，为实现该目的，首先建立筛选模型对FDA上市药化合物库进行随机筛选，找寻合适的NR4A1激动剂。再对目标药物进行药剂学的改造，实现增效减毒的目的，使其成为一种潜在的用于脑卒中治疗的药物。
NR4A1激动剂的筛选基于荧光素酶报告基因筛选体系，利用NR4A1启动子的报告基因建立筛选模型，进行初筛。然后，对于筛选出的活性药物利用MTT实验进行复筛。
上述筛选的初筛化合物选自FDA批准上市的一千多种活性化合物。复筛化合物选自伏立诺他、多西紫杉醇、达沙替尼、阿霉素、表阿霉素、噻苯达唑、米托蒽醌、柔红霉素、9-氨基吖啶(9-AA)。
研究发现9-氨基吖啶是上调NR4A1表达的化合物。目前9-AA只被批准用作局部抗感染和防腐剂。另有其衍生物被批准用于治疗阿尔兹海默症(商品名：他克林)，而临床使用过程中发现，他克林容易造成肝毒性和消化道反应。由此推测，并不能直接将9-AA作为治疗脑卒中的药物。
本发明在筛选出潜在的用于脑卒中治疗的药物的基础上，进一步研制治疗脑卒中的药物。具体技术方案如下：
本发明先提供一种具有脑靶向和长循环两种功能的脂质体，其组成部分包括磷脂、胆固醇、PEG功能化磷脂、脑靶向多肽，所述磷脂和胆固醇的摩尔比为20:1-4:1；磷脂和PEG功能化磷脂的摩尔比为40:1-10:1；磷脂和脑靶向多肽的摩尔比为80:1-10:1；9-氨基吖啶和脂质的质量比为1:100-5:100。
进一步地，所述磷脂选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、心磷脂、鞘磷脂或鞘糖脂。
进一步地，所述PEG功能化磷脂选自二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-mPEG2000)、DSPE-PEG5000-N3、DSPE-PEG2000-N3、DSPE-PEG5000-SH、DSPE-PEG2000-SH、DSPE-PEG5000-NH2、DSPE-PEG2000-NH2、DSPE-PEG5000-COOH、DSPE-PEG2000-COOH、DSPE-PEG5000-OH。
进一步地，所述脑靶向多肽包括中风归巢肽(CLEVSRKNC)、狂犬病病毒糖蛋白29肽(RVG29)、促BBB转胞吞多肽(Angiopep-2)、转铁蛋白靶向肽(T7)、神经激肽-1受体接合肽(substance P)、整合素靶向多肽(cRGDyk)中的至少一种。
本发明再提供一种包载9-AA的脂质体，以磷脂酰胆碱和胆固醇为主体，附加DSPE-mPEG2000、DSPE-mPEG2000-SH两种合成磷脂和cRGDyk靶向多肽。磷脂和胆固醇的摩尔比为80:10-80:20；磷脂和DSPE-mPEG2000的摩尔比为80:2-80:4；磷脂和DSPE-mPEG2000-SH的摩尔比为80:1-80:4；磷脂和cRGDyk的摩尔比为80:1-80:4；9-氨基吖啶和脂质的质量比为2:100-5:100。
本发明进一步提供包载9-AA脂质体的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，成膜，将1.5mg 9-AA，50mg磷脂酰胆碱、5mg胆固醇、6mg DSPE-mPEG2000和4mg DSPE-mPEG2000-SH溶解在4mL氯仿和2mL甲醇的混合体系中，37℃水浴旋蒸，使其在茄形瓶内壁上形成均匀的脂质薄膜，置于干燥皿中，抽真空，干燥过夜；
步骤2，水合，向茄形瓶中加入3mL生理盐水，37℃缓慢摇动；
步骤3，超声，利用超声波细胞破碎仪分散脂质体，强度为40％，时间为5min；
步骤4，过膜，将脂质体依次通过800nm、450nm和220nm的滤膜；
步骤5，靶向肽的修饰，将1.2mg cRGDyk-Mal溶解于0.1mL水中，与脂质体在37℃下孵育2h，完成脂质体表面靶向肽的修饰，即得。本发明的具有长循环和脑靶向双功能的脂质体，可以显著延长9-AA的体内半衰期，增加9-AA在脑损伤部位的浓度，提高药物的生物利用度。同时，脂质体减少9-AA造成的肺损伤，减轻了不良反应，使得9-AA用于缺血性脑损伤的治疗成为可能。
附图说明
图1 与不同的FDA批准药物孵育24h的HEK-293T细胞中的相对荧光素酶活性。
图2 与不同化合物孵育24h的小鼠原代小胶质细胞的活力。
图3 与不同化合物孵育12h和LPS孵育2h的小鼠原代小胶质细胞的TNF-α表达。
图4 HEK-293T细胞与不同浓度的9-AA孵育24h后的相对荧光素酶活性。
图5 9-AA对小鼠原代小胶质细胞NR4A1基因和蛋白表达水平的影响。
图6 9-AA对小鼠原代小胶质细胞促炎介质、抗炎介质和抗炎因子IL-10表达的影响。
图7 9-AA对IRI的作用及安全性。
图8 9-AA对大鼠心肝脾肺肾的影响。
图9 9-AA/L对大鼠心肝脾肺肾的影响。
图10 9-AA和9-AA/L的药动学测试。
图11 活体成像评价不同脂质体脑靶向能力以及Rho/L和Rho/L-PEG-cRGD的药动学测试。
图12 不同脂质体对IRI的保护作用及促炎因子和抗炎因子水平的影响。
图13 MRI测试，9-AA/L-PEG-cRGD抗炎机制初探和长期行为学测试。
图14 9-AA/L-PEG-cRGD对tMCAO大鼠的长期影响。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1针对缺血性脑卒中的药物筛选和评价
一、荧光素酶报告基因分析
在预先涂有PLL的96孔板中培养HEK-293T细胞。当细胞密度达到约70％时，使用lipofectamine 3000试剂和NR4A1启动子荧光素酶报告基因(NR4A1-pro-luc)质粒转染细胞。转染24h后，再将细胞与FDA批准的药物库中的不同化合物孵育24h。使用荧光素测定系统(Promega)测定荧光素酶活性。相对荧光素酶活性计算为L/L0×100％，其中L和L0分别是经过和未经过化合物处理的细胞的荧光素酶活性。
实验结果如图1所示，9种化合物诱导了与NR4A1表达上调相关的HEK293T细胞的荧光素酶活性的显著增加，它们包括伏立诺他、多西紫杉醇、达沙替尼、阿霉素、表阿霉素、噻苯达唑、米托蒽醌、柔红霉素、9-氨基吖啶(9-AA)。
二、体外细胞毒性实验进一步筛选候选化合物
1、原代小胶质细胞的提取
在出生后24h至48h内，将整个大脑从C57BL/6幼崽中分离出来，并浸入4℃的Hank平衡盐溶液(HBSS)中。除去脑膜和其他非皮质组织后，解剖整个皮质，并在室温下用0.25％胰蛋白酶消化大脑皮质。在上述溶液中加入含有10％FBS的DMEM/F12培养基以终止胰蛋白酶消化。将细胞悬液通过70μm筛网过滤。将分离的细胞转移到预先涂有聚-L-赖氨酸(PLL)的细胞培养瓶中培养。分离后
Figure BDA0002381269940000071
天的小鼠原代小胶质细胞用于体外实验。
2、细胞毒性实验
将小鼠原代小胶质细胞与9种化合物分别孵育24h，然后与含有0.5mg/mL MTT的培养基孵育4h。除去培养基后，将MTT反应生成的结晶溶解在DMSO中。使用酶标仪测定570nm下吸光度。细胞活力计算公式为A/A0×100％，其中A和A0分别是经过和未经过化合物处理的细胞的吸光度。
实验结果如图2所示，在9种候选化合物中，仅3种化合物对小鼠原代小胶质细胞没有明显的细胞毒性，他们是达沙替尼，噻苯达唑和9-AA。
三、体外抗炎能力试验
将小鼠原代小胶质细胞与达沙替尼，噻苯达唑和9-AA(5μM)分别孵育12h，再与100ng/mL脂多糖(LPS)孵育2h。用ELISA试剂盒测定小胶质细胞分泌的TNF-α的量。
实验结果如图3所示，经LPS处理的小胶质细胞显示出TNF-α分泌量的增加，而只有9-AA可以显著减少小胶质细胞分泌的TNF-α的量。因此选定9-AA作为最优活性化合物。
四、9-AA对NR4A1激活能力的测定
在预先涂有PLL的96孔板中培养HEK-293T细胞。当细胞密度达到约70％时，使用lipofectamine 3000试剂和NR4A1启动子荧光素酶报告基因(NR4A1-pro-luc)质粒转染细胞。转染24h后，再将细胞与不同浓度的9-AA孵育24h。使用荧光素测定系统(Promega)测定荧光素酶活性。相对荧光素酶活性计算为L/L0×100％，其中L和L0分别是经过和未经过9-AA处理的细胞的荧光素酶活性。
实验结果如图4所示，根据荧光素酶活力对9-AA的浓度曲线，9-AA对NR4A1表达上调的半数有效浓度(EC50)为5.84μM。
五、9-AA对细胞NR4A1基因和蛋白水平的影响
将小鼠原代小胶质细胞与不同浓度的9-AA孵育12h，或与5μM 9-AA孵育不同的时间。通过RT-PCR分析和Western-blot(WB)分别检测小胶质细胞中的NR4A1基因和蛋白表达。
对于RT-PCR分析，使用Trizol试剂分离总RNA。用cDNA合成试剂盒将分离的RNA反转录为cDNA。通过在StepOnePlusTM检测系统(ABI)上使用合成引物和SYBR Green进行定量PCR。
对于WB分析，使用BCA试剂盒定量蛋白质样品的总浓度。在10％-12％SDS-PAGE凝胶上电泳分离等量的蛋白质，然后湿转到合适大小的PVDF膜上。在室温下，用含有5％BSA，0.1％Tween 20的Tris缓冲盐(TBS)(pH 7.4)溶液封闭2h，并与一抗，兔抗NR4A1和抗β-肌动蛋白在4℃下孵育过夜。用含有0.1％Tween 20的TBS洗涤后，将膜与二抗—HRP偶联的山羊抗兔IgG蛋白(ABclonal)在室温下孵育1h。最后，使用成像系统(Bio-Rad ChemiDoc XRS)通过增强的化学发光检测试剂对条带进行可视化。
实验结果如图5所示，9-AA以剂量和时间依赖性方式促进小鼠原代小胶质细胞内源性信使RNA(mRNA)转录和NR4A1蛋白表达。
六、9-AA的抗炎能力考察
将小鼠原代小胶质细胞与5μM的9-AA一起孵育12h，再与100ng/mL的LPS孵育2或6h。LPS刺激后2h，通过RT-PCR分析确定小胶质细胞中促炎基因(TNF-α，IL-1β，IL-6)的表达，而抗炎基因(IL-10，Arginase-1(Arg-1)，CD206)在LPS刺激后6h测量。在LPS刺激后2h，采用ELISA试剂盒测定小胶质细胞分泌的IL-10浓度。
实验结果如图6所示，9-AA预处理可以以剂量和时间依赖性地抑制LPS诱导的小胶质细胞释放促炎因子TNF-α，抑制促炎基因TNF-α、IL-1β和IL-6的表达，同时也促进了小胶质细胞的抗炎激活状态，如增强表达抗炎介质基因，包括IL-10,Arg-1和CD206。同时，单独用9-AA处理可以显著增加小鼠原代小胶质细胞中抗炎细胞因子IL-10的表达。这些结果表明9-AA作为NR4A1的激动剂，可以通过诱导NR4A1的表达，激活小胶质细胞的抗炎反应。
七、9-AA对大鼠短暂性脑中动脉阻塞(transient middle cerebral arteryocclusion，tMCAO)模型的疗效和安全性评价
1、大鼠tMCAO模型的构建
用异氟烷(2％，0.5L/min)麻醉大鼠(
Figure BDA0002381269940000101
)。手术暴露大鼠的右颈总动脉(CCA)，颈内动脉(ICA)和颈外动脉(ECA)。用眼科剪在ECA上切出合适的孔。将硅橡胶涂层的缝合线通过ECA插入ICA，然后轻轻地前进至大脑中动脉的起点。手术期间使用恒温加热毯将体温维持在37℃。手术闭塞持续2h，抽出缝合线进行缺血再灌注以恢复血流。伤口缝合消毒后，获得tMCAO大鼠，即缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury，IRI)模型。
2、9-AA的疗效评价
用表面活性剂Solutol HS15辅助溶解9-AA。在IRI后2、24和48h分别向tMCAO大鼠腹腔内注射游离的9-AA溶液(5或10mg/kg)。记录治疗期间大鼠的存活情况。在IRI后3天将大鼠安乐死。分离大脑并切片，用三苯基四唑氯化物(TTC)染色。使用Image-Pro Plus软件计算大脑的损伤体积。
3、9-AA的急性毒性实验
将小鼠随机分为不同的组，静脉注射不同浓度的9-AA。记录24h内的存活率。用SPSS软件计算半数致死量(LD50)。
实验结果如图7所示，与假手术组相比，tMCAO大鼠的脑梗死面积显著增大。而9-AA治疗导致梗死面积呈剂量依赖性降低。但是，虽然将9-AA的给药剂量增加至10mg/kg可以增强神经保护作用，但会导致大鼠意外死亡，存活率约为50％。
实施例2包载9-AA的脂质体的制备和评价
为了解决9-AA的安全性问题，我们希望借助纳米药物递送系统，改变9-AA的体内药物分布，提高治疗效果，减少不良反应的产生。脂质体是研究的最为广泛的纳米药物递送系统，具有生物相容性高，容易改造，容易制备等优点。因此我们利用功能化的脂质体包载9-AA，延长9-AA半衰期，实现9-AA对脑损伤部位的靶向功能。
一、包载9-AA脂质体的构建
1、普通9-AA脂质体(9-AA/L)
按摩尔比50:5:10称取磷脂、胆固醇和9-AA粉末于100mL茄形瓶中，加入4mL甲醇、2mL氯仿，摇匀。37℃水浴下用旋转蒸发仪抽真空，快速旋干有机溶剂。然后将茄形瓶转移至干燥器中，真空干燥过夜。取出茄形瓶，加入3mL去离子水，37℃水合，得到脂质体粗品。将脂质体移入西林瓶，在冰水浴下借助超声细胞粉碎仪进行进一步分散。将超声后的脂质体依次通过0.8μm、0.45μm、0.22μm滤膜，得到包载9-AA的脂质体。
2、长循环9-AA脂质体(9-AA/L-PEG)
与普通脂质体的制备方法相同，在成膜的过程中加入DSPE-MPEG2000，得到PEG修饰的9-AA长循环脂质体。
3、脑靶向9-AA脂质体(9-AA/L-cRGD)
与普通脂质体的制备方法相同，在成膜的过程中加入DSPE-PEG2000-SH，并在过膜之后加入cRGDyk(Mal)，37℃孵育2h，得到RGD修饰的9-AA脑靶向脂质体。
4、具有长循环和脑靶向双重功能的9-AA脂质体(9-AA/L-PEG-cRGD)
与普通脂质体的制备方法相同，在成膜的过程中加入DSPE-MPEG2000和DSPE-PEG2000-SH，并在过膜之后加入cRGDyk(Mal)，37℃孵育2h，得到具有长循环和脑靶向双重功能的9-AA脂质体。上述方法中磷脂、胆固醇、DSPE-mPEG2000、DSPE-mPEG2000-SH和cRGDyk的摩尔比为80:15:3:2:2，9-AA和总脂质的质量比为3:100。
二、功能化9-AA脂质体的表征
1、9-AA含量测定的方法
精密称取一定量的9-AA粉末，溶解于甲醇溶液中，避光备用。利用酶标仪扫描9-AA甲醇溶液的紫外吸收光谱、获得最大紫外吸收波长。然后配制1,2,5,10,20,50,100,200μg/mL的9-AA溶液，利用酶标仪测定各溶液在最大紫外吸收波长下的吸光度值，绘制9-AA紫外吸收标准曲线。9-AA在400nm处有最大吸收。在最大吸收波长下，9-AA甲醇溶液在1-20μg/mL浓度范围内，紫外吸收和浓度成正比。
2、包封率和载药量的测定
包封率：分别将过膜前和过膜后的脂质体按体积比1:49与甲醇混合稀释，破坏脂质体的结构，利用酶标仪测定其吸光度并计算得到脂质体过膜前后9-AA的含量。过膜前脂质体中9-AA的质量记为W0，过膜后脂质体中9-AA的质量记为W。按照下列公式计算包封率:
包封率(Entrapment efficiency,EE)＝W/W0×100％；
载药量：参照包封率的计算方法计算脂质体中9-AA的含量，记为W。记录脂质体中所有脂质的质量为WL。按照下列公式计算载药量：
载药量(Drug-loading efficiency，DL)＝(W/W+WL)×100％。
9-AA在各组脂质体中的包封率均大于90％，载药量均大于2％。
表1脂质体的理化表征(n＝3)
Figure BDA0002381269940000131
3、粒径、多分散系数和Zeta电位的测定
取一定体积的脂质体溶液稀释一定倍数后，采用ZetaPlus电位粒径仪检测。
结果如表1所示，各组脂质体的粒径在70-80nm，多分散系数均小于0.25％，电位略显负电。
三、9-AA/L的安全性评价
对于未造模小鼠，静脉注射9-AA溶液(15、12.75、10.83、9.21、7.83mg/kg)或9-AA/L(25mg/kg)。记录24h后小鼠存活情况，并计算半数致死量LD50。
对于未造模大鼠，在实验的第2、24和48h分别向大鼠腹腔内注射生理盐水、游离的9-AA溶液(10mg/kg)或9-AA/L(10mg/kg)。3天后将大鼠安乐死。分离出心肝脾肺肾并拍照，将组织切片并用苏木精和伊红(H&E)染色。用光学显微镜观察H&E染色的组织切片。观察间质性水肿和炎性细胞/红细胞浸润。
9-AA和9-AA/L对小鼠的LD50如表2所示。
表2.小鼠在急性毒性研究中的存活情况
Figure BDA0002381269940000132
Figure BDA0002381269940000141
aLD50＝9.949mg/kg(8.735<LD50<11.015,α＝0.05)
bLD50>25mg/kg
9-AA和9-AA/L对大鼠的脏器毒性如图8，图9所示，相比于游离9-AA导致的肺损伤，9-AA/L不会在大鼠的正常组织中引起任何明显的病理变化。
四、9-AA/L的药动学考察
分别给大鼠静脉注射游离的9-AA溶液(2.5mg/kg)和9-AA/L(2.5mg/kg)。在注射后的不同时间，收集血液样品并离心。使用酶标仪在406nm激发下测量454nm的荧光强度。
实验结果如图10所示，静脉注射后，9-AA/L可以有效延长9-AA的循环时间，提高9-AA的半衰期。
五、不同脂质体的靶向能力考察
1、DiR荧光标记脂质体的制备
与9-AA的四种脂质体制备方法相同，将9-AA替换为荧光染料DiR，制备得到(1)普通DiR脂质体(DiR/L)，(2)长循环DiR脂质体(DiR/L-PEG)，(3)脑靶向DiR脂质体(DiR/L-cRGD)和(4)长循环和脑靶向双功能化的DiR脂质体(DiR/L-PEG-cRGD)。
2、活体成像检测脂质体的脑靶向能力
大鼠IRI后24h静脉注射DiR标记的脂质体制剂(1)DiR/L，(2)DiR/L-PEG，(3)DiR/L–cRGD，(4)DiR/L-PEG-cRGD。给药后1、2、4、6、24h利用活体成像仪观察大鼠体内DiR荧光分布。24h拍摄完后，脱臼处死，取脑拍摄DiR荧光分布。最后将大脑放入-80℃速冻3min，取出并用刀片在常温下等分切成6片，拍摄DiR荧光在脑内分布。记录图像数据，根据荧光强度和分布统计4种剂型的组织分布，以梗死半脑的荧光分布，强度以及持续时间，比较4种制剂的脑靶向能力。
实验结果如图11所示，术后24h尾静脉注射4组DiR标记的脂质体，其中DiR/L-PEG-cRGD展现出了最强的脑部信号，24h脑切片信号分布显示，脂质体主要集中大脑梗死侧，符合预期。DiR/L-PEG信号其次，DiR/L–cRGD信号初始较强，后期衰退明显。证明了双功能化的脂质体具备较好的脑靶向能力和长循环能力。后续实验选用9-AA/L-PEG-cRGD作为制剂进行考察。
六、具有靶向和长循环两种功能的脂质体的药动学考察
1、罗丹明标记的脂质体的制备
与9-AA/L和9-AA/L-PEG-cRGD的制备方法相同，将9-AA替换为罗丹明PE，制备得到了罗丹明标记普通脂质体(Rho/L)和罗丹明标记的长循环和脑靶向双功能化的脂质体(Rho/L-PEG-cRGD)。
2、药动学考察
分别给大鼠静脉注射Rho/L和Rho/L-PEG-cRGD。在注射后的不同时间，收集血液样品并离心。使用酶标仪在552nm激发下测量575nm的荧光强度。
实验结果如图11所示，静脉注射后，相比于Rho/L，Rho/L-PEG-cRGD可以有效延长Rho的循环时间，证明了PEG化的脂质体进一步延长了半衰期。
七、9-AA/L-PEG-cRGD对缺血性脑卒中急性期的保护作用
将56只SD大鼠随机分为7组：(1)假手术组、(2)生理盐水组、(3)低浓度9-AA(2.5mg/kg)游离药物组、(4)高浓度9-AA(5mg/kg)游离药物组，(5)9-AA(2.5mg/kg)普通脂质体组、(6)9-AA(2.5mg/kg)长循环脂质体组、(7)9-AA(2.5mg/kg)双功能化脂质体组，每组8只。参照实施例1中的方法构建tMCAO模型。造模后2、24、48h尾静脉注射不同组别药物，共给药3次。假手术组和生理盐水组在相同时间尾静脉注射生理盐水。手术72h后，颈椎脱臼法处死大鼠，剪开头皮，打开颅骨，取出脑组织。用生理盐水洗去脑组织表面血液，滤纸吸干。迅速置于-80℃冰箱冻存。取出后在冰上切片，切成2mm厚度冠状切片，共6片。将脑片近脑干面朝下，放入2％TTC溶液中，避光37℃反应10min。取出后排列整齐，滤纸吸干水分，拍照保存，使用Image-Pro Plus软件计算大脑的损伤体积。同时参照实施例1中的方法测定缺血脑组织中的促炎性介质(TNF-α，IL-1β，IL-6)和抗炎性介质(ARG-1和CD206)的mRNA水平。
实验结果如图12所示，与游离的9-AA，9-AA/L或9-AA/L-PEG相比，相比于同剂量的9-AA，9-AA/L-PEG-cRGD处理的tMCAO大鼠在IRI后3天显著降低了TTC染色的梗死体积。此外，9-AA/L-PEG-cRGD的治疗功效显著高于两倍浓度的游离9-AA。9-AA/L-PEG-cRGD可显著抑制促炎介质的基因表达，同时增强缺血区抗炎介质的基因表达。这些数据表明9-AA/L-PEG-cRGD使得9-AA在缺血性脑中快速积累，减少神经炎症，从而减轻缺血性脑损伤。
八、磁共振(MRI)检测脂质体的治疗效果
在2、24和48h向tMCAO大鼠静脉注射游离的9-AA溶液(2.5mg/kg)和9-AA/L-PEG-cRGD(2.5mg/kg)。使用小型动物MRI系统，在IRI后第3天检测大鼠的大脑。使用生理监测装置检测大鼠的心电图和呼吸频率。MRI的扫描参数如下：重复时间(TR)＝3000.0ms，回波时间(TE)＝33.0ms，反转角(FA)＝顺时针90度，扫描层厚度(SI)＝1mm，视图＝3.5cm×3cm，NSL扫描25层。
实验结果如图13所示，与游离9-AA相比，9-AA/L-PEG-cRGD具有增强的抗脑中风功效，并且梗死面积明显减少。
九、9-AA/L-PEG-cRGD抗神经炎症机制初探
在2、24和48h向tMCAO大鼠静脉注射游离的9-AA溶液(2.5mg/kg)和9-AA/L-PEG-cRGD(2.5mg/kg)。用WB分析确定NR4A1和SOCS3的表达。
实验结果如图13所示，在tMCAO大鼠模型中，证实NR4A1/IL-10/SOCS3途径参与9-AA/L-PEG-cRGD递送的9-AA的抗神经炎症。9-AA/L-PEG-cRGD处理可明显促进NR4A1和SOCS3的蛋白表达，同时增加tMCAO大鼠缺血脑半球中IL-10的基因表达。
十、9-AA/L-PEG-cRGD对tMCAO大鼠行为学的影响
为了进行长期的神经行为评估，分别在造模后第2、24和48h给tMCAO大鼠静脉注射游离的9-AA溶液(2.5mg/kg)和9-AA/L-PEG-cRGD(2.5mg/kg)，然后在28天内进行Rotarod测试，Corner测试和改良的神经功能缺损程度评分(mNSS)测试。
对于Rotarod测试，将大鼠放在加速旋转的棒上，并在5分钟内将其速度从4×rpm(起始速度)增加到40×rpm(最终速度)。每天测试大鼠在旋转棒上的停留时间。
对于Corner测试，将大鼠置于30°夹角的两个平板之间并面向转角。当它们的触须触碰到两侧的角落时，正常的老鼠会选择性地向左或向右转动。但是，当大鼠患有感觉障碍时，它们会选择性地转向未受损的一侧。记录大鼠在10次试验中向右转的次数。
对于mNSS测试，评分等级为0到18(正常评分为0；最大缺陷评分为18)。分数13-18表示严重伤害，7-12中等伤害和1-6轻微伤害。
实验结果如图13所示，与游离9-AA相比，9-AA/L-PEG-cRGD处理可改善tMCAO大鼠中风引起的神经功能缺损，并促进其长期功能恢复。
十一、9-AA/L-PEG-cRGD对tMCAO大鼠的长期影响
参照实施例1中的方法构建tMCAO模型。造模后2、24、48h尾静脉注射不同组别药物，共给药3次。假手术组和生理盐水组在相同时间尾静脉注射生理盐水。手术7天或14天后，颈椎脱臼法处死大鼠，剪开头皮，打开颅骨，取出脑组织。用生理盐水洗去脑组织表面血液，滤纸吸干。迅速置于-80℃冰箱冻存。取出后在冰上切片，切成2mm厚度冠状切片，共6片。将脑片近脑干面朝下，放入2％TTC溶液中，避光37℃反应10min。取出后排列整齐，滤纸吸干水分，拍照保存，使用Image-Pro Plus软件计算大脑的损伤体积。
实验结果如图14所示，9-AA/L-PEG-cRGD处理介导了长期的抗炎反应和功能恢复。与IRI后游离9-AA处理相比，用9-AA/L-PEG-cRGD处理显著降低了tMCAO大鼠造模后7天和14天的梗塞体积。
除上述实施外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims (7)

1.9-氨基吖啶的应用，包括在制备治疗缺血性脑卒中药物的用途。
2.一种用于治疗缺血性脑卒中的脂质体，包括9-氨基吖啶、磷脂、胆固醇、PEG功能化磷脂、脑靶向多肽,所述磷脂和胆固醇的摩尔比为20:1-4:1；磷脂和PEG功能化磷脂的摩尔比为40:1-10:1；磷脂和脑靶向多肽的摩尔比为80:1-10:1；9-氨基吖啶和脂质的质量比为1:100-5:100。
3.根据权利要求2所述用于治疗缺血性脑卒中的脂质体，其特征在于：所述磷脂包括(氢化)磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、心磷脂、鞘磷脂或鞘糖脂中的至少一种。
4.根据权利要求2所述用于治疗缺血性脑卒中的脂质体，其特征在于：所述PEG功能化磷脂包括二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-mPEG2000)、DSPE-PEG5000-N3、DSPE-PEG2000-N3、DSPE-PEG5000-SH、DSPE-PEG2000-SH、DSPE-PEG5000-NH2、DSPE-PEG2000-NH2、DSPE-PEG5000-COOH、DSPE-PEG2000-COOH、DSPE-PEG5000-OH中的至少一种。
5.根据权利要求2所述用于治疗缺血性脑卒中的脂质体，其特征在于：所述脑靶向多肽包括中风归巢肽(CLEVSRKNC)、狂犬病病毒糖蛋白29肽(RVG29)、促BBB转胞吞多肽(Angiopep-2)、转铁蛋白靶向肽(T7)、神经激肽-1受体接合肽(substance P)、整合素靶向多肽(cRGDyk)中的至少一种。
6.根据权利要求2所述用于治疗缺血性脑卒中的脂质体，其特征在于：所述脂质体包载9-氨基吖啶,以磷脂酰胆碱和胆固醇为主体，附加DSPE-mPEG2000、DSPE-mPEG2000-SH两种功能化磷脂和cRGDyk靶向多肽，磷脂和胆固醇的摩尔比为80:10-80:20；磷脂和DSPE-mPEG2000的摩尔比为80:2-80:4；磷脂和DSPE-mPEG2000-SH的摩尔比为80:1-80:4；磷脂和cRGDyk的摩尔比为80:1-80:4；9-氨基吖啶和脂质的质量比为2:100-5:100。
7.根据权利要求6所述用于治疗缺血性脑卒中的脂质体的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，成膜，将1.5mg 9-AA，50mg磷脂酰胆碱、5mg胆固醇、6mg DSPE-mPEG2000和4mgDSPE-mPEG2000-SH溶解在4mL氯仿和2mL甲醇的混合体系中，37℃水浴旋蒸，使其在茄形瓶内壁上形成均匀的脂质薄膜，置于干燥皿中，抽真空，干燥过夜；
步骤2，水合，向茄形瓶中加入3mL生理盐水，37℃缓慢摇动；
步骤3，超声，利用超声波细胞破碎仪分散脂质体，强度为40％，时间为5min；
步骤4，过膜，将脂质体依次通过800nm、450nm和220nm的滤膜；
步骤5，靶向肽的修饰，将1.2mg cRGDyk-Mal溶解于0.1mL水中，与脂质体在37℃下孵育2h，完成脂质体表面靶向肽的修饰，即得。
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