CN111239413A - 一种基于组织芯片的蛋白-蛋白相关性的分析方法及应用 - Google Patents

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刘朗夏
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Abstract

本发明提供了一种基于组织芯片的蛋白‑蛋白相关性的分析方法及应用。所述的分析方法通过先对组织芯片进行全局性预览，分级进行观察，在连号的组织芯片上同一个组织点相同视野中对比待研究的蛋白的表达情况及分析。本发明分析方法将待分析的蛋白的表达在相同组织的几乎相同位置进行相关性比较分析，特异性和精细性得到了显著的提高，更加贴近真实表达情况，由此更好地呈现和反映样品如肿瘤组织中蛋白‑蛋白表达的相关性，更好地辅助肿瘤基础研究，对于蛋白‑蛋白表达相关性研究、疾病科学研究等均具有重要意义和应用价值。

Description

一种基于组织芯片的蛋白-蛋白相关性的分析方法及应用
技术领域
本发明属于生物检测方法领域，特别涉及一种基于组织芯片的蛋白-蛋白相关性的分析方法及应用。
背景技术
蛋白-蛋白表达相关性的分析与鉴定对于肿瘤基础研究中确定两个蛋白的表达关系至关重要，尤其是利用临床肿瘤组织进行的分析更为关键。然而，现有的分析方法难以满足特异性和精细性。目前的分析方法一般将蛋白在肿瘤组织中的表达水平分为三个或四个等级，有些组织中这个蛋白的表达水平并不完全属于三或四个等级中的一个，但最终也会勉强归到一个近似的等级，出现分级不够精细、不够特异的问题。另一方面，由于同一个组织点不同视野蛋白的表达可能有明显差异，现有的分析方法会导致一些蛋白评分偏差。
因此，研究开发特异性和精细性更好的方法，使分析与鉴定更加贴近真实表达情况，对于蛋白-蛋白表达相关性研究、疾病科学研究等均具有重要意义。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于组织芯片的蛋白-蛋白相关性的分析方法；本发明将待分析的不同蛋白在相同的视野下进行评分比较。
本发明的又一目的在于提供所述的基于组织芯片的蛋白-蛋白相关性的分析方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种基于组织芯片的蛋白-蛋白相关性的分析方法，包括如下步骤：
(1)在组织芯片上对其中一种待分析蛋白进行染色；
(2)通过完整的全局性预览该组织芯片中该种待分析蛋白的表达水平，将所述的待分析蛋白的表达强度和表达百分比分别分为五个等级，例如从1到5，或者0到4；
(3)在特定视野下，将该种待分析蛋白的表达强度的分值乘以该种待分析蛋白的表达百分比的分值，得出该种待分析蛋白表达总分，也即染色强度；
(4)在与步骤(1)所述的组织芯片连号的其他组织芯片上的相同特定视野中，依次对其他待分析蛋白进行染色强度的观察分析，重复步骤(1)～(3)；一般来说，一个组织芯片只对一种待分析蛋白进行染色分析，比如组织芯片I染A蛋白，组织芯片Ⅱ染B蛋白；
(5)将所得到的不同待分析蛋白的表达总分利用统计学中的相关性分析方法进行相关性分析。
步骤(1)中所述的组织芯片优选为肿瘤组织芯片。
步骤(1)中所述的染色的方法可以是常规的免疫组化染色方法或组织免疫荧光染色方法等等。
步骤(2)中所述的表达百分比的等级优选依次为0～20％，21～40％，41～60％，61～80％，80％以上这五个等级。
步骤(2)中所述的表达强度的等级优选依次为：完全没表达为0；弱为1；中等为2；较强为3；很强为4。
步骤(2)所述的全局性预览优选在低倍镜下进行预览，所述的低倍镜的放大倍数可以是5倍左右。
步骤(3)中所述的特定视野可以选择染色强度较为接近的多个，例如三个，可以均是表达相对高的，可以均是表达相对适中的，也可以是表达相对低的。
步骤(5)中所述的相关性分析方法根据数据类型、样本量选择Spearman或者Pearson相关系数分析。
所述的基于组织芯片的蛋白-蛋白相关性的分析方法在肿瘤组织研究中的应用。
本发明通过先对组织芯片进行全局性预览，分级进行观察，观察整张可能包括几十到几百个组织点的组织芯片，选择一个组织点相同视野中对比待研究的蛋白(如蛋白A和蛋白B)的表达情况，在连号的组织芯片上在同一个组织点上进行观察分析。
本发明建立了一种新型分析策略，解决现有分析方法中存在的两个问题，相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)针对特定蛋白在组织芯片中表达评分分级不够精细的问题，本发明强调通过全局性预览整张组织芯片中特定蛋白的表达水平，将此蛋白的表达水平分为五个等级，特异性和精细性得到了显著的提高，更加贴近真实表达情况。
(2)在连号的至少另一张组织芯片中，采用同样的评分分级方法观察相同视野中其他特定蛋白的表达，避免同一个组织点不同视野蛋白的表达可能存在较大差异。该分析策略使要分析的蛋白的表达在相同组织的几乎相同位置进行相关性比较分析，能够使蛋白-蛋白相关性的分析更加精细，更加接近组织中的真实情况，能更好地呈现和反映肿瘤组织中蛋白-蛋白表达的相关性，更好地辅助肿瘤基础研究。
附图说明
图1是hnRNPK正调控AC-α-tubulin的表达水平的结果图；其中，A,B为利用hnRNPK的siRNA敲低其表达，Western blot检测AC-α-tubulin的表达变化；C,D为H1299细胞转染Flag-hnRNPK质粒，Western blot检测AC-α-tubulin的表达变化。
图2是hnRNPK和AC-α-tubulin蛋白在肺腺癌组织芯片中的表达情况结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1细胞水平上蛋白hnRNPK和AC-α-tubulin在肿瘤细胞和肿瘤组织中表达关系的研究
在肿瘤基础研究过程中，我们需要鉴定两个特定蛋白hnRNPK和AC-α-tubulin在肿瘤细胞和肿瘤组织中的表达关系。首先，我们在肺腺癌细胞H1299中发现敲低hnRNPK蛋白后，AC-α-tubulin的表达也下降，相反，过表达Flag-hnRNPK之后，AC-α-tubulin的表达也相应升高，三次独立实验均得出相同结论，结果如图1所示。
1.hnRNPK的siRNA片段序列以及在细胞中的转染
(1)合成得到hnRNPK的siRNA片段序列
由上海吉玛制药合成干扰片段，得到3个siRNA片段si hnRNPK #1、si hnRNPK#2和si NC(阴性对照组)，片段序列如下表所示：
表1
Figure BDA0002375865820000031
Figure BDA0002375865820000041
(2)siRNA在细胞中的转染过程
①H1299肺腺癌细胞(购于上海中科院)经1×PBS洗两次，胰酶消化下来。离心机离心3min，室温，1100rpm。
②弃上清，用新鲜的完全培养基重悬，并用血球计数板计算细胞密度，将6×105cell/皿铺到20cm2培养皿。
③放在细胞培养箱中培养过夜。
④准备si RNA瞬时干扰体系混合液
A液:100μL Opti-MEM(Invitrogen公司)与10μL si RNA干扰片段(200mmol/L)相混合后室温放置5min；
所述的si RNA干扰片段设置两个组别：
一是对照组，所述的si RNA干扰片段为干扰片段si NC；
二是试验组，所述的si RNA干扰片段为si hnRNPK#1和sihnRNPK#2按体积比1:1混合得到。
B液:100μL Opti-MEM与7μL Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)相混合后在室温放置5min；
⑤将A液和B液相混合后，在室温放置20min；
⑥弃掉培养皿里的培养基，加入1.8mL Opti-MEM，再加入上述准备的干扰体系混合液；
⑦放细胞培养箱中培养4～6h，弃去干扰体系混合液，换新鲜培养基继续培养48h后，收细胞进行检测。
2.Flag-hnRNPK质粒的构建
(1)Flag-hnRNPK引物序列如下：
表2
Flag-hnRNPK-F 5’-GAGAATTCATGGAAACTGAACAGC-3’
Flag-hnRNPK-R 5’-GTCTCGAGTTAGAATCCTTCAAC-3’
(2)Human hnRNPK cDNA获取方式：所述基因信息的NCBI Reference Sequence为NM_002140.4，本实施例所用的cDNA从厦门大学韩家淮实验室申请获得，亦可通过本领域常规技术手段得到。
(3)PCR反应体系
表3
Figure BDA0002375865820000051
(4)PCR反应程序
表4
Figure BDA0002375865820000052
用1％琼脂糖凝胶电泳30min检测PCR效果，目的基因长度约1400bp，如果PCR产物条带大小处于正确位置，则进行下面实验。
(5)PCR产物回收
①将PCR产物在1％琼脂糖凝胶电泳30min；
②将目的基因条带所在位置的胶切下来，转移到EP管中，称重；
③向EP管中相应体积的凝胶溶解液，放置55℃水浴10min，每隔5min上下颠倒EP管，使凝胶充分溶解；
④凝胶吸附柱中加入平衡液500μL。离心机室温，12000rpm，离心1min；
⑤弃去BL液，向吸附柱中加入已充分溶解好凝胶溶解液，放置室温2min，然后离心机室温，12000rpm，离心1min；
⑥弃去凝胶溶解液，向吸附柱中加入漂洗液PW 600μL。离心机室温，12000rpm，离心1min；
⑦重复步骤⑥；
⑧弃去漂洗液，将吸附柱于离心机室温，12000rpm，离心2min，以除去多余漂洗液；
⑨将吸附柱置于室温晾干5min，以除去柱中的乙醇；
⑩最后将吸附柱套入新的1.5mL EP管中，加入10μL ddH2O，室温放置5min后，离心机室温，12000rpm，离心1min；
Figure BDA0002375865820000063
测定DNA的浓度。
(6)FLAG-vector载体(购自碧云天生物技术有限公司，货号：D2722)及hnRNPK目的基因的双酶切。其中双酶切反应体系如表5：
表5
Figure BDA0002375865820000061
放置于37℃水浴锅中，酶切反应4h。
(7)FLAG-vector载体及hnRNPK目的基因的连接
连接反应体系：
表6
Figure BDA0002375865820000062
放置室温连接过夜，得到连接产物。
(8)FLAG-hnRNPK重组载体转化
①DH5α感受态菌液冰上解冻，把所有连接产物与感受态细菌混匀，放置冰上30min；
②放置42℃水浴锅中热激90sec；
③迅速转移至冰上放置2min，然后加入1mL的无抗生素抗性的LB培养液，放置37℃恒温培养箱中，250rpm，培养1h；
④离心机室温，6000rpm，离心5min；
⑤弃去800μL LB培养液后，用剩余培养液的重悬菌体，然后均匀的涂于带有卡那霉素50μg/mL的LB培养板上；
⑥放置37℃恒温培养箱中倒置培养12h。
(9)FLAG-hnRNPK重组质粒的阳性鉴定
①随机挑取5～15个菌落单克隆，接种到已加入50μg/mL卡那霉素的5mL LB培养基中；
②放置37℃恒温培养箱中，250rpm，培养12h；
③从每管菌液中取1μL进行菌落PCR，PCR程序如表4。PCR后，用1％琼脂糖凝胶进行电泳，根据PCR片段的大小来确定阳性克隆。然后将阳性克隆送上海英俊生物公司测序，并对测序结果进行对比，确认质粒构建成功。
(10)转染细胞
①H1299肺腺癌细胞经1×PBS洗两次，胰酶消化下来。离心机离心3min，室温，1100rpm。
②将细胞按照80％汇合率接种于6孔板。
③放在细胞培养箱中培养过夜。
④准备质粒和转染试剂的混合液
A液:取250μL的opti-MEM(Invitrogen公司)加入1～2μg真核表达质粒FLAG-hnRNPK混合后室温放置5min；
B液:取250μL的opti-MEM加入3.5μL的lipo2000(Invitrogen公司)，轻轻混匀，室温静置5min。
⑤将A液和B液相混合后，在室温放置20min；
⑥弃掉6孔板里的培养基，加入1mL Opti-MEM，再加入上述准备的质粒-转染试剂混合液；
⑦放细胞培养箱中培养4～6h，弃去混合液，换新鲜培养基继续培养48h后，收细胞进行检测。
3.细胞检测
(1)收集分别转染了FLAG-vector或FLAG-hnRNPK的细胞后，用胰酶消化细胞，含FBS的培养基终止消化，1100rpm离心5min，PBS清洗三次，弃去PBS，收集细胞。
(2)细胞裂解液(P0013，碧云天生物技术有限公司)加入1mM PMSF、10mM NaF、1mMNa3VO4等蛋白酶和磷酸酶抑制剂，配制成工作液，根据细胞量加入相应的工作液，冰上裂解细胞3x10min，每10min弹匀一次。
(3)4℃，12000rpm离心30min，上清即为细胞裂解液。
4.Western blot检测
通过Western blot对所得到的细胞裂解液进行检测，其中所用一抗包括Flag(A2220,Sigma),hnRNPK(sc-28380,SANTA CRUZ),GAPDH(ZS-25778,ZSGB-BIO,China),α-tubulin(ProteinTech,USA),AC-α-tubulin(acetylation of α-tubulin,Sigma,USA)。二抗包括Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG(Jackson公司),PeroxidaseAffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG(Jackson公司)。
实施例2基于组织芯片的蛋白-蛋白相关性的分析研究
为了在肺腺癌组织水平验证hnRNPK与AC-α-tubulin的表达关系，我们利用商业化的肺腺癌组织芯片(HLugA150CS02，上海芯超生物科技有限公司)分别免疫组化染色hnRNPK和AC-α-tubulin蛋白的抗体，观察二者的定位情况。采用两张连号的组织芯片，这样能更好的保证两张片子的相似性，更真实的反映两个蛋白在同一组织位置中的表达情况。
一、免疫组化染色
1.准备工作
(1)将组织芯片放入烘箱中，温度调至63℃，烘蜡1小时。
(2)配制试剂：
①10*PBS缓冲液(配方：80g NaCl、2g KCl、15.35g Na2HPO4、2g KH2PO4，用纯水定容至1000毫升，pH＝7.2)：将10*PBS缓冲液稀释至1*PBS缓冲液，再在1*PBS缓冲液中加入占总体积0.05％的吐温试剂；
②抗原修复液(pH＝5.96)
柠檬酸修复液：82毫升0.1mol/L的柠檬酸钠溶液+18毫升0.1mol/L的柠檬酸溶液+900毫升的纯水置于高压锅中；
EDTA修复液：pH＝9.0的50*EDTA抗原修复液(迈新)用纯水稀释50倍。
2.抗原修复
(1)片子烘烤完成后，从烘箱内取出，放入全自动染色机中，进行脱蜡。
脱蜡过程：二甲苯两缸，每缸15分钟；无水乙醇两缸，每缸7分钟；90％酒精1缸，5分钟；80％酒精1缸，5分钟；70％酒精1缸，5分钟。
(2)从染色机中取出片子，用纯水冲洗3次，一次1分钟。冲洗过程中将柠檬酸修复液放至电磁炉上开始加热；
(3)抗原修复
柠檬酸高压修复：柠檬酸修复液沸腾后，将片子放入高压锅中，盖上高压锅盖，待出气后开始计时，5分钟。时间到后终止加热，将高压锅盖打开，使其自然冷却30分钟；
EDTA热修复：加热沸腾后放入片子，计时20分钟。
3.阻断
(1)配制内源性过氧化物酶阻断剂。38.4mL无水甲醇+12mL 30％浓度的H2O2+9.6mL纯水；
(2)将片子放入阻断剂中15分钟。
4.加入一抗(一抗来源兔和鼠)
(1)取出片子，用PBS缓冲液冲洗3次，一次1分钟；
(2)冰箱中取出一抗hnRNPK(sc-28380,SANTA CRUZ),AC-α-tubulin(Sigma,USA)，放入离心机里7200转离心30秒；
(3)取出一抗，按照稀释度用DAKO抗体稀释液稀释；
(4)滴加一抗；
(5)室温孵育半小时。
5.加入二抗
(1)将片子用PBS缓冲液冲洗3次，一次1分钟；
(2)滴加DAKO公司的EnVisionTM+/HRP兔工作液或EnVisionTM+/HRP鼠工作液，孵育30分钟；
(4)时间到后用PBS冲洗3次，一次1分钟。
6.DAB显色
(1)从冰箱里取出DAB试剂盒，按1mL DAB稀释液+1滴DAB色原进行配制；(来自DAKO液体DAB+底物系统)
(2)在片子上滴加稀释后的DAB，显色5分钟，到时后自来水冲洗5分钟。
7.苏木素复染
(1)在片子上滴加哈氏苏木素(SIGMA)40秒，时间到后在0.25％的盐酸酒精(400mL70％酒精+1mL浓盐酸)中浸没2秒，用自来水冲洗2分钟；
(2)将片子放入全自动染色机进行脱水，取出封片。
脱水过程：75％酒精1缸，5分钟；85％酒精1缸，5分钟；95％酒精1缸，5分钟；无水乙醇两缸，每缸7分钟；二甲苯两缸，每缸15分钟。
二、染色结果分析
1.全局性预览
分析染色结果时，利用本发明的分析策略首先全局性预览，在低倍镜(如5倍左右)放大的情况下预览，浏览一下整个组织芯片的每个组织点中蛋白的染色强度和染色百分比。根据整张组织芯片中hnRNPK和AC-α-tubulin蛋白的染色强度，并将二者的表达水平各自分为五级，例如将蛋白的表达强度由弱到强分为“0～4”五个级别，例如：完全没表达为0，弱为1；中等为2；较强为3；很强为4；百分比分为五个级别：0～20％为0，21～40％为1，41～60％为2，61～80％为3，80％以上为4。其中，染色强度＝表达强度×表达百分比。
表7
Figure BDA0002375865820000101
Figure BDA0002375865820000111
Figure BDA0002375865820000121
Figure BDA0002375865820000131
2.选择观察视野
尽量选择相同视野，选择蛋白hnRNPK强度比较近似的三个视野，可以均是表达相对高的，可以均是表达相对适中的，也可以是表达相对低的，作为要观察的视野；同时在连号的另一张芯片上相同的位置观察蛋白AC-α-tubulin的表达情况。以此方法对两个蛋白的表达情况进行对比，结果如下图2，从放大的图中可以看出，hnRNPK高表达的肺腺癌组织中，AC-α-tubulin蛋白在细胞质也出现高表达，而在正常的肺上皮细胞(癌旁组织)中，两者均低表达(图2)。两张连号的组织芯片各含有75对癌与癌旁组织(相当于正常组织)，通过本发明的分析方法，再结合Pearson相关系数分析，得出hnRNPK和AC-α-tubulin两个蛋白的表达具有较强的正相关(p<0.0001，R＝0.5973)。结果和实施例1研究的细胞水平两个蛋白的关系完全一致。
对比例
将实施例2的hnRNPK和AC-α-tubulin蛋白用四级分法，其中，表达强度分类：不表达为0；弱为1；偏强为2；很强为3。百分比分类：0～20％为0；21～50％为1；51～80％为2；81～100％为3。进行研究并打分，并且同一组织点两个蛋白的分析不一定用相同视野，其余操作同实施例2。具体分数如表8，经过Pearson相关系数分析，得出hnRNPK和AC-α-tubulin两个蛋白的表达具有弱正相关(p＝0.0005，R＝0.3896)。一般认为R大于0.3，代表较弱的相关性，0.5以上相关性明显增强，利用本发明的分析方法，将组织水平的弱相关提升到较强相关，更好的契合细胞水平的分析结果，效果显著。
表8
Figure BDA0002375865820000132
Figure BDA0002375865820000141
Figure BDA0002375865820000151
Figure BDA0002375865820000161
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 暨南大学
<120> 一种基于组织芯片的蛋白-蛋白相关性的分析方法及应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> si hnRNPK #1F
<400> 1
uauuaaggcu cuccguacat t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> si hnRNPK #1R
<400> 2
uguacggaga gccuuaauat t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> si hnRNPK #2F
<400> 3
ccuuaugauc ccaacuuuut t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> si hnRNPK #2R
<400> 4
aaaaguuggg aucauaaggt t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> si NC -F
<400> 5
uucuccgaac gugucacgut t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> si NC -R
<400> 6
acgugacacg uucggagaat t 21
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Flag-hnRNPK -F
<400> 7
gagaattcat ggaaactgaa cagc 24
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Flag-hnRNPK-R
<400> 8
gtctcgagtt agaatccttc aac 23

Claims (10)

1.一种基于组织芯片的蛋白-蛋白相关性的分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)在组织芯片上对其中一种待分析蛋白进行染色；
(2)通过完整的全局性预览该组织芯片中该种待分析蛋白的表达水平，将所述的待分析蛋白的表达强度和表达百分比分别分为五个等级；
(3)在特定视野下，将该种待分析蛋白的表达强度的分值乘以该种待分析蛋白的表达百分比的分值，得出该种待分析蛋白表达总分，也即染色强度；
(4)在与步骤(1)所述的组织芯片连号的其他组织芯片上的相同特定视野中，依次对其他待分析蛋白进行染色强度的观察分析，重复步骤(1)～(3)；
(5)将所得到的不同待分析蛋白的表达总分利用统计学中的相关性分析方法进行相关性分析。
2.根据权利要求1所述的基于组织芯片的蛋白-蛋白相关性的分析方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的组织芯片为肿瘤组织芯片。
3.根据权利要求1所述的基于组织芯片的蛋白-蛋白相关性的分析方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的染色的方法为免疫组化染色方法或组织免疫荧光染色方法。
4.根据权利要求1所述的基于组织芯片的蛋白-蛋白相关性的分析方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的染色为一个组织芯片只对一种待分析蛋白进行染色分析。
5.根据权利要求1所述的基于组织芯片的蛋白-蛋白相关性的分析方法，其特征在于：
步骤(2)所述的全局性预览在低倍镜下进行预览；
步骤(2)中所述的表达百分比的五个等级依次为0～20％，21～40％，41～60％，61～80％，80％以上。
6.根据权利要求5所述的基于组织芯片的蛋白-蛋白相关性的分析方法，其特征在于：
所述的低倍镜的放大倍数为5倍；
步骤(2)中所述的表达强度的等级依次为：完全没表达为0；弱为1；中等为2；较强为3；很强为4。
7.根据权利要求1所述的基于组织芯片的蛋白-蛋白相关性的分析方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的特定视野选择表达强度接近的至少两个。
8.根据权利要求7所述的基于组织芯片的蛋白-蛋白相关性的分析方法，其特征在于：
所述的特定视野的数量为3个。
9.根据权利要求1所述的基于组织芯片的蛋白-蛋白相关性的分析方法，其特征在于：
步骤(5)中所述的相关性分析方法为Spearman相关系数分析或者Pearson相关系数分析。
10.权利要求1～9任一项所述的基于组织芯片的蛋白-蛋白相关性的分析方法在肿瘤组织研究中的应用。
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