CN109762902A - 一种人类map2k5第1100位碱基突变基因的arms-pcr检测试剂盒 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明公开了检测人类MAP2K5基因第1100位碱基变异的相关试剂在制备非髓样甲状腺癌筛查试剂中的用途;所述检测人类MAP2K5基因第1100位碱基变异的相关试剂是ARMS‑PCR检测用试剂。本发明还公开了非髓样甲状腺癌筛查试剂盒。本发明试剂盒,可用于甲状腺癌的辅助性诊断,应用前景优良。
Description
技术领域
本发明涉及SNP领域,特别涉及与非髓样甲状腺癌相关的SNP。
背景技术
过去十年中国女性甲状腺癌发病率增长约5倍,成为女性增速最快的恶性 肿瘤。发病率在小于30岁女性中排名第一,全年龄段排第六。起源于甲状腺 滤泡细胞(Follicular Epithelium Cell)的非髓样癌(Non-medullary Thyroid Cancer,NMTC)约占总数的95%,乳头状甲状腺癌是非髓样癌中最常见的类型; 起源于甲状旁腺C细胞的髓样癌(Medullary Thyroid Cancer,MTC)约占5%。 两种类型均可具有遗传性。
尽管NMTC的概念已经被广泛接受,但其易感基因和对应功能仍未被阐明 和普遍认可,以至于目前尚缺乏公认的易感基因变异可作为NMTC防控或治疗 的靶点。
发明内容
为了解决上述问题,本发明提供了一种检测NMTC的试剂盒。
本发明首先提供了检测人类MAP2K5基因第1100位碱基变异的相关试 剂在制备非髓样甲状腺癌筛查试剂中的用途;所述检测人类MAP2K5基因第 1100位碱基变异的相关试剂是ARMS-PCR检测用试剂。
其中,所述筛查试剂是检测乳头状甲状腺癌的筛查试剂。
其中,所述试剂是检测人类MAP2K5基因第1100位T→C变异的相关 试剂。
其中,所述ARMS-PCR检测用试剂包括探针和扩增引物;
所述探针为:荧光分子-5’-ACT TTT CTT TTT CCT GAT GGC TGC TT -3’-荧光分子;
所述引物为:F:5’-GAAAAA CCA GGGATC TTTAAC-3’,R:5’-GCA ATT TGC TAA GTTTAAAA-3’。
其中,所述探针上的荧光分子为FAM和/或BQ1。
本发明还提供了一种非髓样甲状腺癌的筛查试剂盒,它包括任选的用于 检测人类MAP2K5基因第1100位碱基变异的相关试剂;所述检测人类 MAP2K5基因第1100位碱基变异的相关试剂是ARMS-PCR检测用试剂。
其中,所述筛查试剂是检测乳头状甲状腺癌的筛查试剂。
其中,所述试剂是检测人类MAP2K5基因第1100位T→C变异的相关 试剂。
其中,所述ARMS-PCR检测用试剂包括探针和扩增引物;
所述探针为:荧光分子-5’-ACT TTT CTT TTT CCT GAT GGC TGC TT -3’-荧光分子;
所述引物为:F:5’-GAAAAA CCA GGGATC TTTAAC-3’,R:5’-GCA ATT TGC TAA GTTTAAAA-3’。
其中,其特征在于:所述探针上的应该分子为FAM。
本发明还提供了一种探针,其为荧光分子-5’-ACT TTT CTT TTT CCT GAT GGCTGC TT-3’-荧光分子。
其中,所述探针上的荧光分子为FAM和/或BQ1。
本发明还提供了一对DNA引物,其序列为:F 5’-GAAAAA CCA GGG ATC TTTAAC-3’,R 5’-GCAATT TGC TAA GTT TAA AA-3’。
本发明发现了变异的人类MAP2K5基因,它是第1100位碱基突变为C 的人类MAP2K5变异基因。
本发明还发现了一种变异的人类MAP2K5蛋白,它是第367位氨基酸突 变为苏氨酸的人类MAP2K5变异蛋白。
本发明通过对乳头状甲状腺癌家族的研究,发现了与甲状腺癌高发的突 变基因以及具体的位点,即MAP2K5 c.G961A和MAP2K5 c.T1100C。
前一个位点是MAP2K5基因编码区第961位碱基由G突变为A,对应 的MAP2K5蛋白第321位氨基酸由丙氨酸突变为苏氨酸。后一个位点是 MAP2K5基因编码区第1100位碱基由T突变为C,对应的MAP2K5蛋白第 367位氨基酸由甲硫氨酸突变为苏氨酸。经过进一步实验验证,发现该突变 位点会导致后续细胞通路的改变,使得癌症相关的基因大幅度上调,推动甲 状腺滤泡上皮细胞恶性转变。
本发明的测定方法测定来源于人的基因组DNA,样品没有限制,如体液 (如血液、腹水和尿液)、组织细胞(如肝组织)等,通过提取和纯化这些样 品均可制备基因组DNA。
本发明提供的试剂盒,可以有效筛查待检人群的对患甲状腺癌的可能性, 应用前景良好。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段, 在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、 替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步 的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。 凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为被调查对象候选突变及MAP2K5突变概况图:A,MAP2K5 c.G961A测序图,箭头所示为突变位点;B,MAP2K5 c.T1100C测序图,箭 头所示为突变位点;C,蛋白质MAP2K5中A321T和M367T的功能域信息; D,不同物种间MAP2K5 A321T和M367T的保守分析。
图2为FNMTC患者(F1-F4)和SNMTC患者(S1-S4)血白细胞的ERK5 基因、MAP2K5-ERK5途径靶基因的表达情况:A,ERK5表达情况;B, MAP2K5-ERK5途径靶基因的mRNA热图;C-H,靶基因FOSB,MEF2, PPARG,JUN,CDK4和CCND1的详细表达水平。
图3为FNMTC患者(F1-F4)和SNMTC患者(S1-S4)的甲状腺癌旁 组织和肿瘤组织中MAP2K5、ERK5、FRA1、MEF2基因的表达情况:A-H, MAP2K5在FNMTC患者与SNMTC患者间表达情况;I-K,癌旁组织中ERK5、 FRA1和MEF2表达情况,横坐标标签的N表示“正常组织”;L-N,癌组织 中ERK5、FRA1和MEF2表达情况,横坐标标签的T表示“癌组织”。
图4为SNMTC和FNMTC患者正常滤泡上皮组织和肿瘤组织的Ki67 染色图和判别图:A-B,正常组织染色;C-D,癌组织染色;E,三个临床病 理医生对染色结果的判读。
图5为TUNEL荧光素染色检测凋亡的图。
图6为转基因细胞构建图:A,GV358载体结构;B-C,重组载体Sanger 测序验证图;D多基因位点验证的B-CPAP细胞系;E-H,WT组、Mu1组、 Mu2组和GFP组的绿色荧光镜检图。
图7为MAP2K5示意图和转基因细胞的ERK5检测图:A,MAP2K5蛋 白三级结构及突变位点示意图;B,磷酸化ERK5蛋白检测图;C,对照蛋白 检测图;D-F,WT组ERK5蛋白亚细胞定位图;G-I,Mu1(A321T)组ERK5 蛋白亚细胞定位图。
图8为转基因细胞各组的MAP2K5-ERK5通路靶基因表达图。
具体实施方式
释义:
MAP2K5 c.G961A:MAP2K5基因第961位G→A变异;
MAP2K5 p.A321T或MAP2K5 A321T:MAP2K5蛋白第321位氨基酸由A 突变为T,此变异可由MAP2K5 c.G961A导致;
MAP2K5 c.T1100C:MAP2K5基因第1100位T→C变异;
MAP2K5 p.M367T或MAP2K5 M367T:MAP2K5蛋白第367位氨基酸由M 突变为T,此变异可由MAP2K5 c.T1100C导致;
FNMTC患者:家族性滤泡细胞来源的非髓样甲状腺癌患者;没有其他家族 性疾病,至少两名一级亲属被诊断为滤泡细胞来源的非髓样甲状腺癌的家系 患者;
SNMTC患者:散发性滤泡细胞来源的非髓样甲状腺癌患者,MAP2K5基因 未突变。
实施例1突变基因MAP2K5 c.T1100C的检测
一、本发明试剂盒的组成
PCR扩增试剂(50人份):
组分 | 1人份量 | 50人份量 |
MgCl2 | 5-10mmol | 500mmol |
dUTP PLUS | 0.5l | 25l |
各条引物 | 0.1-1l | 50l |
各条探针 | 0.5-1.5mol | 75mol |
UNG | 0.2l | 19l |
Taq | 0.3l | 15l |
总体系 | 20l | 1000l |
MAP2K5基因c.T1100C突变的扩增引物以及检测探针:
F:5’-GAA AAA CCA GGG ATC TTT AAC-3’(SEQ ID NO.1)
R:5’-GCAATT TGC TAA GTT TAAAA-3’(SEQ ID NO.2)
探针:
FAM-5’-ACT TTT CTT TTT CCT GAT GGC TGC TT-3’-BQ1(SEQ ID NO.3)
二、采用本发明试剂盒检测
1、样本DNA提取:可以使用Qiagen公司、天根公司、Promega公司等 DNA提取试剂盒提取。
以石蜡组织样本,用Qiagen公司试剂盒为例,提取DNA。
1.利用手术刀取出组织边界无用的石蜡;
2.将石蜡包埋组织切成4m厚的薄片;
3.迅速用灭菌小镊子取2-6枚装入DNase/RNase Free EP管中(每 张摊开面积500(最大)mm2,即边长1.6cm的正方形大小;
4.加入800l二甲苯,振荡器上震荡10s,最大转数离心3分钟;
5.加入800l二甲苯,振荡器上震荡10s,最大转数离心3分钟;
6.弃二甲苯,加入800l无水乙醇,最大转数离心3分钟;
7.弃无水乙醇,挥干样品;
8.加入180l ALT buffer及20l proteinase K,56℃一小时以上, 直至清亮;
9.90℃一小时;
10.离心6000g 1min,取上清;(此步骤是防止沉淀物阻塞柱子)
11.加入200lAL,混匀,加入200l乙醇,再混匀;
12.简单离心清洁管壁;
13.将全部混合液加入到DNA分离柱,关盖,离心6000g 1min,换 新的收集管;
14.加入500l AW1,6000g离心1min;换收集管;
15.加入500l AW2,6000g离心1min,换收集管;
16.全速离心3min,干燥柱子;
17.换一只干净的1.5ml收集管,准备收集DNA;加入20-30l ATE, 在室温保持1min以溶解DNA。全速离心1min收集DNA。
2、定量PCR扩增
定量PCR体系配制:
BIO-RAD CFX96机器PCR热循环程序设置:
3、结果判读:
以外控信号为标准,其信号Ct值在15-25,表明上样DNA的量在允许 范围以内。所有实验样本的内控曲线(HEX)均应该升起,否则重新提取 DNA检测。读取待检孔(孔号1)Ct值,Ct值为0(或者无扩增曲线)或者 大于29判读阴性,判定为无c.T1100C突变;Ct值小于28判读该信号孔阳 性。28~29重复实验,若Ct值仍然在28~29判读c.T1100C突变弱阳性突变。
实施例2突变基因MAP2K5 c.T1100C的检测
1.DNA提取
取全血样本200微升,采用新百基UPure Blood DNA Extraction Kit(M2002-01)试剂盒,按新百基UPure Blood DNA Extraction Kit(M2002-01) 试剂盒说明书提取。
2.PCR扩增
1)PCR引物:
上游引物为:5′-TCATAATGTGTCCAAGTGAGTC-3′(SEQ ID NO.4)
下游引物为:5′-TTTACAGTGGAGTGGAAAGAAA-3′(SEQ ID NO.5)
浓度:100μmol/L
2)体系配制:
3)反应程序:
步骤 | 温度 | 时间 |
1 | 94℃ | 3min |
2 | 94℃ | 30s |
3 | 60℃ | 30s |
5 | 72℃ | 1min |
6 | 返回2步,共30次 | |
7 | 72℃ | 3min |
3.sanger测序
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,鉴定产物大小后送样测序,检测相关位 点是否突变.。
4.结果判读
将测序结果比对到参考基因组上,若发现第15号染色体第68040594位 为C(参考序列应是T),即检测到了MAP2K5 c.T1100C。
本发明方法可以有效检测检测MAP2K5基因第1100位碱基由T到C的 突变。
为了说明MAP2K5 c.T1100C对非髓样甲状腺癌的促进作用,以下以实 验例的方式说明。
实验例MAP2K5 c.G961A/c.T1100C突变与非髓样甲状腺癌的相关性
1.方法
1.1伦理和患者信息
本研究经华西医院伦理委员会批准并执行(2015-108)。FNMTC被定 义为没有其他家族性疾病,至少两名一级亲属被诊断为滤泡细胞来源的甲状 腺癌的家系患者。在这项研究中,共有77名FNMTC患者符合这些标准。 FNMTC患者来自34个家庭(女性与男性之比为3.53∶1),均被诊断为甲 状腺乳头状癌。
1.2Sanger测序和基因频率查询
提取前述患者的DNA,并设计侧翼引物以扩增靶区域突变位点。根据 制造商的方案,使用BigDye 3.1终止子测序试剂盒(Applied Biosystems), 在ABI 3730xL测序仪(Applied Biosystems,USA)上对纯化的PCR产物进 行测序。
在Novo-Zhonghua Genomes(诺禾-中华基因组计划)数据库中查找 MAP2K5c.G961A/c.T1100C位点的突变基因频率。
1.3RT-qPCR测定
对于新鲜样本和细胞样本,使用Invitrogen TRIzol试剂(Cat.15596026, ThermoFisher,美国)提取总RNA。对于福尔马林固定的石蜡包埋的样品, 使用Qiagen RNeasyFFPE试剂盒(Cat.73504,Qiagen Inc,德国)提取总RNA。 为了逆转录,按照制造商的说明,使用Qiagen Omniscript RT试剂盒 (Cat.205111,Qiagen)将1mg mRNA在20ul反应体系中转化为cDNA。并 使用Bio-Rad Real-Time PCR系统(Bio-Rad Inc,USA)进行qPCR。利用 对照基因(GAPDH,ACTIN和GFP)标准化后比较靶基因的相对mRNA表 达。
1.4免疫组化
对于人样品,在4-μm厚石蜡切片上进行免疫组化染色。将载玻片在二 甲苯中脱石蜡并通过梯度乙醇溶液再补水。在室温下使用3%过氧化氢将内’ 源性过氧化物酶封闭15分钟。用双蒸水洗涤载玻片,然后将载玻片在微波 炉中孵育15分钟进行抗原修复,然后用PBS洗涤。然后将载玻片与每种单 克隆抗体的工作稀释液在4℃温育过夜。用PBS洗涤载玻片并使用DAKO EnVision+系统(K5007,Denmark)染色。使用针对Ki-67(1∶200稀释;Cat.RM-9106-S0,Thermo Fisher)的单克隆抗体和针对MEK5的多克隆抗体 (1∶200稀释;Cat.ab210748,Abcam,USA)。最后,将载玻片用苏木精 复染。
1.5TUNEL分析
凋亡检测系统Fluorescein(Promega G3250),将3′-OH DNA末端掺入 荧光素-12-dUTP通过末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)作用来检测凋亡细胞的 片段化DNA。将石蜡包埋的组织加工成4-μm石蜡切片用于TUNEL凋亡细 胞检测。将切片在二甲苯中脱蜡并通过梯度乙醇溶液再补水。将切片在 0.85%NaCl中洗涤,然后用PBS洗涤。将切片与100μl20μg/ml蛋白酶k在 37℃温育10分钟。用100μl平衡缓冲液覆盖切片,然后用50μlTdT孵育缓 冲液覆盖。在没有TdT的情况下进行阴性对照。通过共聚焦显微镜检测阳 性细胞。
1.6突变体构建和慢病毒制备
使用TRIzol试剂(Invitrogen,15596-026,USA)提取总RNA。将RNA 重悬于超纯水中,并用DNA酶I(Ambion,AM2222)在37℃处理30分钟, 并根据制造商的说明用RNeasy Midi试剂盒(QIAGEN)进行RNA净化。使 用Omniscript逆转录试剂盒(205113,Qiagen)从2.0μg总RNA中随机引发 互补DNA(cDNA)。使用设计用于cDNA克隆的引物进行正常PCR和重 叠PCR方法。将PCR产物克隆到TA载体(Invitrogen,K451020V,USA; 用于克隆和DNA测序)中并进行测序。将测序正确的基因片段克隆到GV358 载体(吉凯,中国)的Age I位点。通过将上述构建体与包装质粒共转染到 HEK293T细胞中产生慢病毒,并且在转染后48小时,收集HEK293T细胞 培养基用于下一个实验。
1.7细胞培养和转染
按照说明培养人甲状腺癌细胞系B-CPAP(DSMZ No.ACR 273)。通 过STR测定验证细胞身份。然后通过过表达野生型(WT)MAP2K5,MAP2K5 A321T和M367T的慢病毒以及空慢病毒表达GFP转染B-CPAP细胞系。终 浓度为4μg/ml的嘌呤霉素用于筛选稳定感染病毒的细胞系。最后,获得四 种腺病毒感染的细胞系,其具有稳定的靶基因表达。
1.8免疫荧光染色
将稳定表达MAP2K5,MAP2K5 A321T和MAP2K5 M367T的B-CPAP 细胞系接种并在六孔板中培养。ERK5(批号:AP070721,博科,中国), 磷酸化ERK5(Thr218+Tyr220)(批号:AE050702,博科,中国),磷酸 化ERK5(Ser731+Thr733)(批号:AC09223656,博科,中国)和磷酸化 ERK5(Ser496)(批号:AC11012356,博科,中国)用作靶蛋白检测的一 抗。标记的二抗用于荧光检测。细胞核用DAPI染色。最后,通过Nikon 双光子共聚焦显微镜分析图像。
1.9磷酸化检测
在该研究中通过磷酸化的ERK5(Thr218+Tyr220)(批号:AE050702, 博科,中国),磷酸化的ERK5(Ser731+Thr733)(批号:AC09223656, 博科,中国)和磷酸化的ERK5(Ser496)(批号:AC11012356,博科,中 国)检查了ERK5的五个磷酸化位点。HRP偶联的抗第二抗体用于进一步 研究,然后与辣根过氧化物酶缀合的二抗(抗兔)孵育磷酸化的ERK5(Thr218 +Tyr220),磷酸化的ERK5(Ser731+Thr733)和磷酸化的ERK5(Ser496) 或对于GAPDH和GFP二抗(抗鼠)孵育。使用ECL Plus Western印迹检 测试剂(WBULS0500,Millipore Inc,USA)使蛋白质条带可视化,并使用 Image Quant TL版本2003.02软件在Storm860PhosphorImager上检测和定 量。
1.10MAP2K5中A321T和M367T的计算模型
MAP2K5残基146-438的天然和突变模型A321T和M367T均由 Swiss-Model Server从人Mek-1激酶(PDB:3SLS)的蛋白质晶体结构产生 (Nucleic Acids Res。2014年7月;42[网络服务号:W252-8])。使用PyMOL 软件(DeLano WL.2002;PyMOL molecular graphicssystem,DeLano Scientific, Palo Alto,CA.http://www.pymol.org)生成本文中显示的模型。
1.11统计分析
使用SPSS(版本22.0;SPSS Inc.,Chicago,USA)进行统计分析。通 过两组的student t检验,在P<0.05时认为具有显著统计学差异,多组的单 因素方差分析(方差分析)分析。所有测试均为双侧,P<0.05被认为具有 统计学意义。
2.结果
2.1被调查对象的MAP2K5突变
MAP2K5 c.G961A(p.A321T)在一个家庭中的三个一级亲属中被发现。 MAP2K5c.T1100C(p.M367T)在另一个家庭中的两个一级亲属中被发现。就 基因频率而言,A321T和M367T在FNMTC患者中的基因频率分别为0.0390 和0.0259;而健康中国人对照(诺禾-中华基因组计划,n=2200,P<0.001)的 前述两个位点基因频率分别为0和0.00022523。可见MAP2K5 A321T和 M367T与FNMTC具有极为显著的相关性。
MAP2K5 c.G961A(p.A321T)和MAP2K5 c.T1100C(p.M367T)的Sanger 测序结果如图1A、B所示。
图1C展示了前述两个突变位点在MAP2K5中的位置。
图1D则显示前述两个突变位点对应的野生型碱基是十分保守的,其在 人类、大鼠、牛等动物中都具有很高的同源性。
2.2突变后的MAP2K5激活MAPK-ERK5信号通路
发明人使用RT-qPCR检测MAP2K5突变人群中,MAP2K5下游基因 ERK5,以及MAP2K5-ERK5途径的下游基因的表达。
在血液白细胞中,FNMTC人群比SNMTC人群的FOSB、MEF2、 PPARG、CDK4、和CCND基因的表达量高(图2)。
在甲状腺组织中,无论是恶性组织、还是健康组织,FNMTC人群和 SNMTC人群的前述基因表达没有显著差别,但下游靶基因ERK5、FRA1、 MEF2等的表达在MAP2K5突变NMTC人群中表达更高(图3)。
进一步地,Ki67染色(图4)和TUNEL检测(图5)显示,SNMTC与 FNMTC人群的细胞增殖和凋亡水平无显著差异。
2.3MAP2K5突变导致ERK5蛋白的Ser496和Ser731+Thr733磷酸化
MAP2K5蛋白结构示意图及突变位点如图7A所示。
将MAP2K5野生型(WT组)、MAP2K5 A321T(Mu1组)和MAP2K5 M367T(Mu2组)三种基因分别整合到GV358载体(带CMV启动子和EGFP 标签),通过腺病毒,转入人甲状腺癌细胞株B-CPAP(DSMZ No.ACC 273); 空载的GV358载体通过腺病毒转入B-CPAP作为对照(GFP组)(图6)。
然后使用商业化的抗体检测(通过蛋白免疫印迹)ERK5的磷酸化位点, 其对应磷酸化位点分别有Ser496、Ser731+Thr733以及Thr218+Tyr220。对 于过表达GFP,WT,Mu1和Mu2的B-CPAP,GAPDH和GFP均用作参照 以确保内源和外源蛋白的总量约为相同水平(图7B和C)。
结果发现,以GFP作为参照,过表达WT,Mu1和Mu2的B-CPAP显 着提高下游ERK5的总量(图7C)。进一步检测ERK5磷酸化位点:Ser496, Ser731+Thr733和Thr218+Tyr220。与GFP和WT组相比,Mu1和Mu2组 的Ser496的ERK5的磷酸化水平显着增加(图7B)。此外,与GFP和WT组相比,Mul组中ERK5 Ser731+Thr733磷酸化水平显着增加(图7B)。
2.4磷酸化的ERK5转运到细胞核调控下游基因表达
发明人使用免疫荧光染色对上述转基因细胞中的ERK5亚细胞定位进行 检测。发现,在MAP2K5过表达组中,p-ERK5 Ser731+Thr733位于整个细 胞质中(图7D-7F);然而,在MAPK2K5 A321T过表达组中,下游p-ERK5 Ser731+Thr733仅位于细胞核中(图7G-7I)。表明MAPK2K5 A321T突变 导致ERK5转运到细胞核。
发明人进一步分析上述转基因细胞的靶基因表达。结果显示大多数 MAPK-ERK5信号传导靶标在A321T和M367T组中上调,如ERK5,FOSB, MEF2,CDK4,CCND1和FRA1,其中JUN和PPARG仅在一组中上调(图 8)。
实验例结果表明,MAP2K5突变导致ERK5磷酸化,进一步引起ERK5 转运到细胞核中,进而调控下游基因,使得癌症相关的基因大幅度上调,推 动甲状腺滤泡上皮细胞恶性转变,导致甲状腺癌的患病几率上升。
综上,本发明阐明了MAP2K5基因第1100位碱基由T到C的变异与甲状腺 癌的相关性;使用本发明的试剂盒对人的组织进行检测,如果检测到所述突 变,即可判断被检人群存在甲状腺癌的风险。本发明可用于甲状腺癌的辅助 诊断。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学华西医院
<120> 一种人类MAP2K5第1100位碱基突变基因的ARMS-PCR检测试剂盒
<130> GY026-2018P012680CC
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gaaaaaccag ggatctttaa c 21
<210> 2
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<212> DNA
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<400> 2
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acttttcttt ttcctgatgg ctgctt 26
Claims (13)
1.检测人类MAP2K5基因第1100位碱基变异的相关试剂在制备非髓样甲状腺癌筛查试剂中的用途;所述检测人类MAP2K5基因第1100位碱基变异的相关试剂是ARMS-PCR检测用试剂。
2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于:所述筛查试剂是检测乳头状甲状腺癌的筛查试剂。
3.根据权利要求1所述的用途,其特征在于:所述试剂是检测人类MAP2K5基因第1100位T→C变异的相关试剂。
4.根据权利要求4所述的用途,其特征在于:所述ARMS-PCR检测用试剂包括探针和扩增引物;
所述探针为:荧光分子-5’-ACT TTT CTT TTT CCT GAT GGC TGC TT-3’-荧光分子;
所述引物为:F:5’-GAA AAA CCA GGG ATC TTT AAC-3’,R:5’-GCA ATT TGC TAA GTTTAA AA-3’。
5.根据权利要求1所述的用途,其特征在于:所述探针上的荧光分子为FAM和/或BQ1。
6.一种非髓样甲状腺癌的筛查试剂盒,其特征在于:它包括任选的用于检测人类MAP2K5基因第1100位碱基变异的相关试剂;所述检测人类MAP2K5基因第1100位碱基变异的相关试剂是ARMS-PCR检测用试剂。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于:所述筛查试剂是检测乳头状甲状腺癌的筛查试剂。
8.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于:所述试剂是检测人类MAP2K5基因第1100位T→C变异的相关试剂。
9.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于:所述ARMS-PCR检测用试剂包括探针和扩增引物;
所述探针为:荧光分子-5’-ACT TTT CTT TTT CCT GAT GGC TGC TT-3’-荧光分子;
所述引物为:F:5’-GAA AAA CCA GGG ATC TTT AAC-3’,R:5’-GCA ATT TGC TAA GTTTAA AA-3’。
10.根据权利要求9所述的用途,其特征在于:所述探针上的应该分子为FAM。
11.一种探针,其特征在于:其为荧光分子-5’-ACT TTT CTT TTT CCT GAT GGC TGCTT-3’-荧光分子。
12.根据权利要求9所述的探针,其特征在于:所述探针上的荧光分子为FAM和/或BQ1。
13.一对DNA引物,其特征在于:其序列为:F:5’-GAA AAA CCA GGG ATC TTT AAC-3’,R:5’-GCA ATT TGC TAA GTT TAA AA-3’。
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