CN107630091B - Myosin1b基因或蛋白的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了Myosin1b基因或蛋白的应用，属于基因检测领域。本发明首次发现了Myosin1b基因表达与宫颈癌相关，通过检测受试者宫颈黏膜中Myosin1b的表达情况，可以判断受试者是否患有宫颈癌、或者判断受试者是否存在患有宫颈癌的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。本发明公开了一种可用于宫颈癌临床诊断、靶向治疗的分子标志物‑Myosin1b基因。相较传统的宫颈癌诊断和治疗方法，使用基因标志物来检测、诊断和治疗宫颈癌具有及时性、特异性和灵敏性的特点，有利于预知癌症风险，制定有针对性的治疗计划，准确评估癌症转归及预后情况。

Description

Myosin1b基因或蛋白的应用

技术领域

本发明属于基因检测领域，具体涉及Myosin1b基因或蛋白的应用。

背景技术

宫颈癌(Cervical Cancer,CC)是全球女性最常见的妇科恶性肿瘤之一，其病死率逐年上升且发病呈年轻化趋势，严重威胁女性生命健康。早期诊断及明确肿瘤分级和分期，对临床上制定治疗方案和估计预后有重要参考价值，但目前用于宫颈癌的诊断方法及指标尚不理想。尽管临床上采取治疗、放疗或生物治疗等多种疗法相结合已显著降低患者死亡率，但宫颈癌细胞的侵袭、转移进而复发，仍是绝大多数患者治疗失败最后导致死亡的主要原因。

细胞的侵袭和转移主要是细胞运动能力改变的结果，这一过程涉及细胞骨架肌动蛋白和肌球蛋白(Myosin)的调控作用。Myosin1b作为其中的一种肌球蛋白亚型，是构成细胞骨架微丝的重要组分，可能在肌动蛋白细胞骨架重组、纤维运动、血管生成、细胞-细胞间黏附以及蛋白转运等生物学过程中发挥重要作用。但目前关于Myosin1b基因或蛋白与宫颈癌的关系和临床应用未见相关报道。

明确Myosin1b基因或蛋白与宫颈癌细胞侵袭转移等生物学行为的关系，对研究基于此特点的宫颈癌分子诊断方法、靶向治疗药物具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供Myosin1b基因或蛋白在制备宫颈癌辅助诊断及治疗药剂中的新应用。

本发明所采取的技术方案是：

发明人发现，Myosin1b基因或蛋白可作为宫颈癌新的诊断标志及治疗靶标，Myosin1b蛋白在正常宫颈上皮组织细胞及宫颈癌旁正常组织细胞中表达较低，而其在宫颈癌组织细胞中的表达异常升高，而且维持了宫颈癌细胞的快速侵袭转移的活性，在宫颈癌的发生发展中发挥重要作用。因此，Myosin1b基因(如SEQ ID NO.1所示)或蛋白(如SEQ IDNO.2所示)可作为宫颈癌新的分子标志物，用于宫颈癌的临床诊断、肿瘤患者临床治疗。

抑制Myosin1b基因表达或翻译的制剂在制备治疗宫颈癌药物中的应用。

优选的，抑制Myosin1b基因表达或翻译的制剂包括Myosin1b基因启动子抑制剂、Myosin1b增强子抑制剂、Myosin1b基因的siRNA、寡核苷酸、甲基化试剂。

在体内使Myosin1b蛋白活性降低或失活的制剂在制备治疗宫颈癌药物中的应用。

优选的，在体内使Myosin1b蛋白活性降低或失活的制剂包括Myosin1b蛋白抗体、Myosin1b酶活性抑制剂。

一种宫颈癌辅助诊断试剂，该试剂含有检测Myosin1b基因扩增量和/或Myosin1b蛋白表达量的试剂。

进一步，所述试剂包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测Myosin1b基因扩增量或蛋白表达量的试剂。

进一步，所述RT-PCR相关试剂包括一对特异扩增Myosin1b基因的引物；所述荧光定量PCR相关试剂至少包括一对特异扩增Myosin1b基因的引物；所述免疫检测相关试剂包括：与Myosin1b蛋白特异性结合的抗体；所述原位杂交相关试剂包括：与Myosin1b基因的核酸序列杂交的探针；所述芯片诊断相关试剂包括蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白质芯片包括与Myosin1b蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与Myosin1b基因的核酸序列杂交的探针。

进一步，所述基因芯片可用于检测包括Myosin1b基因在内的多个基因(例如，与宫颈癌相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括Myosin1b蛋白在内的多个蛋白质(例如与宫颈癌相关的多个蛋白质)的表达水平。通过同时检测多个与宫颈癌相关的分子标志物，可大大提高宫颈癌诊断的准确率。

本发明中与Myosin1b基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

本发明中所述Myosin1b蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述Myosin1b蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰，例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab')2、Fv等。只要所述片段能够保留与Myosin1b蛋白的结合能力即可。用于检测蛋白质水平的抗体的制备是本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体，如所述的片段可以通过化学法从头合成或利用重组DNA技术合成。

在本发明的上下文中，“Myosin1b基因”包括人Myosin1b基因以及人Myosin1b基因的任何功能等同物的多核苷酸。Myosin1b基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中Myosin1b基因(文中位置)DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

Myosin1b基因的编码序列包括以下任一种DNA分子：

(1)序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列。

(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70％、优选地，90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。

在本发明的具体实施方案中，所述Myosin1b基因的编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA序列。

在本发明的上下文中，Myosin1b基因表达产物包括人Myosin1b蛋白以及人Myosin1b蛋白的部分肽。所述Myosin1b蛋白的部分肽含有与宫颈癌相关的功能域。

“Myosin1b蛋白”包括Myosin1b蛋白以及Myosin1b蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括Myosin1b蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与人Myosin1b的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。

Myosin1b蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：

(1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

(2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。

(3)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，优选地，与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。

在本发明的具体实施方案中，所述Myosin1b蛋白是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。

通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。

通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是Myosin1b蛋白的融合蛋白。对于与蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留Myosin1b蛋白的生物学活性即可。

本发明的Myosin1b蛋白也包括对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留Myosin1b蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。

在本发明的上下文中，“诊断宫颈癌”既包括判断受试者是否已经患有宫颈癌、也包括判断受试者是否存在患有宫颈癌的风险。

在本发明的上下文中，“治疗宫颈癌”包括能消除、减轻、缓解、逆转或预防或延迟病症的任何症状的发生和复发，即包括对疾病的治疗性干预和预防性干预。

本发明的有益效果：

本发明首次发现了Myosin1b基因表达与宫颈癌相关，通过检测受试者宫颈黏膜中Myosin1b的表达情况，可以判断受试者是否患有宫颈癌、或者判断受试者是否存在患有宫颈癌的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。

本发明公开了一种可用于宫颈癌临床诊断、靶向治疗的分子标志物——Myosin1b基因。相较传统的宫颈癌诊断和治疗方法，使用基因标志物来检测、诊断和治疗宫颈癌具有及时性、特异性和灵敏性的特点，有利于预知癌症风险，制定有针对性的治疗计划，准确评估癌症转归及预后情况。

附图说明

图1显示免疫组化检测Myosin1b在宫颈癌旁正常组织及宫颈癌组织标本中表达情况；

图2显示利用荧光定量PCR对宫颈癌旁正常组织及宫颈癌组织细胞中的Myosin1b基因mRNA表达情况的检测结果；

图3显示利用Western-Blot检测敲减Myosin1b基因的蛋白表达结果；

图4显示经敲减Myosin1b基因后进行细胞划痕实验的检测结果；

图5显示经敲减Myosin1b基因后进行细胞Transwell实验的检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实验对本发明作进一步详细的说明。以下实验仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实验中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实验1免疫组化检测Myosin1b基因表达差异应用于宫颈癌诊断

本发明人经免疫组织化学方法，检测了Myosin1b基因在256例宫颈癌组织及28例正常宫颈上皮组织中的表达。

免疫组化检测具体步骤：

1)组织切片脱蜡至水，置于0.01M柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中，100℃微波抗原修复处理20min，自然冷却至室温；

2)蒸馏水冲洗后，滴加3％二氧化氢孵育15min；然后用0.01M磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)冲洗次3次，每次3min；

3)滴加1:150稀释的myosin1b抗体，37℃孵育60min后，用PBS冲洗3次，每次3min；

4)接着滴加辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗试剂，37℃孵育30min后，用PBS冲洗3次，每次3min。最后用3,3'-二氨基联苯胺(DAB)显色3min，Mayer苏木素复染3min；

5)梯度酒精脱水、透明、封固。

免疫组化评分标准：评分标准取决于阳性细胞百分数和染色强度。阳性细胞百分数：400倍视野下随机选取10个视野，计算阳性细胞比例(≤5％＝1，6～25％＝2，51～75％＝3，≥75％＝4)、染色强度(无染色为0分，弱染色为1分，中度染色为2分，强染色为3分)。将阳性细胞百分数和染色强度两项相乘：阴性(0)，+(1-4分)，++(5-8分)，+++(9-12分)。

数据分析：统计分析使用SPSS 18.0软件进行，采用χ²检验分析Myosin1b表达水平与各种临床资料的关系，数据之间相关性分析采用Spearman相关性。P<0.05认为具有统计学意义。图1显示免疫组化检测Myosin1b在正常宫颈上皮组织及宫颈癌组织标本中表达情况。图1A为Myosin1b阴性表达的正常宫颈上皮组织(病例14)，图1B为Myosin1b阴性表达的宫颈癌组织(病例48)，图1C和D为Myosin1b阳性表达的宫颈癌组织(病例119和病例73)，图1E、F、G、H分别为A、B、C、D中黑框区域在400×高倍镜下的照片。

结论：Myosin1b在正常宫颈上皮组织中阳性表达率远低于在宫颈癌组织中阳性表达率(7.1％vs54.4％)，且Myosin1b表达强度与宫颈癌Figo分期(P＝0.003)、病理分级(P＝0.020)和淋巴结转移(P<0.001)呈正相关。因此，采用免疫组化、免疫荧光和实时定量PCR等方法对患者宫颈病变组织中的表达水平进行检测，有助于鉴别诊断宫颈上皮良性病变与宫颈癌。

实验2荧光定量PCR检测Myosin1b基因的差异表达

组织来源和细胞来源：收集宫颈癌及癌旁正常子宫颈组织20例，以便后续分析；宫颈癌Caski和SiHa细胞于含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养液中，37℃、5％CO₂条件下培养。每2～3天换液传代培养。

荧光定量PCR检测具体步骤：

1)RNA提取：使用购自TaKaRa公司的Total RNA提取试剂盒，按其说明书指示的步骤并做适当优化操作。

2)逆转录：使用购自TaKaRa公司的反转录试剂盒，按其说明书指示的步骤并做适当优化操作。

Myosin1b引物序列：

正向引物：5'-GGTCTGGTGTGGAGGTCCTATT-3'(SEQ ID NO.3)；

反向引物：5'-CGTTGCTTCCTCAGGTCTTCTT-3'(SEQ ID NO.4)。

β-actin引物序列：

正向引物：5'-CAGCCTCAAGATCATCAGCATT-3'(SEQ ID NO.5)；

反向引物：5'-TGTGGTCATGAGTCCTTCCATT-3'(SEQ ID NO.6)。

以SYBR Green作为荧光标记物，在荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，2^-ΔΔCt法进行相对定量。

统计学方法：实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P＜0.05时具有统计学意义。

结果：如图2所示，与宫颈癌组织细胞相比，Myosin1b基因在正常子宫颈组织细胞中下调，差异具有统计学意义(P＜0.05)，与免疫组化结果一致。

实验3利用RNAi技术可有效沉默Myosin1b基因的表达

1)细胞培养：如实验2中所示。

2)Myosin1b基因干扰敲减：根据Myosin1b基因的编码序列设计干扰序列，siRNA购自上海吉玛生物科技有限公司。

Myosin1b引物序列：

正向引物：5'-GGTCTGGTGTGGAGGTCCTATT-3'(SEQ ID NO.3)；

反向引物：5'-CGTTGCTTCCTCAGGTCTTCTT-3'(SEQ ID NO.4)。

Myosin1b siRNA干扰序列：

正向引物：5'-GCUUACCUGGAAAUCAACAAG-3'(SEQ ID NO.7)；

反向引物：5'-CUUGUUGAUUUCCAGGUAAGC-3'(SEQ ID NO.8)。

3)转染实验：siRNA干扰实验中设置对照组(转染空白脂质体)和实验组(转染siRNA脂质体)采用Invitrogen公司的转染试剂Lipofectamine 2000，按说明书进行适当优化操作。

4)利用Western-Blot检测转染结果：使用购自碧云天生物技术公司的Western-Blot试剂盒，按其说明书指示的步骤并做适当优化操作。

5)数据分析：用SPSS 18.0统计软件处理数据，实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值士标准差的方式来表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

结果：图3A为干扰后72h，Caski和SiHa细胞中Myosin1b蛋白的表达情况；图3B为干扰后48h，Caski和SiHa细胞中Myosin1b mRNA的表达情况。如图3所示，两种宫颈癌细胞Caski和SiHa中，与对照组相比，干扰组细胞中Myosin1b基因及蛋白表达均明显降低，显示siRNA敲减Myosin1b基因效果良好。

实验4Myosin1b基因对宫颈癌细胞侵袭迁移能力的影响

1、利用划痕实验检测Myosin1b基因对细胞迁移能力的影响。

1)细胞培养：如实验2中所示。

2)细胞转染：如实验3中所示。

3)细胞划痕修复：用无菌200μL的枪头制作细胞伤口模型；无菌PBS清洗3次以除去漂浮细胞。此时设为划痕后零时，拍照。继续培养，每隔24h在显微镜下观察划痕宽度，采并用数码相机拍照记录，比较不同细胞划痕修复速度和方式的差异。

4)数据分析：用SPSS 18.0统计软件处理数据，实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

5)结果：如图4所示，划痕实验发现Myosin1b基因高表达的细胞，其迁移运动距离明显长于Myosin1b基因低表达的细胞，差异有统计学意义(P＜0.05)，显示抑制Myosin1b表达会降低细胞迁移能力。

2、利用Transwell实验检测Myosin1b基因对细胞侵袭能力的影响。

1)细胞培养：如实验2中所示。

2)细胞转染：如实验3中所示。

3)Transwell实验：在Boyden下室加入含10％FBS的DMEM培养基，采用PVPF膜(8μm)将两室隔开。取转染后24h并无血清饥饿过的细胞，消化后计数，调整细胞浓度为4×10⁵/ml，向每个Transwell小室中加入100μL细胞悬液，每组设三个平行样本，置于孵箱培养24-48h，将PVDF膜取出，甲醇固定15min，用0.5％甲醇结晶紫溶液染色，200倍光学显微镜下计数10个视野的细胞，取平均值，统计分析。

4)数据分析：用SPSS 18.0统计软件处理数据，实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值士标准差的方式来表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

5)结果：如图5所示，Transwell实验发现Myosin1b基因高表达的细胞，其侵袭细胞数量明显多于Myosin1b基因低表达的细胞，差异有统计学意义(P＜0.05)，显示抑制Myosin1b表达会削弱细胞侵袭能力。

图4、图5结果表明：Myosin1b通过促进肿瘤细胞迁移能力、侵袭能力而促进宫颈癌的进展，沉默Myosin1b表达将抑制宫颈癌细胞的迁移能力和侵袭能力。因此，Myosin1b基因可以用于制备检测/治疗宫颈癌药物。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 南方医科大学

<120> Myosin1b基因或蛋白的应用

<130>

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3411

<212> DNA

<213> 人源

<400> 1

atggccaaaa tggaggtgaa aacctcactt ctggacaata tgattggagt tggggatatg 60

gttcttttag aacctctcaa tgaggagacc ttcatcaaca acctcaagaa gcgctttgac 120

cacagtgaaa tatacacata cattggaagt gtggttatat ctgttaaccc ataccggtct 180

ttacccattt attcaccaga gaaagtggaa gaatacagga acagaaattt ttatgaactg 240

agccctcaca tctttgccct ttcggatgaa gcatacagat ccctacgaga tcaagataag 300

gaccaatgta ttctcattac tggggaaagt ggagcaggaa aaacagaggc cagtaagctt 360

gtcatgtcct atgtggcagc tgtttgtgga aaaggagcag aagttaatca agttaaagaa 420

cagcttttac agtccaaccc ggtcctggaa gcttttggaa atgccaaaac tgtaaggaat 480

gacaactcct ctagatttgg caaatatatg gatattgaat ttgactttaa aggcgatcca 540

ctaggaggag taataagtaa ctatctttta gagaaatctc gggttgttaa acagccaaga 600

ggtgaaagaa acttccatgt gttctatcag ctgctctctg gtgcctctga agagctcctc 660

aataaactta agcttgagag ggatttcagc aggtataact acctgagtct ggattcggcc 720

aaagtgaatg gagtggatga tgcagcaaat tttagaaccg tgcggaatgc catgcagatt 780

gtgggcttta tggatcatga agctgagtct gtcttggcgg tggtggcagc agtgttgaaa 840

ctggggaaca ttgagttcaa gcccgaatct cgagtgaatg gtctagatga aagcaaaatc 900

aaagataaaa atgagttaaa agaaatttgt gaattgaccg gcattgatca atcagttcta 960

gaacgagcat tcagtttccg aacagttgag gccaaacagg agaaagtttc aactacactg 1020

aatgtggctc aggcttatta tgcccgtgat gctctggcta aaaacctcta cagcaggttg 1080

ttttcatggt tggtaaatcg aatcaatgaa agcattaagg cacaaacaaa agtgagaaag 1140

aaggtcatgg gtgttctgga catttatggc tttgagattt tcgaggacaa cagctttgag 1200

cagttcatta ttaattattg taacgaaaag ctgcaacaaa tcttcattga acttactctt 1260

aaagaagagc aggaggagta tatacgggag gatatagaat ggactcacat tgactacttc 1320

aataatgcta tcatttgtga cctaatagaa aataacacaa atggaatcct ggccatgctg 1380

gatgaagagt gcctcagacc tggcacagtc actgatgaga ccttcttaga aaagctgaac 1440

caagtatgtg ccacccacca gcattttgag agcaggatga gcaagtgctc tcggttcctc 1500

aatgacacgt ctctgcctca cagctgcttc aggatccagc attatgctgg aaaggtgctg 1560

taccaggtgg aaggattcgt tgacaaaaac aatgaccttc tctatcgaga cctgtcccaa 1620

gccatgtgga aggccagcca tgccctcatc aagtctttgt tccccgaagg gaatcccgcc 1680

aagatcaacc tgaaaaggcc tcctacagca ggctcacagt tcaaggcatc cgtggccact 1740

ctgatgaaaa acctacagac caagaaccca aactatatta ggtgtatcaa accgaatgat 1800

aaaaaagcag cacacatctt caacgaggct ctagtgtgtc atcagatcag gtacctgggg 1860

cttttggaga acgtccgagt gcggagggca ggctacgcct tcaggcaggc ctatgaacct 1920

tgcctagaaa gatacaaaat gctttgtaaa caaacatggc ctcattggaa aggaccagcc 1980

aggtctggtg tggaggtcct atttaatgaa ttagaaattc ccgtggaaga atactccttt 2040

ggtagatcaa agatattcat ccgaaaccca agaacattat tcaaattaga agacctgagg 2100

aagcaacgcc tggaggactt ggccactctc attcagaaga tatatcgggg gtggaaatgc 2160

cgcacacact tcctgctaat gaaaaaaagc caaattgtga ttgccgcctg gtacaggaga 2220

tatgcgcaac aaaagaggta ccagcagaca aagagttccg ccttagtaat tcagtcttat 2280

atccggggtt ggaaggctcg aaaaattctg cgggaactga agcatcaaaa gcgctgtaag 2340

gaagcagtca cgaccattgc tgcatattgg catgggaccc aggcacgaag ggaactgaga 2400

cggctgaagg aggaggctag gaataaacat gctattgcag ttatttgggc ttactggctt 2460

ggatctaagg ctcgaaggga attgaaacgc ttgaaggagg aggctaggcg taagcatgca 2520

gttgctgtca tttgggctta ctggcttgga ctgaaggtac gtagagaata caggaaattc 2580

ttcagagcca atgctggaaa gaaaatctat gagtttacgc ttcagagaat tgtgcaaaaa 2640

tacttcttgg aaatgaaaaa taagatgcct tccttatctc caatagacaa gaattggccc 2700

tcaagacctt acttattctt ggattctact cacaaggagc taaaaaggat tttccacttg 2760

tggaggtgta aaaaatacag ggaccaattc acagaccagc agaaacttat ttatgaagag 2820

aaactagaag ccagtgaact cttcaaagac aagaaggctt tatacccatc tagtgttggg 2880

caaccattcc aaggggctta cctggaaatc aacaagaacc ccaagtataa gaaactcaaa 2940

gatgccattg aagaaaagat catcattgct gaagtcgtga acaaaattaa ccgtgctaat 3000

gggaagagta catctcggat tttcctctta acaaacaata atctccttct tgctgaccaa 3060

aagtctggac aaatcaagtc agaggttcca ttggtggatg tgaccaaggt atcaatgagc 3120

tcacaaaatg atggcttctt cgccgtccac ctcaaagagg gctcagaagc agctagtaaa 3180

ggagactttc tcttcagcag tgatcacctg attgaaatgg ccaccaagct ctatcgcaca 3240

actctcagcc aaaccaaaca gaagctcaat attgagattt ccgatgagtt cctggtacag 3300

ttcagacagg acaaagtatg tgtgaagttt attcagggaa accagaaaaa tgggagtgtc 3360

ccaacatgta aacgaaaaaa caaccgtctc cttgaagttg ctgtccctta a 3411

<210> 2

<211> 1136

<212> PRT

<213> 人源

<400> 2

Met Ala Lys Met Glu Val Lys Thr Ser Leu Leu Asp Asn Met Ile Gly

1 5 10 15

Val Gly Asp Met Val Leu Leu Glu Pro Leu Asn Glu Glu Thr Phe Ile

20 25 30

Asn Asn Leu Lys Lys Arg Phe Asp His Ser Glu Ile Tyr Thr Tyr Ile

35 40 45

Gly Ser Val Val Ile Ser Val Asn Pro Tyr Arg Ser Leu Pro Ile Tyr

50 55 60

Ser Pro Glu Lys Val Glu Glu Tyr Arg Asn Arg Asn Phe Tyr Glu Leu

65 70 75 80

Ser Pro His Ile Phe Ala Leu Ser Asp Glu Ala Tyr Arg Ser Leu Arg

85 90 95

Asp Gln Asp Lys Asp Gln Cys Ile Leu Ile Thr Gly Glu Ser Gly Ala

100 105 110

Gly Lys Thr Glu Ala Ser Lys Leu Val Met Ser Tyr Val Ala Ala Val

115 120 125

Cys Gly Lys Gly Ala Glu Val Asn Gln Val Lys Glu Gln Leu Leu Gln

130 135 140

Ser Asn Pro Val Leu Glu Ala Phe Gly Asn Ala Lys Thr Val Arg Asn

145 150 155 160

Asp Asn Ser Ser Arg Phe Gly Lys Tyr Met Asp Ile Glu Phe Asp Phe

165 170 175

Lys Gly Asp Pro Leu Gly Gly Val Ile Ser Asn Tyr Leu Leu Glu Lys

180 185 190

Ser Arg Val Val Lys Gln Pro Arg Gly Glu Arg Asn Phe His Val Phe

195 200 205

Tyr Gln Leu Leu Ser Gly Ala Ser Glu Glu Leu Leu Asn Lys Leu Lys

210 215 220

Leu Glu Arg Asp Phe Ser Arg Tyr Asn Tyr Leu Ser Leu Asp Ser Ala

225 230 235 240

Lys Val Asn Gly Val Asp Asp Ala Ala Asn Phe Arg Thr Val Arg Asn

245 250 255

Ala Met Gln Ile Val Gly Phe Met Asp His Glu Ala Glu Ser Val Leu

260 265 270

Ala Val Val Ala Ala Val Leu Lys Leu Gly Asn Ile Glu Phe Lys Pro

275 280 285

Glu Ser Arg Val Asn Gly Leu Asp Glu Ser Lys Ile Lys Asp Lys Asn

290 295 300

Glu Leu Lys Glu Ile Cys Glu Leu Thr Gly Ile Asp Gln Ser Val Leu

305 310 315 320

Glu Arg Ala Phe Ser Phe Arg Thr Val Glu Ala Lys Gln Glu Lys Val

325 330 335

Ser Thr Thr Leu Asn Val Ala Gln Ala Tyr Tyr Ala Arg Asp Ala Leu

340 345 350

Ala Lys Asn Leu Tyr Ser Arg Leu Phe Ser Trp Leu Val Asn Arg Ile

355 360 365

Asn Glu Ser Ile Lys Ala Gln Thr Lys Val Arg Lys Lys Val Met Gly

370 375 380

Val Leu Asp Ile Tyr Gly Phe Glu Ile Phe Glu Asp Asn Ser Phe Glu

385 390 395 400

Gln Phe Ile Ile Asn Tyr Cys Asn Glu Lys Leu Gln Gln Ile Phe Ile

405 410 415

Glu Leu Thr Leu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Tyr Ile Arg Glu Asp Ile

420 425 430

Glu Trp Thr His Ile Asp Tyr Phe Asn Asn Ala Ile Ile Cys Asp Leu

435 440 445

Ile Glu Asn Asn Thr Asn Gly Ile Leu Ala Met Leu Asp Glu Glu Cys

450 455 460

Leu Arg Pro Gly Thr Val Thr Asp Glu Thr Phe Leu Glu Lys Leu Asn

465 470 475 480

Gln Val Cys Ala Thr His Gln His Phe Glu Ser Arg Met Ser Lys Cys

485 490 495

Ser Arg Phe Leu Asn Asp Thr Ser Leu Pro His Ser Cys Phe Arg Ile

500 505 510

Gln His Tyr Ala Gly Lys Val Leu Tyr Gln Val Glu Gly Phe Val Asp

515 520 525

Lys Asn Asn Asp Leu Leu Tyr Arg Asp Leu Ser Gln Ala Met Trp Lys

530 535 540

Ala Ser His Ala Leu Ile Lys Ser Leu Phe Pro Glu Gly Asn Pro Ala

545 550 555 560

Lys Ile Asn Leu Lys Arg Pro Pro Thr Ala Gly Ser Gln Phe Lys Ala

565 570 575

Ser Val Ala Thr Leu Met Lys Asn Leu Gln Thr Lys Asn Pro Asn Tyr

580 585 590

Ile Arg Cys Ile Lys Pro Asn Asp Lys Lys Ala Ala His Ile Phe Asn

595 600 605

Glu Ala Leu Val Cys His Gln Ile Arg Tyr Leu Gly Leu Leu Glu Asn

610 615 620

Val Arg Val Arg Arg Ala Gly Tyr Ala Phe Arg Gln Ala Tyr Glu Pro

625 630 635 640

Cys Leu Glu Arg Tyr Lys Met Leu Cys Lys Gln Thr Trp Pro His Trp

645 650 655

Lys Gly Pro Ala Arg Ser Gly Val Glu Val Leu Phe Asn Glu Leu Glu

660 665 670

Ile Pro Val Glu Glu Tyr Ser Phe Gly Arg Ser Lys Ile Phe Ile Arg

675 680 685

Asn Pro Arg Thr Leu Phe Lys Leu Glu Asp Leu Arg Lys Gln Arg Leu

690 695 700

Glu Asp Leu Ala Thr Leu Ile Gln Lys Ile Tyr Arg Gly Trp Lys Cys

705 710 715 720

Arg Thr His Phe Leu Leu Met Lys Lys Ser Gln Ile Val Ile Ala Ala

725 730 735

Trp Tyr Arg Arg Tyr Ala Gln Gln Lys Arg Tyr Gln Gln Thr Lys Ser

740 745 750

Ser Ala Leu Val Ile Gln Ser Tyr Ile Arg Gly Trp Lys Ala Arg Lys

755 760 765

Ile Leu Arg Glu Leu Lys His Gln Lys Arg Cys Lys Glu Ala Val Thr

770 775 780

Thr Ile Ala Ala Tyr Trp His Gly Thr Gln Ala Arg Arg Glu Leu Arg

785 790 795 800

Arg Leu Lys Glu Glu Ala Arg Asn Lys His Ala Ile Ala Val Ile Trp

805 810 815

Ala Tyr Trp Leu Gly Ser Lys Ala Arg Arg Glu Leu Lys Arg Leu Lys

820 825 830

Glu Glu Ala Arg Arg Lys His Ala Val Ala Val Ile Trp Ala Tyr Trp

835 840 845

Leu Gly Leu Lys Val Arg Arg Glu Tyr Arg Lys Phe Phe Arg Ala Asn

850 855 860

Ala Gly Lys Lys Ile Tyr Glu Phe Thr Leu Gln Arg Ile Val Gln Lys

865 870 875 880

Tyr Phe Leu Glu Met Lys Asn Lys Met Pro Ser Leu Ser Pro Ile Asp

885 890 895

Lys Asn Trp Pro Ser Arg Pro Tyr Leu Phe Leu Asp Ser Thr His Lys

900 905 910

Glu Leu Lys Arg Ile Phe His Leu Trp Arg Cys Lys Lys Tyr Arg Asp

915 920 925

Gln Phe Thr Asp Gln Gln Lys Leu Ile Tyr Glu Glu Lys Leu Glu Ala

930 935 940

Ser Glu Leu Phe Lys Asp Lys Lys Ala Leu Tyr Pro Ser Ser Val Gly

945 950 955 960

Gln Pro Phe Gln Gly Ala Tyr Leu Glu Ile Asn Lys Asn Pro Lys Tyr

965 970 975

Lys Lys Leu Lys Asp Ala Ile Glu Glu Lys Ile Ile Ile Ala Glu Val

980 985 990

Val Asn Lys Ile Asn Arg Ala Asn Gly Lys Ser Thr Ser Arg Ile Phe

995 1000 1005

Leu Leu Thr Asn Asn Asn Leu Leu Leu Ala Asp Gln Lys Ser Gly

1010 1015 1020

Gln Ile Lys Ser Glu Val Pro Leu Val Asp Val Thr Lys Val Ser

1025 1030 1035

Met Ser Ser Gln Asn Asp Gly Phe Phe Ala Val His Leu Lys Glu

1040 1045 1050

Gly Ser Glu Ala Ala Ser Lys Gly Asp Phe Leu Phe Ser Ser Asp

1055 1060 1065

His Leu Ile Glu Met Ala Thr Lys Leu Tyr Arg Thr Thr Leu Ser

1070 1075 1080

Gln Thr Lys Gln Lys Leu Asn Ile Glu Ile Ser Asp Glu Phe Leu

1085 1090 1095

Val Gln Phe Arg Gln Asp Lys Val Cys Val Lys Phe Ile Gln Gly

1100 1105 1110

Asn Gln Lys Asn Gly Ser Val Pro Thr Cys Lys Arg Lys Asn Asn

1115 1120 1125

Arg Leu Leu Glu Val Ala Val Pro

1130 1135

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggtctggtgt ggaggtccta tt 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgttgcttcc tcaggtcttc tt 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cagcctcaag atcatcagca tt 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgtggtcatg agtccttcca tt 22

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 7

gcuuaccugg aaaucaacaa g 21

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 8

cuuguugauu uccagguaag c 21

Claims (3)

1.抑制Myosin1b蛋白表达的制剂在制备治疗宫颈癌药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：抑制Myosin1b蛋白表达的制剂包括Myosin1b基因启动子抑制剂、Myosin1b增强子抑制剂、Myosin1b基因的siRNA。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：抑制Myosin1b蛋白表达的制剂为Myosin1b蛋白抗体。

Images