CN104845970A - 与乳头状甲状腺瘤相关的基因 - Google Patents

Abstract

本发明涉及与乳头状甲状腺癌有关的基因及其应用，根据该基因的碱基序列，设计并合成实时定量PCR引物，在乳头状甲状腺癌临床病例标本中检测该基因所转录的长链非编码RNA的表达水平，发现所述长链非编码RNA在乳头状甲状腺肿瘤组织中的表达显著下调，基因沉默所述长链非编码RNA可以显著促进甲状腺癌细胞生长。本发明有望制备用于乳头状甲状腺癌辅助诊断、基因治疗、疗效预测或预后判断的制剂。

Description

与乳头状甲状腺瘤相关的基因

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体地说，涉及与乳头状甲状腺瘤相关的基因及其PCR检测方法。

背景技术

甲状腺癌是最常见的内分泌肿瘤，近年来发病率增长迅速，已成为最常见的恶性肿瘤之一，也是近年来发病率增长最快的一种实体肿瘤。其中，90％是乳头状甲状腺癌(papillary thyroid cancer,PTC)。虽然乳头状甲状腺癌的死亡率和其他恶性肿瘤相比死亡率比较低，但是乳头状甲状腺癌转移率很高，淋巴结转移率高达30％-50％，如果乳头状甲状腺癌转移和复发，病人没能及时诊断，结果丧失最佳手术时机，死亡率则显著升高，是预后不良的重要指标。

流行病学证据表明，在中国很多地区，女性中乳头状甲状腺癌的发病率已超过乳腺癌，位居第一位。乳头状甲状腺癌的发生是一个多基因、多步骤的病变过程，包括遗传学等一系列改变。病因学研究揭示，该恶性肿瘤为遗传因素贡献最大的一种恶性肿瘤。越来越多的证据表明，体细胞的基因突变造成的癌基因激活与抑癌基因失活在肿瘤的发生发展过程中扮演着至关重要的作用，因此，对于乳头状甲状腺癌体细胞突变筛查有助于发掘其发病的驱动基因。

对甲状腺癌的诊断目前主要依靠甲状腺超声以及穿刺活检病理，虽然穿刺活检病理诊断甲状腺癌已经广泛应用于临床，但仍存在30％可疑或不确定是否为甲状腺癌的诊断结果，并且穿刺是一项有创检查，给患者带来较大痛苦。甲状腺癌一般以手术治疗，早期发现进行治疗的患者 五年生存率能达95％，晚期发现的患者五年生存率降至59％，因此为提高甲状腺癌诊断的准确性和早期诊断率，有必要寻找一种创伤性小，灵敏度和特异度均较高的新的诊断方法。

由于肿瘤遗传的复杂性，传统的体细胞突变筛查方法无法对肿瘤有一个整体的认识。而作为一种高效和高灵敏度的技术，全基因外显子组测序能发现外显子区的绝大部分的疾病相关变异，可检测常见变异和频率<5％的低频突变，通过对外显子区域的基因突变进行测定，一方面有助于确定乳头状甲状腺癌相关癌基因及抑癌基因，为其早期分子诊断提供依据；另一方面有助于更好地定性肿瘤，揭示相似组织病理类型和不同临床特征的亚临床分类，帮助确定不同亚型乳头状甲状腺癌的治疗敏感性和判断预后；更为关键的是，外显子组测序技术有助于寻找乳头状甲状腺癌基因突变相关的最佳药物靶点，从而改变相应分子调控网络和相关代谢途径，使乳头状甲状腺癌个体化治疗成为可能。

本发明中所引述的文献、著作、专利和专利申请公开书，其中全部或局部都明确地和独立地都在本专利申请书引用参考。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基因，该基因命名为GAS8-AS1，其序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

本发明的另一目的在于提供的GAS8-AS1基因在制备筛选、检测或辅助诊断乳头状甲状腺癌的试剂的用途。

本发明的另一目的在于提供与GAS8-AS1基因在严格条件下杂交的核酸分子，用于制备检测GAS8-AS1基因的试剂。

在本发明的一个优选实施方案中，所述核酸分子的序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示。

本发明的另一目的在于提供一种检测试剂盒，所述试剂盒包括与GAS8-AS1基因在严格条件下杂交的核酸分子，可用于检测GAS8-AS1基因。

在本发明的一个优选实施方案中，所述试剂盒为实时定量PCR检测 试剂盒。

在本发明的另一个优选实施方案中，所述试剂盒中包括的核酸分子的序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示。

附图说明

参考随附的附图，本发明更多的目的、功能和优点将通过本发明实施方式的如下描述得以阐明，其中：

图1为lncRNA GAS8-AS1基因及相关基因突变示意图；

图2为RNAfold软件预测lncRNA GAS8-AS1的RNA二级结构图；

图3为浙江队列和淮安队列中检测乳头状甲状腺癌组织及癌旁正常组织中，lncRNA GAS8-AS1的表达水平示意图；

图4为转染携带lncRNA GAS8-AS1基因质粒后，乳头状甲状腺癌细胞系GLAG66、NPA和TPC-1的增殖情况示意图；

图5为实时定量PCR检测转染携带lncRNA GAS8-AS1基因质粒后乳头状甲状腺癌细胞系GLAG66、NPA和TPC-1中lncRNA GAS8-AS1的表达水平情况示意图；

图6为转染针对lncRNA GAS8-AS1的siRNAs后，乳头状甲状腺癌细胞系GLAG66和TPC-1的增殖情况示意图；

图7为实时定量PCR检测转染针对lncRNA GAS8-AS1的siRNAs后乳头状甲状腺癌细胞系GLAG66和TPC-1中lncRNA GAS8-AS1的表达水平情况示意图。

具体实施方式

通过以下的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细解释及展述，使本领域的普通技术人员能够更加容易地理解本发明，但不应该将此理解为本发明所述主题的范围仅限于以下的实例及限制本发明的任何或所有权利，更不应该背离本发明的精神。

本发明的目的在于提供一种基因，该基因命名为GAS8-AS1，其序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

GAS8-AS1基因(NCBI-GeneID:750)，又名C16orf3基因(16号染色体开放阅读框3)，位于人类16号染色体GAS8基因2号内含子中。GAS8-AS1基因不含任何内含子序列，与GAS8基因相反的方向转录产生一条长链非编码RNA(lncRNA)，该RNA不能翻译成蛋白质。目前，对于该基因及其转录产物的生物学功能仍不清楚。

GAS8-AS1的基因序列(NCBI Reference Sequence:NR_122031.1)如下：

1acctgcagtc ccagctactg ggcagcctga agcagcagga tggtgtgaac ccaggaggtg 

61gagcttgcag tgagccgagg tcgcgccacc gcactccagc ctgggccaca cagcgagatt 

121ccgtcagaat cagttacttt tcgggcacag ccccaggcca cttactgtga gcctttttct 

181ttctcaacac cacattcccc acagggaaaa cacatttctc acctcaaaag aagacaagac 

241aacgagcaaa caagaaggag cagcaggagg ggttctgagc cgaggatgcc gggcagacat 

301gagggagaca cgcacccccg aatccaacca gtgcctcggc acaacgacaa atgtcttcac 

361gtcacagacc tttagaggct cctgggcaga gcctgaacca gggctcctga ctggtctgtt 

421tggctcacat ggtgttgaga ttttgccatc actcaatatt cagatttctt ataaatatcc 

481agatttccag cttctcttgg aaaatcagaa aaaaacagca ctgaactcct aggcccacaa 

541ggcactcccc agtgaacaga tgaaactgtc ctctgctgcg gggcaggagt ctccaggtca 

601cccccatccc tccccacctg cctggaccct gaagaagcct tctgagtctg tggctcaacg 

661tgcgatgtgc agtgcaaggg cctgccccgt agcctgcccc gtaggctgcc ccatagcctg 

721ccccgtaagc tgccccgtag cctgccccgt aggctgcccc gtaggctcca tggccactgc 

781cccacaaggc ctgtctccac aggaatggga agcggacagg gagacgggca gcagctcaca 

841tgctgggaca acgcagtgtt caatccattc tccatccagc agctccagac atctttccag 

901aacacaaacc tgaccccatc acctctctgc ttagccactg gcttaaactg ccaatggttt 

961gcctgcatgt aaaataaagc cattctttac cattaaaaaa 

(SEQ ID No.1)

长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类转录本长度超过200个核苷酸的非编码RNA，近年研究发现它是一类具有重要生物学功能的RNA，参与基因组印记、染色体沉默、染色质修饰、转录激 活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程，在细胞分化和发育、基因转录和翻译、遗传和表观遗传等生命活动中均发挥重要的调控作用。

本发明的另一目的在于所提供的GAS8-AS1基因在制备筛选、检测或辅助诊断乳头状甲状腺癌的试剂的用途。

本发明的另一目的在于提供与GAS8-AS1基因在严格条件下杂交的核酸分子，用于制备检测GAS8-AS1基因的试剂。所述核酸分子的序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示。

本发明的另一目的在于提供一种检测试剂盒，所述试剂盒包括与GAS8-AS1基因在严格条件下杂交的核酸分子，可用于检测GAS8-AS1基因。显然，本领域技术人员在获知本发明公开的如SEQ ID NO：1所示的基因序列和如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的引物序列之后，在本发明基础上不需付出创造性劳动就可以制备其他用于检测GAS8-AS1基因的引物和试剂盒，所述试剂盒的检测方法包括但不限于实时定量PCR方法。所述试剂盒中可以包括如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的核酸分子或其他可以与GAS8-AS1基因在严格条件下杂交的分子。任选的，所述试剂盒中还可以包括实施常规基因检测所需的辅助试剂。

实施例1：突变测序方法

1.1采集受检者肿瘤组织样本

1.2基因组DNA抽提

准备高压灭菌后的研钵，晾干后倒入液氮预冷；取适量组织于研钵中研碎，期间补充液氮，研磨成粉末状后解冻；用800μl PBS溶液收集研钵中的组织放入离心管中(1.5ml)；12000rpm离心1min，取出弃上清。然后加200μl缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。

加入20μl蛋白酶K(20mg/ml)，充分混匀后，于56℃保温2h，每20min摇1次，至组织溶解。

加入200μl GB缓冲液颠倒混匀，于70℃保温10min，至溶液变清亮。

加入200μl无水乙醇，充分振荡15sec，此时应出现絮状沉淀。

将上述溶液及絮状沉定转移至CB3吸附柱中，然后12000rpm离心30sec，弃收集管中液体。

向CB3吸附柱中加入500μl GD，12000rpm离心30sec，弃收集管中液体。

向CB3吸附柱中加入600μl PW(使用前检查是否已加入乙醇)，12000rpm离心30sec，弃收集管中液体。重复此步骤2次。

12000r/m,离心2min，弃废液，然后放置数分钟，晾干残留的漂洗液。

更换收集管，向CB3吸附柱内加入50μl-200μl TE溶解DNA，室温放置5min，12000rpm离心2min，收集得到DNA-20℃保存备用。

1.3模板制备

采用的是固相PCR(Illumina的Hiseq)法，即把这个扩增过程放在了玻璃载片上。高密度的正向和反向引物共价连接在这些玻璃载片上，模板和引物的比例决定了扩纳簇的密度。固相PCR能够生成一到两亿空间上隔离的模板簇，并提供自由末端给通用的测序引物，用以起始测序反应。

1.4外显子组捕获 

利用Agilent公司的50Mb SureSelectXT Human All Exon V5kit针对人外显子液相靶向序列富集系统进行高覆盖率的外显子区域捕获。All Exon 50Mb试剂盒是Agilent与Wellcome Trust Sanger Institute、Gencode consortium合作开发的人全外显子捕获试剂盒。外显子的捕获量可达50Mb。捕获对象：①、GENCODE project中发现的外显子(约12M)；②、NCBI Consensus CDS database(CCDS,March 2009)中的外显子；③、Sanger V13database中的miRNA；④、多于300条的human non-coding RNAs(例如snoRNAs和scaRNAs)。

1.5靶向测序及生物信息学分析

Illumina的Hiseq 2000测序的基本原理是边合成边测序，又称循环可逆终止。向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特 异荧光标记的四种dNTP。由于这些dNTP的3’羟基被化学方法保护，因而每轮合成反应都只能添加一个dNTP。在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱。加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号，用光学设备完成荧光信号的记录，再通过计算机分析转化为测序结果。当荧光信号的记录完成后，加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP的3’羟基保护基团，恢复3’端粘性，继续聚合第二个核苷酸。如此继续下去，直到每条模板序列都完全被聚合为双链。这样，统计每轮收集到的荧光信号结果，就可以得知每个模板DNA片段的序列。这种测序方法的优势是减少了样品分离和制备的时间，配对末端读长可达到2×50bp，每次运行后可获得超过20GB的高质量过滤数据，且运行成本较低，是性价比较高的新一代测序技术。

针对乳头状甲状腺癌进行靶向测序，通过构建高斯混合模型的方法，将得到的短片段序列与参考序列比对(mapping)，寻找突变(variant calling)，以及对突变的过滤筛选。

实施例2：GAS8-AS1等基因可作为乳头状甲状腺癌的筛选或检测的靶标。

2.1实验方法

本发明利用如实施例1所述的全基因组外显子技术对91对乳头状甲状腺癌患者的配对组织(甲状腺癌组织和外周血样本)进行靶向测序，获取基因突变情况。最终确定了GAS8-AS1等基因为中国汉族人群乳头状甲状腺癌易感基因。乳头状甲状腺癌患者的配对组织指的是患者的甲状腺癌组织和外周血样本，所述91对甲状腺癌患者的组织样本委托中国医学科学院肿瘤医院和浙江省肿瘤医院采集。

2.2实验结果

2.21基因突变频次统计

对91对乳头状甲状腺癌配对组织进行二代测序，高频突变基因见表1。

2.22乳头状甲状腺癌易感基因

针对高频突变基因经MutsigCV软件分析，最终确定GAS8-AS1为 中国汉族人群乳头状甲状腺癌易感基因。见表1。

表1.中国汉族人群乳头状甲状腺癌易感基因

注释:

1：该基因中的非沉默突变数；

2：该基因中的沉默突变数；

3：该基因中的非编码区突变数；

4：经MutSigCV软件计算所得；

5：多重检验校正结果。

实施例3：GAS8-AS1基因检测可作为乳头状甲状腺癌的筛选或检测的靶标。

GAS8-AS1基因(NCBI-GeneID:750)，又名C16orf3基因(16号染色体开放阅读框3)，位于人类16号染色体GAS8基因2号内含子中。GAS8-AS1基因不含任何内含子序列，与GAS8基因相反的方向转录产生一条长链非编码RNA(lncRNA)，该RNA不能翻译成蛋白质。目前，对于该基因及其转录产物的生物学功能仍不清楚。

GAS8-AS1的基因序列(NCBI Reference Sequence:NR_122031.1)如下：

1acctgcagtc ccagctactg ggcagcctga agcagcagga tggtgtgaac ccaggaggtg 

61gagcttgcag tgagccgagg tcgcgccacc gcactccagc ctgggccaca cagcgagatt 

121ccgtcagaat cagttacttt tcgggcacag ccccaggcca cttactgtga gcctttttct 

181ttctcaacac cacattcccc acagggaaaa cacatttctc acctcaaaag aagacaagac 

241aacgagcaaa caagaaggag cagcaggagg ggttctgagc cgaggatgcc gggcagacat 

301gagggagaca cgcacccccg aatccaacca gtgcctcggc acaacgacaa atgtcttcac 

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661tgcgatgtgc agtgcaaggg cctgccccgt agcctgcccc gtaggctgcc ccatagcctg 

721ccccgtaagc tgccccgtag cctgccccgt aggctgcccc gtaggctcca tggccactgc 

781cccacaaggc ctgtctccac aggaatggga agcggacagg gagacgggca gcagctcaca 

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(SEQ ID No.1)

长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类转录本长度超过200个核苷酸的非编码RNA，近年研究发现它是一类具有重要生物学功能的RNA，参与基因组印记、染色体沉默、染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程，在细胞分化和发育、基因转录和翻译、遗传和表观遗传等生命活动中均发挥重要的调控作用。近年来，越来越多的权威研究证实lncRNA在肿瘤的发生发展中起着抑制或促进肿瘤的作用，在调控肿瘤细胞增殖、凋亡、细胞周期、侵袭转移能力等方面，均具有十分重要作用。

3.1实验方法

3.1.1本发明利用如实施例1所述的全基因组外显子技术对91对乳头状甲状腺癌配对组织进行靶向测序。

3.1.2利用实时定量PCR的方法，对委托浙江省肿瘤医院和淮安市第二人民医院采集的87对乳头状甲状腺癌患者的甲状腺癌组织及癌旁正常组织中的RNA样本进行基因表达情况的检测(在本发明中分别称为浙江队列和淮安队列)。实时定量PCR检测试剂盒包括根据GAS8-AS1基因的序列设计的实时定量PCR所用引物：GAS8-AS1-F和GAS8-AS1-R，其序列SEQ ID No.2和SEQ ID No.3如下表所示：

3.1.3利用体外培养乳头状甲状腺癌细胞系GLAG66、NPA和TPC-1，分别向上述细胞中转染携带lncRNA GAS8-AS1基因的质粒或针对lncRNA GAS8-AS1的siRNAs，转染后24小时及48小时进行细胞计数，观察lncRNA GAS8-AS1基因对乳头状甲状腺癌细胞增殖的影响。

3.2实验结果

3.2.1如表1所示，全基因组外显子技术对91对乳头状甲状腺癌配对组织进行靶向测序，确定8例患者携带GAS8-AS1基因突变，突变率为8.8％，因此确定GAS8-AS1基因为中国汉族人群乳头状甲状腺癌易感基因。图1为lncRNA GAS8-AS1基因及相关基因突变示意图。RNAfold软件预测lncRNA GAS8-AS1的RNA二级结构如图2所示。

3.2.2图3为对来自浙江队列和淮安队列的乳头状甲状腺患者检测其乳头状甲状腺癌组织及癌旁正常组织中，lncRNA GAS8-AS1的表达水平示意图。如图所示，利用实时定量PCR法检测浙江队列和淮安队列中的87对乳头状甲状腺癌组织及正常组织中的GAS8-AS1基因表达后，发现其表达在肿瘤组织中显著下调，提示其为甲状腺癌的全新抑癌基因。

3.2.3图4为转染携带lncRNA GAS8-AS1基因质粒后，乳头状甲状腺癌细胞系GLAG66、NPA和TPC-1的增殖情况示意图。如图4所示，转染携带lncRNA GAS8-AS1基因质粒后，GLAG66、NPA和TPC-1的增殖情况明显低于未转染携带lncRNA GAS8-AS1基因质粒的载体。因此，lncRNA GAS8-AS1可以显著抑制GLAG66、NPA和TPC-1的增殖。

图5为利用实时定量PCR法检测转染携带lncRNA GAS8-AS1基因质粒后乳头状甲状腺癌细胞系GLAG66、NPA和TPC-1中lncRNA GAS8-AS1的表达水平情况，由图可知，未转染携带lncRNA GAS8-AS1基因质粒的载体，GLAG66、NPA和TPC-1中lncRNA GAS8-AS1的表 达水平很低，基本在1.0左右；转染携带lncRNA GAS8-AS1基因质粒的载体，GLAG66、NPA和TPC-1中lncRNA GAS8-AS1的表达水平分别在49、41、55左右，显著高于未转染携带lncRNA GAS8-AS1基因质粒的载体。

转染针对lncRNA GAS8-AS1的GAS8-AS1-siR-1和GAS8-AS1-siR-2后，会显著增加乳头状甲状腺癌细胞系GLAG66和TPC-1的增殖，如图6所示，表明基因沉默lncRNA GAS8-AS1可以显著增加上述细胞的增殖。利用实时定量PCR检测得知转染针对lncRNA GAS8-AS1的GAS8-AS1-siR-1和GAS8-AS1-siR-2后乳头状甲状腺癌细胞系GLAG66和TPC-1中lncRNA GAS8-AS1的表达水平均低于0.6，而未转染GAS8-AS1-siR-1和GAS8-AS1-siR-2的表达水平为1.0，如图7所示。

综上，在体外培养乳头状甲状腺癌细胞中，过表达GAS8-AS1基因可以显著抑制甲状腺癌细胞生长。反之，基因沉默GAS8-AS1基因可以显著促进甲状腺癌细胞生长。

随着后期研究结果的深入，GAS8-AS1在PTC中的功能及其作用机制将逐步阐明，这一新颖的长链非编码RNA不仅能成为诊断相关的生物标志物，更有望成为新的PTC治疗靶点以改善、提高临床PTC治疗效果，具有十分重要的现实意义。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种基因，所述基因的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的基因用于制备筛选、检测或辅助诊断乳头状甲状腺癌的试剂的用途。

3.与权利要求1所述的基因在严格条件下杂交的核酸分子，用于制备检测如权利要求1所述基因的试剂。

4.根据权利要求3所述的核酸分子，其序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示。

5.一种检测试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求3所述的核酸分子，用于检测如权利要求1所述的基因。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，所述试剂盒为实时定量PCR检测试剂盒。

7.根据权利要求5所述的试剂盒，其中所述核酸分子的序列如SEQID NO：2或SEQ ID NO：3所示。