CN111239286B - 一种检测替诺呋韦中基因毒性杂质的方法 - Google Patents

一种检测替诺呋韦中基因毒性杂质的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种检测替诺呋韦(PMPA)中基因毒性杂质的方法。本发明通过高效液相色谱法在合适的条件下检测替诺呋韦(PMPA)中四种基因毒性杂质SM‑A3、4‑甲基苯磺酸乙酯、SM‑A4和(乙氧基(羟基)磷酰基)甲基‑4‑甲苯磺酸酯。本发明使用上述技术方案可以大大提高检测方法的灵敏度，设备仪器均为通用的，检测成本低廉，操作极为简便，大大节约了检测成本和检测时间。

Description

一种检测替诺呋韦中基因毒性杂质的方法
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种检测替诺呋韦(PMPA)中基因毒性杂质的方法。
背景技术
丙酚替诺呋韦(Tenofovir alafenamide fumarate，化合物II)和富马酸替诺福韦二吡呋酯(Tenofovir disoproxil fumarate，化合物III)都是治疗乙肝的一线药物，其关键中间体均为替诺呋韦(PMPA)
专利WO2013052094(A1)揭示了由PMPA制备丙酚替诺呋韦的过程。
Figure BDA0002390087220000011
文献“富马酸替诺福韦二吡呋酯的合成工艺”(张奇等，沈阳药科大学学报，2018年07期，P543-547)报道了由PMPA制备富马酸替诺福韦二吡呋酯的过程。
Figure BDA0002390087220000012
目前比较主要的PMPA合成路线，如文献“富马酸替诺福韦二吡呋酯的合成工艺”(张奇等，沈阳药科大学学报，2018年07期，P543-547)中所揭示的。
Figure BDA0002390087220000021
以SM-A0((R)-4-甲基-1,3-二氧戊环-2-酮)和SM-A1(6-氨基嘌呤)为起始原料，对接生成SM-A2((R)-9-(2-羟基丙基)腺嘌呤)；SM-A2和SM-A3((二乙氧膦酰)甲基4-甲基苯磺酸)反应生成SM-A4((R)-二乙基(((1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙基-2-基)氧)甲基)磷酸酯)；再进行水解反应生成PMPA(化合物I)。
基因毒性杂质(genotoxic impurity,GTI)是指能直接或间接损害DNA，导致基因突变或具有致癌倾向的物质，基因毒性杂质在浓度很低时即可造成人体遗传物质的损伤，具有致突变性和致癌性，在用药过程中严重威胁到人类的健康。
ICH Q11指出，在确定哪些生产步骤会影响原料药杂质谱时，应首先识别出可能在生产工艺中生成或引入的致突变物质，同时确定哪些步骤产生的致突变杂质达到了影响原料药杂质谱的水平。然后结合ICH M7中的危害评估要素从3个方面来确定已知杂质或潜在杂质的致突变性:①原料药中已经确定的杂质的致突变性。②可能影响原料药杂质谱的从市售化学品到原料药的合成过程中所用的试剂、中间体的致突变性，以及起始原料之前步骤中的一些试剂、中间体的致突变性。③致突变物质如果是市售化学品、合成中间体中的杂质，或者是合成副产物，申请人应使用基于风险的推理来确定在哪些步骤应该对此类潜在杂质进行危害性评估，如果确认了合成过程中需要对这些杂质和副产物进行致突变性评估的步骤，则需要进行风险评估讨论。
由此可见，对起始原料中引入的基因毒性杂质进行风险评估，并采取必要的控制策略是药物质量控制的关键一环。又由于基因毒性杂质的含量多为ppm级，对其进行分析检测要求极高的灵敏度，因而开发相应的杂质检测技术势在必行。
发明内容
本发明针对目前的技术空白，提供了一种替诺呋韦(PMPA)中基因毒性杂质含量的检测方法。
所述替诺呋韦(PMPA)中基因毒性杂质包括SM-A3、SM-A4、(乙氧基(羟基)磷酰基)甲基-4-甲苯磺酸酯和4-甲基苯磺酸乙酯，具体结构式如下所示：
Figure BDA0002390087220000031
本发明所提供的替诺呋韦的基因毒性杂质的检测方法，包括以如下分析方法1检测SM-A3、SM-A4、4-甲基苯磺酸乙酯3个杂质的操作，和以如下分析方法2检测(乙氧基(羟基)磷酰基)甲基-4-甲苯磺酸酯的操作，
其中，所述分析方法1为：以SM-A3、4-甲基苯磺酸乙酯和SM-A4作为对照品，采用高效液相色谱法检测替诺呋韦中是否含有SM-A3、4-甲基苯磺酸乙酯和SM-A4以及按外标法以峰面积计算各杂质的含量；
所述分析方法1中，使用具有紫外检测器的高效液相色谱仪进行高效液相色谱法检测；其中，检测波长为225nm；
所述高效液相色谱法中，采用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，具体可为MREDA 4.6×250mm，5μm型色谱柱；
以三氟乙酸水溶液-乙腈(50:50，体积比)为流动相，其中，三氟乙酸水溶液的质量浓度具体可为0.05％；流速为1.0±0.1ml/min，具体为1.0ml/min；柱温为35±5℃，具体可为35℃；
所述分析方法1的具体操作如下：
取替诺呋韦(PMPA)，加稀释剂，超声溶解，加水定量稀释成每1ml中含2mg替诺呋韦的溶液，作为供试品溶液；
称取SM-A3、4-甲基苯磺酸乙酯和SM-A4对照品，用稀释剂溶解并定量稀释制成每1ml中均含0.12μg的溶液，作为对照品溶液；
量取上述供试品溶液和上述对照品溶液各20μl分别注入液相色谱仪，记录色谱图；
得到的供试品溶液色谱图中如有与SM-A3、4-甲基苯磺酸乙酯和/或SM-A4保留时间一致的色谱峰，则按外标法以峰面积分别计算SM-A3、4-甲基苯磺酸乙酯和/或SM-A4的含量；如没有与SM-A3、4-甲基苯磺酸乙酯和SM-A4保留时间一致的色谱峰，则判断替诺呋韦样品中不含SM-A3、4-甲基苯磺酸乙酯和/或SM-A4。
上述色谱检测条件下，替诺呋韦(PMPA)的保留时间为2.166min；
SM-A3的保留时间为7.580min；
4-甲基苯磺酸乙酯的保留时间为9.647min；
SM-A4的保留时间为14.055；
由此可见，在上述色谱检测条件下，替诺呋韦、SM-A3、4-甲基苯磺酸乙酯和SM-A4能够完全分离；
按外标法计算，所述SM-A3、SM-A4、4-甲基苯磺酸乙酯均不得超过60ppm。
所述分析方法2为：以(乙氧基(羟基)磷酰基)甲基-4-甲苯磺酸酯作为对照品，采用高效液相色谱法检测替诺呋韦中是否含有(乙氧基(羟基)磷酰基)甲基-4-甲苯磺酸酯以及按外标法以峰面积计算(乙氧基(羟基)磷酰基)甲基-4-甲苯磺酸酯杂质的含量；
所述分析方法2中，使用具有紫外检测器的高效液相色谱仪进行高效液相色谱法检测；其中，检测波长为200nm；
所述高效液相色谱法中，采用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，具体可为Agela 4.6×150mm，5μm型色谱柱；
以磷酸缓冲盐水溶液-乙腈(85:15体积比)为流动相，其中，磷酸缓冲盐水溶液优选为质量浓度为0.05mol/L的磷酸二氢钾水溶液，以磷酸调节pH值至3.0；流速为1.0±0.1ml/min，具体为1.0ml/min；柱温为35±5℃，具体可为35℃；
所述分析方法2的具体操作如下：
取替诺呋韦(PMPA)，加稀释剂超声溶解，加水定量稀释制成每1ml中含1mg的溶液，作为供试品溶液；
称取(乙氧基(羟基)磷酰基)甲基-4-甲苯磺酸酯对照品；用稀释剂溶解并定量稀释制成每1ml中含0.06μg的溶液，作为对照品溶液；
精密量取供试品溶液和对照品溶液各20μl分别注入液相色谱仪，记录色谱图；
得到的供试品溶液色谱图中如有与(乙氧基(羟基)磷酰基)甲基-4-甲苯磺酸酯对照品保留时间一致的色谱峰，则按外标法以峰面积计算替诺呋韦中(乙氧基(羟基)磷酰基)甲基-4-甲苯磺酸酯杂质的含量；如没有与(乙氧基(羟基)磷酰基)甲基-4-甲苯磺酸酯对照品保留时间一致的色谱峰，则判断替诺呋韦样品中不含(乙氧基(羟基)磷酰基)甲基-4-甲苯磺酸酯杂质。
上述色谱检测条件下，替诺呋韦(PMPA)的保留时间为1.490min；
(乙氧基(羟基)磷酰基)甲基-4-甲苯磺酸酯的保留时间为13.226min；
按外标法计算，所述(乙氧基(羟基)磷酰基)甲基-4-甲苯磺酸酯杂质的含量不得超过60ppm。
本发明使用上述技术方案(合适的色谱柱，色谱条件，洗脱剂等)可以大大提高检测方法的灵敏度，设备仪器均为通用的，检测成本低廉，操作极为简便，大大节约了检测成本和检测时间。
附图说明
图1为替诺呋韦PMPA中基因毒性杂质分析方法1的系统适用性图谱。
图2为替诺呋韦PMPA中基因毒性杂质分析方法2的系统适用性图谱。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、分析方法1
MREDA 4.6×250mm，5μm色谱柱
检测波长为225nm
流速为1.0ml/min
柱温为35℃
取替诺呋韦(PMPA)适量，先加稀释剂[甲醇-水(30:70，体积比)]约4ml超声溶解，再加水定量稀释制成每1ml中约含2mg的溶液，作为供试品溶液。另精密称SM-A3、4-甲基苯磺酸乙酯和SM-A4(母液配制加二氯甲烷溶解后用异丙醇定溶)对照品适量，用稀释剂溶解并定量稀释制成每1ml中均约含0.12μg的溶液，作为对照品溶液。照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部通则0512)试验。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(MREDA 4.6×250mm，5μm)；以质量浓度0.05％三氟乙酸-乙腈(50:50，体积比)为流动相；流速为每分钟1.0ml；检测波长为225nm；柱温35℃。精密量取供试品溶液和对照品溶液各20μl分别注入液相色谱仪，记录色谱图，图1为替诺呋韦PMPA中基因毒性杂质分析方法1的系统适用性图谱，由图1可知，在该色谱条件下，替诺呋韦PMPA、SM-A3、4-甲基苯磺酸乙酯、SM-A4能够完全分离。供试品溶液色谱图中如有与SM-A3、4-甲基苯磺酸乙酯和/或SM-A4保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积分别计算SM-A3、4-甲基苯磺酸乙酯和/或SM-A4杂质的含量。
专属性实验表明，空白溶剂对对照品溶液无干扰，不会对本品检测有影响。
检出限、定量限结果表明，各杂质检出灵敏度均符合要求，定量限重复性良好。
线性实验结果表明，SM-A3、4-甲基苯磺酸乙酯和SM-A4在相应浓度范围内，浓度与峰面积均呈良好的线性关系。
准确度实验结果表明，各杂质9份样品回收率均在85％～110％，RSD值为小于10.0％，表明该方法可准确测得各杂质的含量。
重复性实验表明，采用加样回收平行配制的六份样品中，SM-A3、4-甲基苯磺酸乙酯和SM-A4杂质含量的RSD值分别为4.10％、6.13％、4.64％，重复性试验结果表明本方法重复性良好。
经试验，12份供试品中SM-A3、4-甲基苯磺酸乙酯和SM-A4杂质含量RSD分别为6.60％、8.42％、13.68％，，均在20％之内，表明本方法中间精密度良好。
检测限结果
样品 浓度(μg/ml) 相当于主成分(％)
SM-A3 0.0215 0.00108
SM-A4 0.00581 0.00029
4-甲基苯磺酸乙酯 0.0224 0.00112
定量限结果
样品 浓度(μg/ml) 相当于主成分(％)
SM-A3 0.0431 0.00216
SM-A4 0.0194 0.00097
4-甲基苯磺酸乙酯 0.0449 0.00225
线性结果
样品 浓度范围(μg/ml) 线性方程 r
SM-A3 0.058～2.90 y＝45125x+1053 0.9997
SM-A4 0.027～2.692 y＝194891x-11970 0.9990
4-甲基苯磺酸乙酯 0.057～2.868 y＝54446x-1186 0.9999
SM-A3回收率结果-
Figure BDA0002390087220000061
SM-A4回收率结果-
Figure BDA0002390087220000062
Figure BDA0002390087220000071
4-甲基苯磺酸乙酯回收率结果-
Figure BDA0002390087220000072
重复性试验结果
Figure BDA0002390087220000073
中间精密度考察结果
Figure BDA0002390087220000074
Figure BDA0002390087220000081
分析方法2
Agela 4.6×150mm，5μm色谱柱
检测波长为200nm
流速为1.0ml/min
柱温为35℃
取替诺呋韦(PMPA)适量，先加稀释剂[甲醇-水(30:70体积比)]约4ml超声溶解，再加水定量稀释制成每1ml中约含1mg的溶液，作为供试品溶液。另精密称取(乙氧基(羟基)磷酰基)甲基-4-甲苯磺酸酯对照品适量，用稀释剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.06μg的溶液，作为对照品溶液。
照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部通则0512)试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agela 4.6×150mm，5μm)；以0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH值至3.0)-乙腈(85:15，体积比)为流动相；流速为每分钟1.0ml；检测波长为200nm；柱温35℃。精密量取供试品溶液和对照品溶液各20μl分别注入液相色谱仪，记录色谱图。图2为替诺呋韦PMPA中基因毒性杂质分析方法2的系统适用性图谱，由图2可知，在该色谱条件下，替诺呋韦PMPA与(乙氧基(羟基)磷酰基)甲基-4-甲苯磺酸酯杂质能够完全分离。供试品溶液色谱图中如有与(乙氧基(羟基)磷酰基)甲基-4-甲苯磺酸酯保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算(乙氧基(羟基)磷酰基)甲基-4-甲苯磺酸酯杂质的含量。
专属性实验表明，空白溶剂对对照品溶液无干扰，不会对本品检测有影响。
检出限、定量限结果表明，(乙氧基(羟基)磷酰基)甲基-4-甲苯磺酸酯检出灵敏度均高。
线性实验结果表明，(乙氧基(羟基)磷酰基)甲基-4-甲苯磺酸酯在相应浓度范围内，浓度与峰面积均呈良好的线性关系。
准确度实验结果表明，(乙氧基(羟基)磷酰基)甲基-4-甲苯磺酸酯9份样品回收率均在85％～110％，RSD值为小于10.0％，表明该方法可准确测得各杂质的含量。
重复性实验表明，采用加样回收平行配制的六份样品中，(乙氧基(羟基)磷酰基)甲基-4-甲苯磺酸酯杂质含量的RSD值为18.30％，重复性试验结果表明本方法重复性良好。
经试验，12份供试品中(乙氧基(羟基)磷酰基)甲基-4-甲苯磺酸酯杂质含量RSD为14.61％，在20％之内，表明本方法中间精密度良好。
(乙氧基(羟基)磷酰基)甲基-4-甲苯磺酸酯检测限结果
Figure BDA0002390087220000082
Figure BDA0002390087220000091
(乙氧基(羟基)磷酰基)甲基-4-甲苯磺酸酯定量限结果
Figure BDA0002390087220000092
(乙氧基(羟基)磷酰基)甲基-4-甲苯磺酸酯线性结果
Figure BDA0002390087220000093
(乙氧基(羟基)磷酰基)甲基-4-甲苯磺酸酯回收率结果-
Figure BDA0002390087220000094
(乙氧基(羟基)磷酰基)甲基-4-甲苯磺酸酯重复性结果
Figure BDA0002390087220000095
(乙氧基(羟基)磷酰基)甲基-4-甲苯磺酸酯中间精密度考察结果
Figure BDA0002390087220000096
Figure BDA0002390087220000101

Claims (7)

1.一种检测替诺呋韦中基因毒性杂质含量的方法，所述替诺呋韦中基因毒性杂质包括SM-A3、SM-A4、(乙氧基(羟基)磷酰基)甲基-4-甲苯磺酸酯和4-甲基苯磺酸乙酯，结构式如下所示：
Figure FDA0002616692960000011
其特征在于：所述方法包括以如下分析方法1检测SM-A3、SM-A4、4-甲基苯磺酸乙酯3个杂质的操作，以及以如下分析方法2检测(乙氧基(羟基)磷酰基)甲基-4-甲苯磺酸酯的操作，
其中，所述分析方法1为：以SM-A3、4-甲基苯磺酸乙酯和SM-A4作为对照品，采用高效液相色谱法检测替诺呋韦中是否含有SM-A3、4-甲基苯磺酸乙酯和SM-A4以及按外标法以峰面积计算各杂质的含量；
所述分析方法2为：以(乙氧基(羟基)磷酰基)甲基-4-甲苯磺酸酯作为对照品，采用高效液相色谱法检测替诺呋韦中是否含有(乙氧基(羟基)磷酰基)甲基-4-甲苯磺酸酯以及按外标法以峰面积计算(乙氧基(羟基)磷酰基)甲基-4-甲苯磺酸酯杂质的含量；
所述分析方法1中，使用具有紫外检测器的高效液相色谱仪进行高效液相色谱法检测；其中，检测波长为225nm；
所述高效液相色谱法中，采用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱；
以体积比50:50的三氟乙酸水溶液-乙腈为流动相，其中，三氟乙酸水溶液的质量浓度为0.05％；流速为1.0±0.1ml/min；柱温为35±5℃；
所述分析方法2中，使用具有紫外检测器的高效液相色谱仪进行高效液相色谱法检测；其中，检测波长为200nm；
所述高效液相色谱法中，采用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱；
以体积比85:15的磷酸缓冲盐水溶液-乙腈为流动相，其中，磷酸缓冲盐水溶液为质量浓度为0.05mol/L的磷酸二氢钾水溶液，以磷酸调节pH值至3.0；流速为1.0±0.1ml/min；柱温为35±5℃。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述分析方法1中，所述高效液相色谱法中，所述色谱柱为MREDA 4.6×250mm，5μm型色谱柱。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述分析方法1的操作如下：
取替诺呋韦，加稀释剂，超声溶解，加水定量稀释成每1ml中含2mg替诺呋韦的溶液，作为供试品溶液；
称取SM-A3、4-甲基苯磺酸乙酯和SM-A4对照品，用稀释剂溶解并定量稀释制成每1ml中均含0.12μg的溶液，作为对照品溶液；
量取供试品溶液和对照品溶液各20μl分别注入液相色谱仪，记录色谱图；
得到的供试品溶液色谱图中如有与SM-A3、4-甲基苯磺酸乙酯和/或SM-A4保留时间一致的色谱峰，则按外标法以峰面积分别计算SM-A3、4-甲基苯磺酸乙酯和/或SM-A4的含量；如没有与SM-A3、4-甲基苯磺酸乙酯和SM-A4保留时间一致的色谱峰，则判断替诺呋韦样品中不含SM-A3、4-甲基苯磺酸乙酯和/或SM-A4。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：替诺呋韦的保留时间为2.166min；
SM-A3的保留时间为7.580min；
4-甲基苯磺酸乙酯的保留时间为9.647min；
SM-A4的保留时间为14.055。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述分析方法2中，所述高效液相色谱法中，所述色谱柱为Agela 4.6×150mm，5μm型色谱柱。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述分析方法2的操作如下：
取替诺呋韦，加稀释剂超声溶解，加水定量稀释制成每1ml中含1mg的溶液，作为供试品溶液；
称取(乙氧基(羟基)磷酰基)甲基-4-甲苯磺酸酯对照品；用稀释剂溶解并定量稀释制成每1ml中含0.06μg的溶液，作为对照品溶液；
量取供试品溶液和对照品溶液各20μl分别注入液相色谱仪，记录色谱图；
得到的供试品溶液色谱图中如有与(乙氧基(羟基)磷酰基)甲基-4-甲苯磺酸酯对照品保留时间一致的色谱峰，则按外标法以峰面积计算替诺呋韦中(乙氧基(羟基)磷酰基)甲基-4-甲苯磺酸酯杂质的含量；如没有与(乙氧基(羟基)磷酰基)甲基-4-甲苯磺酸酯对照品保留时间一致的色谱峰，则判断替诺呋韦样品中不含(乙氧基(羟基)磷酰基)甲基-4-甲苯磺酸酯杂质。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：替诺呋韦的保留时间为1.490min；
(乙氧基(羟基)磷酰基)甲基-4-甲苯磺酸酯的保留时间为13.226min。
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