CN111228271A - 含拉帕替尼的药物组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含拉帕替尼的药物组合物及其应用，具体涉及拉帕替尼和槲皮素、木犀草素的联合以及他们的药物组合物在治疗新的肿瘤中的应用。发明人基于中西药联合作用的思路，在传统的中药提取物中，寻找到能与拉帕替尼联合的中药单体，研究结果表明，槲皮素、木犀草素在一定比例范围内和拉帕替尼联用时，具有很好的协同效果，本申请为拉帕替尼临床应用提供了新的参考。

Description

含拉帕替尼的药物组合物及其应用
技术领域
本申请属于医药领域，具体涉及含拉帕替尼的药物组合物及其应用。
背景技术
拉帕替尼(Lapatinib)化学名称N-[3-氯-4-[(3-氟苯基)甲氧基]苯基]-6-[5-[(2-甲磺酰乙基氨基)甲基]-2-呋喃基]喹唑啉-4-胺，分子式为C29H26ClFN4O4S，是一种小分子表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂，为临床常用抗肿瘤药，主要用于联合卡培他滨治疗ErbB-2过度表达的，既往接受过包括蒽环类、紫杉醇、曲妥珠单抗(赫赛汀)治疗的晚期或转移性乳腺癌。对于既有药品新的适用症的开发一直是药品的研究热点，拉帕替尼作为临床的抗肿瘤药品，一直备受瞩目，许多科研人员在积极开发其在其他肿瘤中的适用。
中西药联合治疗肿瘤是目前的研究热点之一，药理作用相同或相似的中成药与西药联合使用可能发挥协同增效的作用，减少西药用量，缩短治疗周期，不过也存在一定的风险，如降低疗效，梅花点舌丹等与维生素C、阿司匹林等酸性药物联合使用时，可使其中的皂苷类有效成分发生分解，导致疗效降低；影响药物代谢，金复康口服液中的黄芪甲苷可显著抑制CYP3A4和CYP2C9的活性等，故而，在具体联用是需要通过实验验证及条件的摸索，从而推动中西药联合使用的合理性。
本申请基于中西药联合作用的思路，寻找到与拉帕替尼联合的中药单体——槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)，及二者联用时的协同区间，为槲皮素、木犀草素与拉帕替尼的临床联合用药提供基础，也为拉帕替尼的新的临床适用症提供研究基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种治疗癌症的药物组合物，所述组合物由拉帕替尼与中药单体组成，所述中药单体为槲皮素、木犀草素。
进一步，拉帕替尼与槲皮素浓度比为5-10：12.5-100；拉帕替尼与木犀草素浓度比为5-10：6.25-50。
优选的，拉帕替尼与槲皮素浓度比为5-10：12.5-25；拉帕替尼与木犀草素浓度比为5-10：6.25-9.4或5-10：50。
优选的，拉帕替尼与槲皮素浓度比为5：12.5-25；拉帕替尼与木犀草素浓度比为5：6.25-9.4或5：50。
更优选的，药物联用时选择拉帕替尼浓度为5uM和槲皮素浓度为12.5-25uM；药物联用时选择拉帕替尼浓度为5uM和木犀草素浓度6.25uM或50uM。
本发明的目的在于提供上述药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
进一步，肿瘤为肺癌。
进一步，上述药物组合物在制备抗肿瘤细胞增殖药物中的应用。
进一步，上述药物组合物在制备抗肿瘤细胞迁移药物中的应用。
本发明的优点：
拉帕替尼和槲皮素、木犀草素的联合用药在一定配比范围内能明显提高药物抗肿瘤细胞增殖和迁移方面的药效，产生了协同作用，能够有效降低药物成本，提高临床治疗效果，尤其是拉帕替尼和木犀草素的组合。
附图说明
图1是槲皮素的IC50值的测定图；
图2是木犀草素IC50值的测定图；
图3是对照组单独用药细胞迁移情况图，左图为0h拍照，右图为24h时拍照；
图4是槲皮素单独用药细胞迁移情况图，左图为浓度为12.5uM时0h拍照，右图为浓度为50uM时加药后24h时拍照；
图5是木犀草素单独用药细胞迁移情况图，左图为浓度为6.25uM时0h拍照，右图为浓度为6.25uM时加药后24h时拍照；
图6是拉帕替尼单独用药细胞迁移情况图，左图为浓度为5uM时0h拍照，右图为浓度为5uM时加药后24h时拍照；
图7是槲皮素和拉帕替尼联合用药时细胞迁移情况图，左图为槲皮素浓度为12.5uM+拉帕替尼浓度为5uM时0h拍照，右图为槲皮素浓度为12.5uM+拉帕替尼浓度为5uM时加药后24h时拍照；
图8是木犀草素和拉帕替尼联合用药时细胞迁移情况图，左图为木犀草素浓度为6.25uM+拉帕替尼浓度为5uM时0h拍照，右图为木犀草素浓度为6.25uM+拉帕替尼浓度为5uM时加药后24h时拍照。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1
1.实验主要试剂
试剂名称 厂家 货号
MTT Solarbio M8180-250mg
血清 四季青 11011-8611
1640培养基 Corning 10040005
胰酶 Solarbio 20190930
青霉素链霉素混合液 罗比生物 KGY0023
PBS 自制
拉帕替尼(Lapatinib) Bidepharm BD135884-250mg
槲皮素(quercetin) Bidepharm BD30401-25g
木犀草素(luteolin) Bidepharm BD6331-1g
DMSO Solarbio D8371
2.实验主要仪器
Figure BDA0002433864110000031
Figure BDA0002433864110000041
3.实验方法
3.1细胞培养及分组
(1)细胞培养：培养人肺癌细胞(A549)，细胞用含10％的FBS、100units/ml的青霉素和100ug/ml的链霉素以及89％的1640培养基，在37℃、5％CO2以及饱和湿度的条件下培养。适时更换培养基和传代。
(2)细胞分组：
A549—空白不含细胞的培养基
A549—对照正常培养细胞
A549--1槲皮素(quercetin)处理组(不同浓度梯度)
A549--2木犀草素(luteolin)处理组(不同浓度梯度)
A549--3拉帕替尼(Lapatinib)处理组
A549--5槲皮素(quercetin)+拉帕替尼(Lapatinib)处理组(不同浓度梯度)
A549--6木犀草素(luteolin)+拉帕替尼(Lapatinib)处理组(不同浓度梯度)
3.2 MTT实验
(1)MTT液配制(250mg MTT溶于50ml的PBS溶液中，0.22μm微孔滤膜过滤，4℃避光保存)。
(2)人肺癌细胞加入培养液PRIM-1640(含有10％新生牛血清、1％双抗)中，放入37℃、5％CO2孵箱中培养，隔日换液1次，0.25％胰酶-EDTA消化传代冻存。
(3)取对数生长期的细胞，调整细胞悬液浓度，加入96孔培养板，每孔100μl细胞悬液(含1×104个细胞)培养24h
(4)细胞贴壁后再加入不同组分的药物培养基进行处理，实验设空白调零组(只加培养液)、细胞对照组(未用药物处理的细胞悬液)和药物处理组(每组药物浓度设5个浓度水平)，拉帕替尼(Lapatinib)0.625、1.25、2.5、5、10、20、40uM；槲皮素(quercetin)3.125、6.25、12.5、25、50、100、200uM；木犀草素(luteolin)1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100uM，每组设3个复孔，不同药物作用24h。
(5)吸取含药培养基，更换无药物的信箱培养基后，每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL，孵育4h，离心弃上清。
(6)每孔加入DMSO 150μL，震荡10min。酶联免疫检测仪检测570nm波长各孔的吸光度(OD)值。
3.3 IC50值的测定及联合用药效果的判定
(1)半数抑制浓度(IC50)值的计算：根据不同浓度的药物对细胞的作用，采用GraphPad Prism7软件来计算半数抑制浓度(IC50)值。
(2)细胞终止培养后，收集细胞，采用MTT法测定各组细胞活性并计算抑制率(抑制率＝(对照组OD值-给药组OD值)/对照组OD值×100％)。
(3)双药联合用药效果的判定：
联合用药效果判断的计算方法：采用金正均q值法进行判定。q值由以下的公式求得：q＝PA+B/(PA+PB-PA×PB)。式中PA、PB和PA+B分别为A药组、B药组和两药联用组治疗率。q＜1说明两药合用后产生拮抗作用；q＞1，说明两药合用后产生协同作用，q＝1说明两药合用后产生相加作用。
3.4细胞划痕实验
将细胞密度调整为1×105/ml接种于6孔板中，待细胞贴壁后，吸去培养基，PBS清洗，用200μl枪头在培养板每孔中央沿纵轴方向划一直线，PBS清洗，分别加入正常培养基及含药培养基继续培养，分别于0、24h时，倒置显微镜下拍照。Image J软件测量各组细胞迁移距离。
4.实验结果
4.1 IC50值的测定
结果显示，槲皮素3.125、6.25、12.5、25、50、100、200uM时平均抑制率分别为2.97％、6.63％、15.63％、39.90％、67.22、78.29％％和83.80％，采用GraphPad Prism7软件来计算半数抑制浓度(IC50)值为27.06(具体见图1)；木犀草素1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100uM时平均抑制率分别为7.30％、11.70％、21.50％、45.23％、65.96％、77.61％和87.50％，采用GraphPad Prism7软件来计算半数抑制浓度(IC50)值为13.80(具体见图2)；同理，测得拉帕替尼半数抑制浓度(IC50)值为9.40。
4.2联合用药效果效果
槲皮素、木犀草素与拉帕替尼的联合用药效果：
分组 抑制率 Q值
槲皮素(100uM) 0.7830 -
槲皮素(50uM) 0.6722 -
槲皮素(25uM) 0.3990 -
槲皮素(12.5uM) 0.1563 -
槲皮素(6.25uM) 0.0664 -
拉帕替尼(1.5uM) 0.2453 -
槲皮素(100uM)+拉帕替尼(5uM) 0.9038 1.056830679
槲皮素(50uM)+拉帕替尼(5uM) 0.7566 0.96836313
槲皮素(25uM)+拉帕替尼(5uM) 0.6819 1.138370928
槲皮素(12.5uM)+拉帕替尼(5uM) 0.8064 1.844818824
槲皮素(6.25uM)+拉帕替尼(5uM) 0.3474 0.921187712
木犀草素(50uM) 0.7761 -
木犀草素(25uM) 0.6596 -
木犀草素(12.5uM) 0.4523 -
木犀草素(6.25uM) 0.2151 -
木犀草素(3.125uM) 0.1170 -
木犀草素(50uM)+拉帕替尼(5uM) 0.8995 1.057499
木犀草素(25uM)+拉帕替尼(5uM) 0.6765 0.875315
木犀草素(12.5uM)+拉帕替尼(5uM) 0.5764 0.908342
木犀草素(6.25uM)+拉帕替尼(5uM) 0.7248 1.521658
木犀草素(3.125uM)+拉帕替尼(5uM) 0.4009 0.975779
从上述结果中可以看出槲皮素和拉帕替尼在一定比例区间内时表现出对肺癌细胞的协同抑制作用；木犀草素和拉帕替尼在一定比例区间内时也表现出对肺癌细胞的协同抑制作用。
4.3划痕实验结果
细胞划痕实验主要用于验证肿瘤研究中细胞迁移能力。通过判断对照组与实验组划痕的距离来判断细胞的迁移能力。愈合率越低显示药物对肿瘤细胞迁移能力的影响作用越大。本实验中，首先，测定对照组、槲皮素(12.5uM)、木犀草素(6.25uM)和拉帕替尼(5uM)时，各自的愈合率，结果显示，对照组愈合率为76.1％(具体见图3)，槲皮素(12.5uM)的愈合率分别为70.8％(见图4)，木犀草素(6.25uM)的愈合率分别为72.2％(见图5)，拉帕替尼(5uM)的愈合率为71.8％(见图6)。进一步根据联合用药的抑制率的结果，挑选组合进行划痕实验，计算愈合率，其中槲皮素(12.5uM)和拉帕替尼(5uM)的联合用药组中，愈合率为61.4％(具体见图7)；木犀草素(6.25uM)和拉帕替尼(5uM)的联合用药组中，愈合率为64.0％(具体见图8)。

Claims (10)

1.一种治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物由拉帕替尼与中药单体组成，其特征在于，中药单体为槲皮素、木犀草素。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，拉帕替尼与槲皮素浓度比为5-10：12.5-100；拉帕替尼与木犀草素浓度比为5-10：6.25-50。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，拉帕替尼与槲皮素浓度比为5-10：12.5-25；拉帕替尼与木犀草素浓度比为5-10：6.25-9.4或5-10：50。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，拉帕替尼与槲皮素浓度比为5：12.5-25。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，拉帕替尼与木犀草素浓度比为5：6.25-9.4或5：50。
6.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，拉帕替尼浓度为5uM和槲皮素浓度为12.5-25uM；拉帕替尼浓度为5uM和木犀草素浓度为6.25uM；拉帕替尼浓度为5uM和木犀草素浓度为50uM。
7.权利要求1-6所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，肿瘤为肺癌。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物组合物在制备抗肿瘤细胞增殖药物中的应用。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物组合物在制备抗肿瘤细胞迁移药物中的应用。
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PB01 Publication
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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RJ01 Rejection of invention patent application after publication
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