CN111220680B - 一种蛋白质吸附材料及其制备及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新的蛋白质吸附材料的合成及应用，以氧化石墨烯为载体，通过氢键与静电相互作用，在其表面修饰聚乙烯亚胺，聚乙烯亚胺作为还原剂和稳定剂，通过在高温下与氯金酸的氧化还原反应实现纳米金颗粒在氧化石墨烯表面的固定。最后，加入聚合物微球，通过在室温下搅拌，便可利用非共价键合方式实现氧化石墨烯纳米金复合材料在聚合物微球表面上的修饰，最终实现蛋白质吸附材料的制备。该材料可利用纳米金与蛋白质的物理吸附，非共价吸附，化学共价结合作用，实现蛋白质的选择性吸附。具有材料合成简单，处理过程中操作容易，蛋白质回收率高，适用范围广，抗干扰能力强等优点。

Description

一种蛋白质吸附材料及其制备及应用
技术领域
本发明涉及一种蛋白质吸附材料，并可用于发展固相烷基化样品预处理技术，固相酶解技术，可应用于大规模组织切片样品，微量组织或细胞样本的蛋白质等的高通量分析。
背景技术
在对蛋白质样品进行质谱分析时，通常会涉及十分重要的蛋白质的前处理过程。常规的分析流程包括蛋白质的变性，还原，烷基化，酶解，除盐，质谱采集，数据分析。样品处理流程较多，步骤繁琐，传统处理时间较长，很难避免浪费。目前所研究的样品蛋白趋于微量且为了得到某些规律研究对象的样品数量较多，因此，亟待发展高通量，高覆盖度，高回收率的样品前处理方法。
对于传统的样品处理，为了得到更多的膜蛋白等更多有用的信息，通常在处理过程中引入表面活性剂等对后续酶解和质谱分析有较大影响的物质。因此，要对这些物质进行完全的去除。目前，较常用的去除表面活性剂的方法是基于滤膜辅助的样品制备(FASP)方法，它的原理是利用一定截留分子量的滤膜，通过离心的方式实现溶剂的有效替换。能够实现表面活性剂等物质的很好的去除。但是，滤膜对样品有较多的吸附，造成样品的回收率较低，因此不适合微量样品的处理。同时，样品处理的时间较长。此外，也发展了节省时间的基于Stage-tips的样品处理方法，将填料填充在tip头中，实现蛋白质的集成化处理，但是由于整个体系不耐受表面活性剂等物质，因此在处理样品时有一定的局限性。因此，发展一种节省时间，回收率高，抗干扰能力强的样品处理方法是十分必要的。因此，考虑合成材料实现对蛋白质的吸附，并进行固相酶解，实现蛋白质高的回收率，提升体系的抗干扰能力。
金粒子可通过物理吸附，化学共价，非共价吸附等与蛋白质发生较强的相互作用。因此在设计材料时，可充分利用金与蛋白质间强的相互作用实现蛋白质在材料表面的固定，通过离心洗涤溶剂方式便可实现干扰物质的去除，在材料表面实现蛋白质的酶解，得到肽段无需除盐便可进入质谱分析，样品损失较少，且体系的抗干扰能力强，利于微量样品的处理。
参考文献
[1].Nils A Kulak,et al.Nature Methods.2014,11,319–324.
[2].Jacek,et al.Nature Methods.2009,10,359-363.
发明内容
为了解决上述的问题，本发明的目的在于提供一种可用于微量蛋白质处理的蛋白质吸附材料。该材料不仅可以实现蛋白质的高效快速吸附，而且还能实现与其它小分子的快速分离，增强体系的抗干扰能力，降低蛋白质样品的复杂程度。为了实现该目的，本发明的技术方案是：
1)氧化石墨烯，聚乙烯亚胺混合后，在室温下800-1500rpm振荡反应6-20h过夜，得到在氧化石墨烯上键合聚乙酰亚胺的固体颗粒(GO/PEI)；
其中氧化石墨烯量为0.1-0.5mg，加入质量比1:5-1:20的去离子水超声混匀，聚乙烯亚胺加入量为氧化石墨烯量的200-400倍(质量比)，在10-40℃进行反应，反应结束后，在6000-14000rpm下离心2-10min，离心后用水洗2-5次，直到上清液变为中性；
2)氧化石墨烯上键合聚乙酰亚胺的固体颗粒，氯金酸溶液混合后，振荡混匀，在50-80℃下水浴反应0.5-3h制备成石墨烯上键合聚乙酰亚胺连接金的固体颗粒(GO/PEI/Au)；
其中氧化石墨烯上键合聚乙酰亚胺的固体颗粒加入量为0.1-0.5mg，氯金酸加入量为氧化石墨烯上键合聚乙酰亚胺的固体颗粒质量的3-5倍左右，反应结束后，用去离子水洗2-5次，每次在6000-14000rpm下离心2-10min；
3)在石墨烯上键合聚乙酰亚胺连接金的固体颗粒(GO/PEI/Au)表面连接氨基聚合球，具体步骤如下：
将氨基聚合球超声分散均匀于水中，配制成浓度为1-10mg/mL的溶液。同时，将GO/PEI/Au分散于水溶液中，并加入到氨基聚合球溶液中，在10-40℃下振荡反应4-8h，水洗后在6000-14000rpm下离心2-10min即可得到PM@GO/PEI/Au固体颗粒；
其中，聚合球加入的量约为GO/PEI/Au固体颗粒量的50-100倍；
4)在利用聚合球表面键合的以氧化石墨烯基质为基础的带有纳米金的材料(PM@GO/PEI/Au)处理蛋白样品，具体步骤如下：
PM@GO/PEI/Au固体颗粒用水混成浓度为0.5-1.5mg/mL的溶液，取微克级的蛋白样品，经过常规的变性还原处理后，加入蛋白量5-100倍质量的材料，在15-40℃，1000-1500rpm振荡条件下反应0.5-4h，然后在5000-16000g下离心3-5min，去掉上清后，分别用去离子水或30-100％的甲醇溶液，浓度为25-75mM的pH为7.5-8.5的磷酸盐缓冲溶液(PB)或者25-75mM的pH为7.5-8.5的碳酸氢铵溶液洗2-5次，最终将固相球溶在25-75mM的pH为7.5-8.5碳酸氢铵溶液中，按照酶与蛋白质质量比1:25-1:100的量加入胰蛋白酶，酶解后离心得到上清液，即为所需要的肽段。本发明具有如下优点：
1、氧化石墨烯比表面积大，且含有多种官能团，利于后续反应的高效进行；
2、采用PEI，能与氧化石墨烯通过氢键与静电相互作用很好的结合，且含有较多的氨基与亚氨基，不仅提高了颗粒表面的亲水性，而且还可作为还原剂和稳定剂，实现材料表面对纳米金颗粒的固定；
3、Au与蛋白质的巯基有很强的相互作用，因此利用纳米金材料能实现蛋白质的快速吸附固定；
4、蛋白质吸附材料制备过程容易控制，反应简单，重复性好；
5、制备的蛋白质吸附材料，可以实现微量组织或细胞中蛋白质的快速捕获与吸附。
6、该材料在处理蛋白质样品时，抗干扰能力较强，通过清洗离心的方式便可实现蛋白样品与干扰物质的有效分离。
附图说明
图1：蛋白质吸附材料的合成示意图(a)及蛋白质处理示意图(b)；
图2：蛋白质吸附材料的性能评价；
图3：蛋白质吸附材料处理BSA的性能评价；
图4：蛋白质吸附材料处理血浆样品的性能评价；
图5：蛋白质吸附材料处理尿液样品的性能评价。
具体实施方式
实施例1
1、GO的修饰：称取10mg GO，加入10mL水超声分散均匀不能看到明显沉积不溶物后，将所得溶液用水稀释十倍，即得到浓度为0.1mg/mL的溶液；每份取1mL溶液，即0.1mg的GO，各加入300μL 100mg/mL的PEI，在25℃下，以1400rpm速度振荡过夜，保证始终不出现颗粒沉积；
2、Au的引入：上述溶液反应结束后，14000rpm转速离心15min以去除未反应到GO上的PEI，去除上清后在其中加入1mL水，1μL 100mg/mL的PEI，4μL 100mg/mL的HAuCl4，在70℃下水浴反应1h；反应后在14000rpm下离心15min去除上清，再水洗三次去除未键合的Au；
3、聚合球的引入：称取75mg聚合球，加入10mL水超声分散均匀，缓慢加入1mL 1mg/mL的GO/PEI/Au，室温下搅拌反应6h,除去上清后用去离子水洗3次，每次1000g离心5min，最终得到淡紫色的蛋白质吸附材料PM@GO/PEI/Au，并分散于无水乙醇中待用。制备示意图如图1所示。
实施例2
取4％SDS提取的Hela细胞蛋白(BCA法测浓度为2mg/mL)20μL，加入0.5mL，pH为8的50mM的磷酸盐缓冲液(PB)，混匀后，加入5μL 1M的TCEP，在95℃振荡器中1500rpm条件反应10min，冷却后，放置室温，加入1mg蛋白质吸附材料PM@GO/PEI/Au(在以水溶成浓度为10mg/mL的溶液中取100μL)，混合均匀，在40℃下，1000rpm振荡反应0.5h，后14000rpm离心5min去掉上清；用50％甲醇和50mM pH为8的磷酸盐缓冲液(PB)各洗材料5次，每次清洗均在14000rpm离心条件进行，后在材料中加入100μL的pH为8的碳酸氢铵溶液，保持整个体系均匀，之后在溶液内加入1μg胰酶酶解(37℃，1000rpm)12h，反应完全后，14000rpm离心5min，取上清，后用50％ACN清洗整个体系，再次14000rpm离心5min，合并上清。冻干后，并用30μL0.1％FA复溶，通过Q-Exactive质谱分析，鉴定蛋白数为2300种。结果示意图如图2所示。
实施例3
称取1mg BSA，用4％SDS配成1mg/mL浓度的溶液，后取20μL，加入200μL pH为8的50mM的磷酸盐缓冲液(PB)，5μL 1M的DTT，在95℃下煮30min，冷却后，加入0.5mg的PM@GO/PEI/Au(1mg/mL取500μL)，在25℃下，1000rpm振荡反应1h，后14000rpm离心5min去掉上清；用80％甲醇和25mM的碳酸氢铵溶液各洗5次后加入200μL的50mM的pH为8的碳酸氢铵溶液，加入0.8μg胰酶在37℃下，1500rpm振荡酶解12h，10000rpm离心3min,取上清，用80％ACN清洗材料后将上清合并，冻干复溶后进行LC-MS分析，通过匹配数据库，测得BSA的序列覆盖率为82％。结果示意图如图3所示。
实施例4
取1μL健康人原始血浆，加入100μL 4％SDS进行稀释，然后加入终浓度为6M的盐酸胍与5mM的DTT，在56℃反应1.5h，待冷却后，加入PM@GO/PEI/Au 0.8mg(10mg/mL取80μL)，在40℃下，1000rpm振荡反应4h，后14000rpm离心5min去掉上清；下层颗粒用去离子水和50mM的磷酸盐缓冲液(PB)各洗5次，洗去表面活性剂，盐等污染物质。后加入50μL的25mM的pH为8.5的碳酸氢铵溶液，加入2μg胰酶酶解(37℃，1000rpm)18h，离心取上清，用100μL 80％ACN清洗材料后将上清合并，冻干复溶后进行LC-MS分析，通过匹配数据库，共鉴定到242种蛋白。结果示意图如图4所示。
实施例5
取10μg利用4％SDS提取的PEG在4℃过夜处理的尿液得到的外泌体，加入0.3mL的pH为8的50mM的磷酸盐缓冲液(PB)，加入3μL 1M的TCEP，混匀后，在37℃下反应1.5h，后冷却至室温，加入200μg的PM@GO/PEI/Au，在20℃下反应1h，此过程应该在1250rpm下充分振荡，保证材料与样品的充分结合，然后在8000g下离心，去掉上清后，分别用去离子水，浓度为25mM的pH为8.5的磷酸盐缓冲溶液(PB)洗4次，最终得到的上清液澄清无色，得到的吸附蛋白样品的固相球溶在50mM的pH为8的碳酸氢铵溶液(PB)中，加入0.2μg的胰蛋白酶，在37℃下1500rpm下振荡反应16h，后16000g离心3min得到上清液，进行冻干，用10μL的0.1％FA复溶后直接进入Q-Exactive质谱分析。通过匹配数据库，共鉴定到1087个蛋白。结果示意图如图5所示。

Claims (4)

1.一种蛋白质吸附材料在处理细胞、组织、 血浆、尿液中的一种或二种以上样品中的蛋白质中的应用，其特征在于，以氧化石墨烯为载体，通过氢键 与静电相互作用在氧化石墨烯载体表面上引入过量的含有氨基的聚乙烯亚胺 （PEI），然后通过氨基与氯金酸发生氧化还原反应，得到纳米金颗粒， 实现纳米金在材料表面的修饰，然后通过非共价键合方式，使材料包覆于聚合物微球表面，制备成一种含有较多纳米金颗粒固定的蛋白质吸附材料PM@GO/PEI/Au；PM@GO/PEI/Au在进行样品处理时，先将蛋白样品变性还原，使蛋白质中的巯基充分暴露，后放置室温，加入PM@GO/PEI/Au 材料，材料的质量为处 理蛋白量的 5-100倍，在15-40℃下反应 0.5-4 h，此过程在 1000-1500 rpm 下充分振荡，保证材料与样品的充分结合，然后在 5000-16000 g 下离 心，去掉上清后，先用去离子水或 30-100%的甲醇溶液洗 2-5 次，再用浓度为 25-75 mM 的 pH 为 7.5-8.5 的磷酸盐缓冲溶液或者 25-75mM 的pH 为7.5-8.5的碳酸氢铵溶液洗 2-5次，使上清液澄清无色；得到的吸附蛋白样 品的固相球溶在 25-75 mM 的 pH 为7.5-8.5 的碳酸氢铵溶液中，按照酶与蛋白质质量比1:25-1:100 的比例加入胰蛋白酶，在 30-40℃下充分反应， 即可 将蛋白从材料表面酶切下来进入溶液，后通过离心的方式获取上清液， 进行 冻干复溶后直接进入质谱分析。
2.按照权利要求 1所述的应用，其特征在于，所述的蛋白质吸附材料的制备包含以下步骤： 1）以氧化石墨烯(GO)为材料基质，按照质量比 1:5-1:20 超声分散于去离子 水中，得到氧化石墨烯溶液；称取聚乙烯亚胺(PEI)，用水超声得到聚乙烯亚胺 溶液，然后将两者混合，在 10-40℃，800-1500 rpm 下振荡反应 6-20 h，离心水洗 2-5 次，每次 6000-14000 rpm 离心 2-10 min 去除掉过量的 PEI，得到 在氧化石墨烯上键合聚乙烯亚胺的固体颗粒（GO/PEI）；其中氧化石墨烯量 为 0.1-0.5 mg，聚乙烯亚胺加入质量为氧化石墨烯质量的 200-400 倍； 2）氧化石墨烯上键合聚乙酰亚胺的固体颗粒与氯金酸（HAuCl4）混合后，在水溶液中 50-80℃下水浴反应 0.5-3 h 制备成氧化石墨烯上键合聚乙酰亚 胺连接金的固体颗粒（GO/PEI/Au）； 其中氧化石墨烯上键合聚乙酰亚胺（GO/PEI）的固体颗粒加入量为每 0.5-5mL水中 0.1-0.5 mg，氯金酸加入的质量为固体颗粒加入质量的 3-5倍，反应后，用去离子水离心洗涤 2-5 次，每次在 6000-14000 rpm 下离 心 2-10 min 去除掉未反应在材料上的游离的纳米金颗粒； 3) 在氧化石墨烯上键合聚乙酰亚胺连接金的固体颗粒（GO/PEI/Au）表面连接氨基聚合球，具体步骤如下： 按照氨基聚合球与去离子水质量比 1:1-10:1 将氨基聚合球超声分散均匀，将 GO/PEI/Au 分散于水溶液中，并加入到氨基聚合球溶液中，10℃-40℃下搅拌反应 4-8 h，后在 6000-14000 rpm 离心 2-10 min 的条件下水洗或无水 乙醇洗 2-5 次，即可得到PM@GO/PEI/Au 复合纳米材料； 其中，聚合球加入的量为 GO/PEI/Au 固体颗粒质量的 50-100倍。
3.按照权利要求 1所述的应用，其特征在于，制备的PM@GO/PEI/Au 在后续处理样品时浓度控制在 0.5-1.5 mg/mL，材料在进 行反应时应该充分振荡，避免沉积，以保证反应充分进行。
4.按照权利要求 1所述的应用，其特征在于，利用金与蛋白质巯基的相互作用实现蛋白质在材料表面的固定，后通过离心方式实现材料与溶剂的分离，反复 2 次以上洗涤材料实现材料表面的干扰物质及其 污染物质等的有效去除；此后，在材料表面对样品进行固相酶解，得到肽段进行冻干复溶后直接进入 LC-MS 分析，无需除盐操作，整个过程样品转 移较少，避免了操作过程中的损失，适合用于微量样品的处理。
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