CN111217889A - 一种黄芪中二硫键多肽的纯化和鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从黄芪中富集多肽并进行鉴定的方法，是将经鉴定无误的干燥黄芪切片经醇液超声提取、过滤、浓缩、萃取、有机试剂富集黄芪中的多肽并通过烷基化处理、质谱分析及De Novo分析鉴定其中的二硫键多肽。本发明成功地将传统的植物化学分析方法、生物化学方法及质谱方法相结合进行多肽富集及检测，无需脱盐、超滤分离、特殊色谱柱填料等操作，步骤少、操作简便，为现代植物多肽的研究提供了技术参考及指导。
Description
技术领域
本发明属于分离分析及生物技术领域，具体涉及一种将传统植物提取方法与生物技术结合来富集鉴定二硫键多肽的方法。
背景技术
黄芪，为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fish.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fish.)Bge的干燥根。始载于《神农本草经》，具有补气升阳，固表止汗，利水消肿，生津养血，行滞通痹，托毒排脓，敛疮生肌等作用。现代医学研究其具有抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、抗病毒、抗损伤、降血糖、治疗代谢紊乱等活性作用。研究最多的主要活性成分为黄酮类、皂苷类、多糖类成分。
自然界中存在着大量的多肽类化合物，前人更多地关注于动物体中的多肽、蛋白类成分，而在植物中主要研究黄酮、蒽醌、三萜、皂苷、生物碱等类化合物。随着现代分离及分析技术的飞跃发展，越来越多的植物中多肽类化合物被鉴定得到，且实验研究发现许多植物多肽类成分具有较强的生物活性，这为新药研发带来了更多的可能性。目前，研究发现植物多肽具有抗肿瘤、抗炎、抗衰老、提高免疫活性、降糖、修复神经损伤等方面的活性，继而开发了一些具有显著疗效的临床药物。
自然界中存在的多二硫键肽(常含2-4对二硫键，分子量2500-4000)因为结构稳定、空间结构特殊而多具有重要的生理功能以及优异的成药特性。与线性多肽相比，多二硫键肽的种类有限，在动植物中分布稀疏，难以被发现；其结构稳定性高，骨架长，难以被通用的蛋白质组学手段进行序列及结构测定；尤其是多对二硫键形成的二硫键桥环难以被准确测定。这些因素，导致二硫键多肽的发现和结构鉴定成为活性多肽研究领域的一个难点。而植物多肽类药物具有广阔的发展前景，由于植物中成分复杂，多肽含量较少，有效分离纯化的方法较少等原因导致其发展受到了一定的限制，为改善这一限制条件，越来越多的分离、纯化、鉴定方法应运而生，并且取得了良好的效果。目前，多肽、蛋白的分离纯化方式还是需要依靠特殊处理，如：尿素提取、酶法制备等，操作较为繁琐，后处理过程较多。因此，发展一种有效、简便、快速分离纯化的方法是一项非常有价值的研究课题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种黄芪中二硫键多肽的纯化和鉴定方法，所述方法至少包括以下步骤：
a)制备黄芪提取液；
b)向所述黄芪提取液中加入萃取剂A，得到含有萃取剂A的萃取液和不含萃取剂A的萃取液；
c)向所述不含萃取剂A的萃取液中加入醇类萃取剂B，得到含有醇类萃取剂B的萃取液和不含醇类萃取剂B的萃取液；
d)将所述含有醇类萃取剂B的萃取液浓缩制得干燥物I,然后使所述干燥物I中与混合萃取液C接触，将所得沉淀物浓缩制得干燥物II；
e)将所述干燥物II分成两等份干燥物II-1和干燥物II-2；
f)将溶解有所述干燥物II-2的尿素溶液与二硫苏糖醇混合反应，制得前驱体1；
g)将所述前驱体1与碘乙酰胺接触，进行烷基化反应得到前驱体2；
h)向所述前驱体2中加入二硫苏糖醇，反应结束后除盐并进行干燥，得到干燥物III；
i)采用质谱技术对所述干燥物II-1和所述干燥物III进行多肽检测分析
在优选的实施方式中，将所述干燥物II-1的质谱数据用作所述干燥物III的二硫键的烷基化多肽质谱数据的内在对照。
在优选的实施方式中，所述萃取剂A选自乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷中的至少一种
优选地，所述萃取剂A与所述黄芪提取液的体积比为1:1。
在优选的实施方式中，所述醇类萃取剂B为正丁醇。
优选地，所述萃取剂B与所述萃取剂A的萃取液的体积比为1:1。
在优选的实施方式中，其特征在于，所述混合萃取液C由醇类萃取剂正丁醇和二氯甲烷或氯仿组成。
优选地，所述混合萃取液C中的醇类萃取剂与二氯甲烷的体积为：3～5:1。
优选地，所述萃取剂选自正丁醇。
优选地，所述混合萃取液C与所述干燥物I的溶液的体积比为1:4。
在优选的实施方式中，步骤f)中，溶解有所述干燥物II-2的尿素溶液与二硫苏糖醇混合反应在50～70℃下进行0.5～1.5小时。
优选地，步骤f)中，所述溶解有所述干燥物II-2的尿素溶液与二硫苏糖醇混合反应在水浴条件下进行。
在优选的实施方式中，步骤g)中，所述前驱体1与碘乙酰胺接触反应在常温下进行3～5小时。
在优选的实施方式中，步骤h)中，所述前驱体2中加入二硫苏糖醇，反应在常温下进行0.5～1.5小时。
在优选的实施方式中，所述黄芪提取液是固体黄芪样品的乙醇-水溶液；
优选地，乙醇在所述乙醇-水溶液中的体积比为70％。
在优选的实施方式中，所述质谱技术包括纳升液相-线性离子阱-静电场轨道离子阱联用质谱(Nano-LTQ-Orbitrap LC-MS/MS)或Q-TOF LC-MS/MS。
优选地，所述质谱技术是Nano-LTQ-LC/MS。
在优选的实施方式中，所述Nano-LTQ-LC/MS至少包括以下步骤：
使用Trap柱进行等度洗脱，其中洗脱流动相由85％～98％H2O的A相和2％～15％乙腈的B相组成，流速2.5～3.2μl/分钟；
使用Nano柱进行梯度洗脱，其中流速0.3μl/分钟，其中洗脱流动相由85％～98％H2O的A相和2％～15％乙腈的B相组成；之后依次进行：5％B洗脱0-5分钟，5～20％B洗脱5-10分钟，20～35％B洗脱10-20分钟，35～50％B洗脱20-45分钟，50～70％B洗脱45-55分钟，70～90％B洗脱55-60分钟，90％B洗脱60-70分钟，90％～5％B洗脱70-75分钟,5％B洗脱75-80钟，优选地，测试进样量为5μl。
本申请能产生的有益效果包括：
1)本发明提供了一种从黄芪中富集多肽并进行鉴定的方法，将富集得到的黄芪中的多肽进行处理，通过质谱分析及De Novo分析可以鉴定其中的二硫键多肽。
2)本发明成功地将传统的植物化学分析方法、生物化学方法及质谱方法相结合进行多肽富集及检测。为现代植物多肽的研究提供了的技术参考及指导。
3)本发明的方法中无需脱盐、超滤分离、特殊色谱柱填料等操作，步骤少、操作简便。该方法具有快速、简单、有效、准确等优点，为植物多肽的研究提供一条可行的途径。
附图说明
图1示出不同提取方式逐步富集黄芪中多肽的结果；
图2示出黄芪中二硫键多肽质谱鉴定结果。
具体实施方式
下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。
在具体的实施方式中，从黄芪中富集多肽并进行鉴定的方法包括以下步骤：
(1)粉碎干燥黄芪切片，每公斤药材粉末加入8倍体积70％乙醇-水溶剂，分2-3次在40℃超声浸提，每次1小时，抽滤一次，得黄芪提取液及滤渣；
(2)将黄芪提取液浓缩至无醇，加入去离子水混悬，按照体积比1:1向混悬液中加入乙酸乙酯、得到含乙酸乙酯的萃取液和不含乙酸乙酯的萃取液；
(3)取不含乙酸乙酯的萃取液，按照体积比1:1加入正丁醇，得到含有正丁醇的萃取液和不含正丁醇的萃取液；
(4)将含有正丁醇的萃取液进行浓缩至干，所得干燥物Ⅰ用去离子水混悬，按照体积比3:1进行有机混合试剂(正丁醇：二氯甲烷＝4:1)萃取，静置，取中间白色沉淀层，浓缩至干得干燥物Ⅱ；
(5)干燥物Ⅱ用50％ACN溶液溶解，离心，将其等分成2份(干燥物Ⅱ-1、干燥物Ⅱ-2)，氮气保护下浓缩干燥；
(6)将100μl尿素溶液(6M，100mM Tris缓冲液)加入得到的干燥物Ⅱ-2中，超声溶解，加入5μl二硫苏糖醇(DTT)(800mM，100mM Tris缓冲液)在57℃温度下水浴1h，加入20μl碘乙酰胺(IAM)(200mM,100mM Tris缓冲液)避光常温放置4h，再加入20μl二硫苏糖醇(DTT)(800mM，100mM Tris缓冲液)避光常温放置1h，经SPE脱盐处理，回收30％、70％乙醇-水溶液(含0.2％甲酸)馏分，氮气保护下浓缩至干，得干燥物Ⅲ；
(7)将干燥物Ⅱ-1及干燥物Ⅲ分别用100μl50％ACN超声溶解，12000rpm离心10min，分别取40μl装入液相小瓶；
(8)进行Nano-LTQ-LC/MS分析：
Trap柱：设置为等度洗脱，流速2.8μl/min，洗脱流动相组成为A：98％H2O(0.2％FA)，B:2％ACN(0.2％FA)；
Nano柱：设置为梯度洗脱，流速0.3μl/min，洗脱流动相组成为A:98％H2O(0.2％FA)B:2％ACN(0.2％FA)；0-5min，5％B(由1-2阀切换至1-6阀)；5-10min，5～20％B；10-20min，20～35％B；20-45min，35～50％B；45-55min，50～70％B；55-60min，70～90％B；60-70min,90％B(由1-6阀切换至1-2阀)；70-75min,90％～5％B,75-80min，5％B，进样量为5μl；
(9)质谱条件设置：
设置正离子采集模式，一级扫描范围为m/z:350-1500，碎裂模式CID，分辨率为120000；二级扫描范围为50-1500，碎裂模式为HCD，碎裂能量为30V，采集时间点前20个丰度最强多电荷且能够识别的离子，分辨率为60000；采用EST离子源，Orbi-orbi系统；
(10)Peaks参数设置
无酶解，离子碎裂模式为Mixed，检测系统为orbi-orbi，母离子(单一同位素离子质量)质量偏差为10ppm，子离子质量偏差为0.05Da；ALC(％)≥20；PTMs:Disulfind Bond(-1.01)、Pyro-glu from Q(-17.03)、Pyro-glu from E(-18.01)，按分子量为2500-4000Da，电荷数2-3进行离子结果筛选。
实施例1
1、黄芪中多肽类化合物的富集
粉碎干燥黄芪切片0.5kg，加入4L的70％乙醇水溶液，在40℃超声提取两次，每次1h，抽滤一次，得黄芪乙醇提取液和黄芪滤渣；将黄芪提取液浓缩至无醇体积，加入去离子水混悬，按照体积比1:1向混悬液中加入乙酸乙酯、得到含乙酸乙酯的萃取液和不含乙酸乙酯的萃取液；取不含乙酸乙酯的萃取液，按照体积比1:1加入正丁醇，得到含有正丁醇的萃取液和不含正丁醇的萃取液；将含有正丁醇的萃取液进行浓缩至干，所得干燥物Ⅰa；将干燥物Ⅰa用去离子水混悬，按照体积比3:1进行有机试剂(正丁醇：二氯甲烷＝4:1)萃取2次，静置，取中间白色沉淀层，浓缩至干得干燥物Ⅱa；干燥物Ⅱa用50％ACN，离心，取上清液等分成2份(干燥物Ⅱ-1a、干燥物Ⅱ-2a)，氮气保护下浓缩至干。
2、烷基化处理黄芪多肽富集样品
将100μl尿素溶液(6M，100mM Tris缓冲液)加入得到的干燥物Ⅱ-2a中，超声溶解，加入5μl二硫苏糖醇(DTT)(800mM，100mM Tris缓冲液)在57℃温度下水浴1h，加入20μl碘乙酰胺(IAM)(200mM,100mM Tris缓冲液)避光常温放置4h，再加入20μl二硫苏糖醇(DTT)(800mM，100mM Tris缓冲液)避光常温放置1h，经SPE脱盐处理，回收30％、70％乙醇-水溶液(含0.2％甲酸)馏分，氮气保护下浓缩至干，得干燥物Ⅲa；将干燥物Ⅱ-1a及干燥物Ⅲa分别用100μl 50％ACN超声溶解，12000rpm离心10min，分别取40μl装入液相小瓶。
实施例2
1、黄芪中多肽类化合物的富集
粉碎干燥黄芪切片0.5kg，加入4L的70％乙醇水溶液，在40℃超声提取两次，每次1h，抽滤一次，得黄芪乙醇提取液和黄芪滤渣；将黄芪提取液浓缩至无醇体积，加入去离子水混悬，按照体积比1:1向混悬液中加入丙酮、得到含丙酮的萃取液和不含丙酮的萃取液；取不含丙酮的萃取液，按照体积比1:1加入正丁醇，得到含有正丁醇的萃取液和不含正丁醇的萃取液；将含有正丁醇的萃取液进行浓缩至干，所得干燥物Ⅰb；将干燥物Ⅰb用去离子水混悬，按照体积比3:1进行有机试剂(正丁醇：二氯甲烷＝4:1)萃取2次，静置，取中间白色沉淀层，浓缩至干得干燥物Ⅱb；干燥物Ⅱb用50％ACN，离心，取上清液等分成2份(干燥物Ⅱ-1b、干燥物Ⅱ-2b)，氮气保护下浓缩至干燥。
2、烷基化处理黄芪多肽富集样品
将100μl尿素溶液(6M，100mM Tris缓冲液)加入得到的干燥物Ⅱ-2b中，超声溶解，加入5μl二硫苏糖醇(DTT)(800mM，100mM Tris缓冲液)在60℃温度下水浴1h，加入20μl碘乙酰胺(IAM)(200mM,100mM Tris缓冲液)避光常温放置3.5h，再加入20μl二硫苏糖醇(DTT)(800mM，100mM Tris缓冲液)避光常温放置1h，经SPE脱盐处理，回收30％、70％乙醇-水溶液(含0.2％甲酸)馏分，氮气保护下浓缩至干，得干燥物Ⅲb；将干燥物Ⅱ-1b及干燥物Ⅲb分别用100μl 50％ACN超声溶解，12000rpm离心10min，分别取40μl装入液相小瓶。
实施例3
1、黄芪中多肽类化合物的富集
粉碎干燥黄芪切片0.5kg，加入4L的70％乙醇水溶液，在40℃超声提取两次，每次1h，抽滤一次，得黄芪乙醇提取液和黄芪滤渣；将黄芪提取液浓缩至无醇体积，加入去离子水混悬，按照体积比1:1向混悬液中加入二氯甲烷、得到含二氯甲烷的萃取液和不含二氯甲烷的萃取液；取不含乙酸乙酯的萃取液，按照体积比1:1加入正丁醇，得到含有正丁醇的萃取液和不含正丁醇的萃取液；将含有正丁醇的萃取液进行浓缩至干，所得干燥物Ⅰc；将干燥物Ⅰc用去离子水混悬，按照体积比3:1进行有机试剂(正丁醇：二氯甲烷＝5:1)萃取2次，静置，取中间白色沉淀层，浓缩至干得干燥物Ⅱc；干燥物Ⅱc用50％ACN，离心，取上清液等分成2份(干燥物Ⅱ-1c、干燥物Ⅱ-2c)，氮气保护下浓缩至干燥。
2、烷基化处理黄芪多肽富集样品
将100μl尿素溶液(6M，100mM Tris缓冲液)加入得到的干燥物Ⅱ-2c中，超声溶解，加入5μl二硫苏糖醇(DTT)(800mM，100mM Tris缓冲液)在57℃温度下水浴1h，加入20μl碘乙酰胺(IAM)(200mM,100mM Tris缓冲液)避光常温放置4h，再加入20μl二硫苏糖醇(DTT)(800mM，100mM Tris缓冲液)避光常温放置1h，经SPE脱盐处理，回收30％、70％乙醇-水溶液(含0.2％甲酸)馏分，氮气保护下浓缩至干，得干燥物Ⅲc；将干燥物Ⅱ-1c及干燥物Ⅲc分别用100μl 50％ACN超声溶解，12000rpm离心10min，分别取40μl装入液相小瓶。
对样品采用不同的提取方式，逐步富集黄芪中的多肽，有效地提高了富集的多肽的丰度，结果如图1所示。
实施例4质谱检测
使用Nano-LTQ-LC-MS/MS分析：
Trap柱：设置为等度洗脱，流速2.8μl/min，洗脱流动相组成为A：98％H2O(0.2％FA)，B:2％ACN(0.2％FA)；
Nano柱：设置为梯度洗脱，流速0.3μl/min，洗脱流动相组成为A:98％H2O(0.2％FA)B:2％ACN(0.2％FA)；0-5min，5％B(由1-2阀切换至1-6阀)；5-10min，5～20％B；10-20min，20～35％B；20-45min，35～50％B；45-55min，50～70％B；55-60min，70～90％B；60-70min,90％B(由1-6阀切换至1-2阀)；70-75min,90％～5％B,75-80min，5％B，进样量为5μl；
质谱条件设置：
设置正离子采集模式，一级扫描范围为m/z:350-1500，碎裂模式CID，分辨率为120000；二级扫描范围为50-1500，碎裂模式为HCD，碎裂能量为30V，采集时间点前20个丰度最强多电荷且能够识别的离子，分辨率为60000；采用EST离子源，Orbi-orbi系统。
实施例5 De Novo分析
峰(Peaks)参数设置
无酶解，离子碎裂模式为Mixed，检测系统为orbi-orbi，母离子(单一同位素离子质量)质量偏差为10ppm，子离子质量偏差为0.05Da；ALC(％)≥20；PTMs:Disulfind Bond(-1.01)、Pyro-glu from Q(-17.03)、Pyro-glu from E(-18.01)，从实施例1中浓缩到的样品中筛选得到1194个(包含相同前体蛋白的不同碎片匹配的信息)二硫键多肽。按分子量为2500～4000Da，电荷数2～3进行离子结果筛选，得到27个符合要求的二硫键多肽(表1)，提取其中的二硫键多肽质谱原始数据验证鉴定结果(图2)。
通过实施例2、3得到的样品也同样成功纯化鉴定了黄芪中的二硫键多肽。
表1黄芪中二硫键多肽De Novo鉴定
以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。
序列表
<110> 中国科学院大连化学物理研究所
<120> 一种黄芪中二硫键多肽的纯化和鉴定方法
<130> 201811
<160> 27
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> PRT
<213> Astragalus mongholicus
<400> 1
Cys Trp Trp Phe Phe Ala Gln Thr Phe Asn Asp Glu Arg Arg Arg Arg
1 5 10 15
Leu Cys Tyr Asp Tyr Tyr Phe Trp Lys Trp His
20 25
<210> 2
<211> 28
<212> PRT
<213> Astragalus mongholicus
<400> 2
Val Arg Tyr Tyr Trp Arg Tyr Lys Asp Ser Cys Cys Met Trp Ser Met
1 5 10 15
Cys Cys Cys Val Gln Tyr Arg Arg Arg Trp Arg Gln
20 25
<210> 3
<211> 27
<212> PRT
<213> Astragalus mongholicus
<400> 3
Cys Trp Trp Glu Trp His Leu Val Asp Arg Trp Pro Cys Tyr Asp Phe
1 5 10 15
Glu Trp His His His His Cys Glu Tyr Tyr Cys
20 25
<210> 4
<211> 29
<212> PRT
<213> Astragalus mongholicus
<400> 4
Tyr Lys Asp Arg Gly Gln Met Cys Cys Asp Thr Glu Ser Arg His Thr
1 5 10 15
Arg Leu Lys Asn His Trp Lys Lys Val Arg Arg His Gln
20 25
<210> 5
<211> 26
<212> PRT
<213> Astragalus mongholicus
<400> 5
Trp Arg Arg Gln Leu Arg Arg Trp Met Cys Tyr Val Leu Arg Lys Phe
1 5 10 15
Lys Thr Phe Glu His Leu Thr Glu Trp His
20 25
<210> 6
<211> 27
<212> PRT
<213> Astragalus mongholicus
<400> 6
Phe His Arg Leu Ala His Ala Cys Thr His Cys Phe Phe Trp Cys Glu
1 5 10 15
Glu Trp Cys Cys Trp Tyr Cys Tyr Lys Lys Phe
20 25
<210> 7
<211> 25
<212> PRT
<213> Astragalus mongholicus
<400> 7
Trp Trp Lys Trp Thr Ser Cys Cys His Cys His Ala His Arg Asp His
1 5 10 15
Arg Cys Cys Cys Tyr Trp Trp Trp Phe
20 25
<210> 8
<211> 25
<212> PRT
<213> Astragalus mongholicus
<400> 8
Tyr Glu Trp Tyr Tyr Tyr Arg Tyr Cys Glu Ser Cys Tyr Cys Trp Asp
1 5 10 15
Leu Tyr Tyr Cys Cys His Cys Cys Gln
20 25
<210> 9
<211> 27
<212> PRT
<213> Astragalus mongholicus
<400> 9
Val Trp Lys Ala Lys Cys Cys Cys Met Ser Cys Cys Cys Cys Phe Phe
1 5 10 15
Tyr Cys Asn Cys Thr Arg Met Val Cys Trp Phe
20 25
<210> 10
<211> 24
<212> PRT
<213> Astragalus mongholicus
<400> 10
Tyr Trp Asp Glu His Asp Lys His Thr Glu His Met Asn Tyr Tyr Asp
1 5 10 15
Val Met Cys His Glu Trp Arg His
20
<210> 11
<211> 26
<212> PRT
<213> Astragalus mongholicus
<400> 11
Trp Gln Arg Val Leu Asp Val Lys His Lys Val Trp Thr Leu Val Glu
1 5 10 15
Gly Pro Ser Gly Trp Lys Cys Phe Phe Trp
20 25
<210> 12
<211> 25
<212> PRT
<213> Astragalus mongholicus
<400> 12
Met Glu Pro Lys Leu Met Glu Pro Thr Glu Asp Cys Asn Cys Met Tyr
1 5 10 15
Gln Gln Tyr Met Phe Pro Glu Trp Trp
20 25
<210> 13
<211> 22
<212> PRT
<213> Astragalus mongholicus
<400> 13
Trp Trp Tyr His Arg Trp Val Glu Thr Cys Asn Tyr Met Tyr Asp Trp
1 5 10 15
Gly Gln Trp Tyr Trp His
20
<210> 14
<211> 21
<212> PRT
<213> Astragalus mongholicus
<400> 14
Tyr Asp Tyr Cys Trp Cys Trp Tyr Cys Phe Glu Trp Ser Asn Tyr Trp
1 5 10 15
Cys Trp Trp Trp Trp
20
<210> 15
<211> 22
<212> PRT
<213> Astragalus mongholicus
<400> 15
Phe Leu Trp Trp Lys Asp Gln Trp Ser Pro Arg Trp Glu Asn Tyr Cys
1 5 10 15
Thr Trp Trp Lys Ser Trp
20
<210> 16
<211> 20
<212> PRT
<213> Astragalus mongholicus
<400> 16
Tyr Tyr Trp Tyr Cys Trp Met Trp Trp Cys Met Val Phe Phe Trp Trp
1 5 10 15
Trp Glu Trp Gln
20
<210> 17
<211> 23
<212> PRT
<213> Astragalus mongholicus
<400> 17
Tyr Trp Thr Cys Cys Leu Leu Val Leu Lys Lys Leu Arg Arg Tyr Glu
1 5 10 15
Arg Arg Lys Phe Asn Arg Arg
20
<210> 18
<211> 23
<212> PRT
<213> Astragalus mongholicus
<400> 18
Gln Thr Trp Asn Trp Thr Cys Tyr His Cys Met Glu Tyr Met Trp Cys
1 5 10 15
Tyr Cys Asp His Asp Tyr Cys
20
<210> 19
<211> 24
<212> PRT
<213> Astragalus mongholicus
<400> 19
Tyr Trp Glu Ala Lys Glu Gly Tyr Trp Tyr His Tyr Cys Cys Thr Cys
1 5 10 15
Met Leu Met Ser Trp Glu Thr Val
20
<210> 20
<211> 23
<212> PRT
<213> Astragalus mongholicus
<400> 20
Glu Glu Arg Tyr Tyr Tyr Gln Gln Asp Cys Asn Cys Asn Cys Tyr Cys
1 5 10 15
Phe Phe Trp Leu Lys Trp Val
20
<210> 21
<211> 22
<212> PRT
<213> Astragalus mongholicus
<400> 21
Trp Phe Trp Ala Arg Asn Pro Arg His Tyr Tyr Cys Cys Trp Cys Cys
1 5 10 15
Phe Leu Trp Trp Cys His
20
<210> 22
<211> 22
<212> PRT
<213> Astragalus mongholicus
<400> 22
Met Met Met Arg Arg Asp Tyr Gln Arg Met Thr Lys Met Asp His Tyr
1 5 10 15
Asn Met Cys Trp Trp Phe
20
<210> 23
<211> 24
<212> PRT
<213> Astragalus mongholicus
<400> 23
Tyr Glu Arg His Glu His Met Met Asp Asn Cys Ser Cys His Pro Cys
1 5 10 15
Cys Asp Arg Gln Asn Trp His Asp
20
<210> 24
<211> 22
<212> PRT
<213> Astragalus mongholicus
<400> 24
Trp Glu Pro Val His Glu Val Met Met Tyr Cys Glu Trp Glu Ala Asn
1 5 10 15
Tyr Trp Ser Trp Trp Tyr
20
<210> 25
<211> 24
<212> PRT
<213> Astragalus mongholicus
<400> 25
Leu Trp His Arg Gln Thr His Lys Cys Gln Cys Cys Phe Cys Met Met
1 5 10 15
Cys Phe Phe Asp Ser Lys Asn Met
20
<210> 26
<211> 25
<212> PRT
<213> Astragalus mongholicus
<400> 26
Arg Gln Lys Gly Cys Gln Arg Cys Cys Leu Leu Gln Lys Val Pro Thr
1 5 10 15
Phe Lys Tyr Tyr Ser Pro Trp Gly Gln
20 25
<210> 27
<211> 24
<212> PRT
<213> Astragalus mongholicus
<400> 27
His Asn Asp Glu Cys Tyr Pro Ser Met Met Ser Trp Leu Cys Asp Cys
1 5 10 15
Trp Cys His Cys Trp Phe Asp Cys
20
Claims (10)
1.一种黄芪中二硫键多肽的纯化和/或鉴定方法，其特征在于，所述方法至少包括以下步骤：
a)制备黄芪提取液；
b)向所述黄芪提取液中加入萃取剂A，得到含有萃取剂A的萃取液和不含萃取剂A的萃取液；
c)向所述不含萃取剂A的萃取液中加入醇类萃取剂B，得到含有醇类萃取剂B的萃取液和不含醇类萃取剂B的萃取液；
d)将所述含有醇类萃取剂B的萃取液浓缩制得干燥物I,然后使所述干燥物I中与混合萃取液C接触，将所得沉淀物浓缩制得干燥物II；
e)将所述干燥物II分成两等份干燥物II-1和干燥物II-2；
f)将溶解有所述干燥物II-2的尿素溶液与二硫苏糖醇混合反应，制得前驱体1；
g)将所述前驱体1与碘乙酰胺接触，进行烷基化反应得到前驱体2；
h)向所述前驱体2中加入二硫苏糖醇，反应结束后除盐并进行干燥，得到干燥物III；
i)采用质谱技术对所述干燥物II-1和所述干燥物III进行多肽检测分析。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述干燥物II-1的质谱数据用作所述干燥物III的二硫键的烷基化多肽质谱数据的内在对照。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述萃取剂A选自乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷中的至少一种；
所述醇类萃取剂B为正丁醇；
所述混合萃取液C由正丁醇和二氯甲烷或氯仿组成。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述萃取剂A与所述黄芪提取液的体积比为1:1；
所述醇类萃取剂B与所述不含萃取剂A的萃取液的体积比为1:1；
所述混合萃取液C中的醇类萃取剂与二氯甲烷的体积为：3～5:1。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合萃取液C与所述干燥物I的溶液的体积比为1:4。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤f)中，溶解有所述干燥物II-2的尿素溶液与二硫苏糖醇混合反应在50～60℃下进行0.5～1.5小时；
优选地，步骤f)中，所述溶解有所述干燥物II-2的尿素溶液与二硫苏糖醇混合反应在水浴条件下进行。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤g)中，所述前驱体1与碘乙酰胺接触反应在常温下进行3～5小时。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤h)中，所述前驱体2中加入二硫苏糖醇，反应在常温下进行0.5～1.5小时。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述黄芪提取液是固体黄芪样品的乙醇-水溶液；
优选地，乙醇在所述乙醇-水溶液中的体积比为70％。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质谱技术包括Nano-LTQ-OrbitrapLC-MS/MS或Q-TOF LC-MS/MS中至少一种；
优选地，所述质谱技术是Nano-LTQ-Orbitrap LC-MS/MS；
优选地，所述Nano-LTQ-Orbitrap LC-MS/MS至少包括以下步骤：
使用Trap柱进行等度洗脱，其中洗脱流动相由85％～98％H2O的A相和2％～15％乙腈的B相组成，流速2.5～3.2μl/分钟；
使用Nano柱进行梯度洗脱，其中流速0.25～0.3μl/分钟，其中洗脱流动相由85％～98％H2O的A相和2％～15％乙腈的B相组成；之后依次进行：5％B洗脱0-5分钟，5～20％B洗脱5-10分钟，20～35％B洗脱10-20分钟，35～50％B洗脱20-45分钟，50～70％B洗脱45-55分钟，70～90％B洗脱55-60分钟，90％B洗脱60-70分钟，90％～5％B洗脱70-75分钟,5％B洗脱75-80钟，优选地，进样量为5μl。
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2018
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