CN111217870A - 一种黄原胶寡糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黄原胶寡糖的制备方法,属于生物技术领域。本发明包括如下步骤:(1)配制黄原胶终浓度为1%的黄原胶‑酸溶液;(2)将离子液体加入到步骤(1)所得黄原胶溶液中,搅拌至黄原胶溶解,所得溶液中离子液体的终浓度为1mg/mL‑50mg/mL,将所得溶液在搅拌状态下进行反应;(3)反应完成后,将溶液pH调节至中性,而后过滤、滤液透析;透析结束后,进行冻干即可得到黄原胶寡糖。通过本发明的方法可制备出高活性的黄原胶寡糖,同时还提高了寡糖的产率,为黄原胶寡糖的工业化生产以及应用打下基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种黄原胶寡糖的制备方法,属于生物技术领域。
背景技术
黄原胶寡糖是一种由黄原胶降解得到的新型寡糖,通过发明发现其具有抗氧化、体外清除自由基、抑制某些真菌以及野油菜黄单胞菌生长、防止小鼠红细胞发生溶血等功能。
目前制备黄原胶寡糖的方法有物理法、化学法、生物法。物理法因其对设备要求高、反应条件剧烈、降解无规律、寡糖活性低,使得高活性黄原胶寡糖的获得受到限制。生物法是比较温和的制备方法,其降解产物可控,但是由于目前没有十分有效的酶,得到的寡糖分子量大、活性差、产率低。这不能够满足我们对于黄原胶寡糖的要求。化学法是目前主要的应用方法,主要分为酸氧化法与碱法氧化。碱氧化法制备的寡糖活性较高,但是产率很低。而酸氧化法得到了大量的葡萄糖和大分子量的黄原胶,这说明黄原胶本身的结构限制了寡糖的制备。因此寡糖的活性较差,产率也不高。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明目的在于提供一种黄原胶寡糖的新型制备方法。
本发明应用了离子液辅助酸氧化法高效的制备了黄原胶寡糖,优化了反应条件,表征了产物活性,证明了离子液体可以高效降解黄原胶制备黄原胶寡糖。本发明应用离子液体使黄原胶的结构被打开,从而制备出了活性高的黄原胶寡糖,同时产率也被提高,为黄原胶寡糖的工业生产提供理论依据,也为今后的应用打下基础。
本发明提供了一种黄原胶寡糖的制备方法,包括如下步骤:
一种黄原胶寡糖的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)将黄原胶溶于0.01M-1M的酸溶液中,配制成黄原胶终浓度为0.1mg/mL-15mg/mL的黄原胶溶液;
(2)将离子液体加入到步骤(1)所得黄原胶溶液中,搅拌至黄原胶溶解,所得溶液中离子液体的终浓度为1mg/mL-50mg/mL;然后加入H2O2溶液,并使H2O2的终浓度为0.01M-1M,然后于一定条件下反应;
(3)反应完成后,将溶液pH调节至中性,而后过滤、滤液透析;透析结束后,进行冻干即可得到黄原胶寡糖。
进一步地,上述技术方案中,所述步骤(1)中的酸溶液包括盐酸、硝酸、醋酸、硫酸、磷酸、草酸。
进一步地,上述技术方案中,所述步骤(2)中的离子液体包括咪唑类离子液体、吡啶类离子液体、季铵类离子液体、季鏻类离子液体、吡咯烷类离子液体、哌啶类离子液体、以及功能化离子液体。
进一步地,上述技术方案中,所述咪唑类离子液体包括氯化1-丁基-3-甲基咪唑。
进一步地,上述技术方案中,所述功能化离子液体为包含羟基、羧基、醚基、酯基、氨基、磺酸基、烯基、苄基、腈基或胍类官能团的离子液体。
进一步地,上述技术方案中,所述步骤(2)中的搅拌至黄原胶溶解的条件为50℃-150℃下搅拌1-7d。
进一步地,上述技术方案中,所述步骤(3)中透析的时间为1h-120h。
进一步地,上述技术方案中,所述步骤(2)加入H2O2溶液后,于50℃-150℃下反应1-7d。
进一步地,上述技术方案中,所述步骤(3)中冻干的时间为12h-72h。
发明有益效果
本研究是在现有的化学法降解黄原胶制备黄原胶寡糖的基础上引入了离子液体。目前化学法制备黄原胶寡糖的方法存在着降解不完全、反应时间长、产物活性差、产率低等缺陷。通过将离子液体引入反应体系,可制备出高活性的黄原胶寡糖(羟基自由基清除活性IC50=1.19mg/mL;而现有技术最低的IC50=2.5mg/mL),同时还提高了寡糖的产率,DE值最高为32.40%(现有技术不到10%),为黄原胶寡糖的工业化生产以及应用打下基础。
附图说明
图1 DNS标准曲线。
图2实施例1制备的黄原胶寡糖的羟基自由基清除率。
具体实施方式
下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明,但不以任何方式限制本发明。
本发明实施例所用黄原胶为spectrum所生产,离子液体[Bmim]Cl(氯化1-丁基-3-甲基咪唑)购买于上海笛柏生物科技有限公司。
实施例1
称取1g黄原胶溶于0.01M-1M的HCL溶液中,黄原胶终浓度为10mg/mL。称取[Bmim]Cl并将其加入反应体系中,充分搅拌使离子液体溶解,离子液体的终浓度为10mg/mL,而后加入H2O2溶液使H2O2终浓度为0.25M。混匀后将其置在80℃下反应4d。完成后将溶液的pH调节回中性,而后过滤、滤液用3500Da透析袋透析72h。透析结束后,进行冻干48h即可得到黄原胶寡糖。对得到的黄原胶寡糖进行DE值与羟基自由基清除率的测定。
DNS溶液配置:称取DNS(3,5-二硝基水杨酸)6.3g加入500mL水中,水浴45℃。逐步加入氢氧化钠溶液,同时不断搅拌,直到溶液清澈透明;(a.将21g氢氧化钠溶解在200mL水中;b.加入氢氧化钠溶液时,溶液的温度会上升,所以要慢慢加,不停地搅拌,同时溶液的温度不能超过48℃;温度高了,溶液颜色变黑)。逐步加入182g四水酒石酸钾钠、5g苯酚和5g无水亚硫酸钠。继续45℃水浴,同时补水,不断搅拌,直到加入的物质完全溶解。停止加热,冷却至室温,用水定容至1000mL。在棕色瓶中,避光保存。室温下存放7天后使用。
DE值的测定方法:将葡萄糖放在110℃烘箱中烘干直至恒重。而后分别配置0.1-1mg/mL共10个浓度的葡萄糖标准溶液(见表1),之后将200μL葡萄糖溶液与200μL DNS溶液混合,震荡摇匀,制作3组平行样。煮沸5min后,放在冰水中冷却,然后每管吸取200μL反应液于96孔板中,在OD 540nm测量吸光度。根据葡萄糖浓度与吸光度数值作出标准曲线见图1。而后将得到的黄原胶寡糖干粉配置成1mg/mL的溶液,而后同样将200μL黄原胶寡糖溶液与200μL DNS溶液混合,后面步骤同上,得到吸光值,最终代入标准曲线测出还原糖含量。
则DE=(还原糖含量×黄原胶寡糖的质量)/黄原胶质量×100%。
测得还原糖含量=2.430mg/mL,DE=32.40%(DE值与还原糖含量越高越好)
结论:得到的寡糖还原糖含量很高,DE值很高。
表1葡萄糖标准溶液的配置
羟基自由基清除率测定方法:按如下配方配制溶液:0.5mL 0.2M pH 7.5磷酸盐缓冲液,0.1mL 0.52mg/mL番红和0.5mL 2M的EDTANa2-Fe2+,向上述溶液中分别加入0.5mL不同浓度的黄原胶寡糖溶液(0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL),分别用水补至4.9mL,最后分别加入0.1mL 1%H2O2溶液,混匀后于40℃水浴保温30min在波长520nm处测量吸光度,空白组以等体积的纯水代替黄原胶寡糖溶液,对照组则以纯水代替黄原胶寡糖溶液和EDTANa2-Fe2+溶液,结果以清除率表示。
清除率=(OD样品-OD空白)/(OD对照-OD空白)×100%。
结果用半清除浓度(IC50)表示,即当清除率达到50%时所需寡糖含量。(IC50越高越好)
测得羟基自由基IC50=1.19mg/mL(见图2)
结论:可以看出离子液体辅助盐酸氧化制备的黄原胶寡糖的还原糖含量很高,并且DE值远高于现有技术(现有技术不到10%),并且IC50远低于现有技术(现有技术中的最少为2.50mg/mL)。
实施例2
称取黄原胶溶于1M的醋酸溶液中,黄原胶终浓度为0.1mg/mL。称取[Bmim]Cl并将其加入反应体系中,充分搅拌使离子液体溶解,离子液体的终浓度为1mg/mL,而后加入H2O2溶液使H2O2终浓度为0.01M。混匀后将其置在50℃下反应7d。完成后将溶液的pH调节回中性,而后过滤、滤液用3500Da透析袋透析1h。透析结束后,进行冻干12h即可得到黄原胶寡糖。
实施例3
称取黄原胶溶于0.01M的硫酸溶液中,黄原胶终浓度为15mg/mL。称取[Bmim]Cl并将其加入反应体系中,充分搅拌使离子液体溶解,离子液体的终浓度为50mg/mL,而后加入H2O2溶液使H2O2终浓度为1M。混匀后将其置在100℃下反应1d。完成后将溶液的pH调节回中性,而后过滤、滤液用3500Da透析袋透析120h。透析结束后,进行冻干72h即可得到黄原胶寡糖。
对比例1
称取1g黄原胶溶于0.01M-1M的HCL溶液中,黄原胶终浓度为10mg/mL。而后加入H2O2溶液使H2O2终浓度为0.25M。混匀后将其置在80℃下反应4d。完成后将溶液的pH调节回中性,而后过滤、滤液用3500Da透析袋透析72h。透析结束后,进行冻干48h即可得到黄原胶寡糖。对得到的黄原胶寡糖进行DE值与羟基自由基清除率的测定。测定方法同实施例1。
测得还原糖含量=2.07mg/mL,DE=27.61%
测得羟基自由基IC50值高于于实施例1。
结论:得到的寡糖还原糖与DE值不如实施例1,并且羟基自由基IC50也没有实施例1低。
如表2所示,为实施例1以及对比例1所制备的寡糖的还原糖及DE值。从表中可知,本发明通过离子液辅助酸氧化法制备的黄原胶寡糖,还原糖含量与DE值均高于未加入离子液体的对比例,因此说明离子液体打开了黄原胶的结构,从而促进了黄原胶的溶解,使得降解更加完全,生成了更多的寡糖。本发明有效的提高了产率以及寡糖的活性,并且缩短了反应时间。
表2实施例以及对比例所制备的寡糖的还原糖及DE值
Claims (9)
1.一种黄原胶寡糖的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)将黄原胶溶于0.01M-1M的酸溶液中,配制成黄原胶终浓度为0.1mg/mL-15mg/mL的黄原胶溶液;
(2)将离子液体加入到步骤(1)所得黄原胶溶液中,搅拌至黄原胶溶解,所得溶液中离子液体的终浓度为1mg/mL-50mg/mL;然后加入H2O2溶液,并使H2O2的终浓度为0.01M-1M,然后于一定条件下反应;
(3)反应完成后,将溶液pH调节至中性,而后过滤、滤液透析;透析结束后,冻干,即可得到黄原胶寡糖。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中的酸溶液包括盐酸、硝酸、醋酸、硫酸、磷酸、草酸。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中的离子液体包括咪唑类离子液体、吡啶类离子液体、季铵类离子液体、季鏻类离子液体、吡咯烷类离子液体、哌啶类离子液体、以及功能化离子液体。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述咪唑类离子液体包括氯化1-丁基-3-甲基咪唑。
5.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述功能化离子液体为包含羟基、羧基、醚基、酯基、氨基、磺酸基、烯基、苄基、腈基或胍类官能团的离子液体。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中的搅拌至黄原胶溶解的条件为50℃-150℃下搅拌1-7d。
7.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(3)中透析的时间为1h-120h。
8.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)加入H2O2溶液后,于50℃-150℃下反应1-7d。
9.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(3)中冻干的时间为12h-72h。
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