CN115232227A - 一种高效制备单一分子量黄原胶寡糖的方法 - Google Patents
一种高效制备单一分子量黄原胶寡糖的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115232227A CN115232227A CN202211014287.4A CN202211014287A CN115232227A CN 115232227 A CN115232227 A CN 115232227A CN 202211014287 A CN202211014287 A CN 202211014287A CN 115232227 A CN115232227 A CN 115232227A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- xanthan gum
- oligosaccharide
- sample
- molecular weight
- gum oligosaccharide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 title claims abstract description 127
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 title claims abstract description 116
- 229920001285 xanthan gum Polymers 0.000 title claims abstract description 105
- 239000000230 xanthan gum Substances 0.000 title claims abstract description 93
- 229940082509 xanthan gum Drugs 0.000 title claims abstract description 93
- 235000010493 xanthan gum Nutrition 0.000 title claims abstract description 93
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 33
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 29
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000001474 liquid chromatography-evaporative light scattering detection Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 31
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 17
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 claims description 15
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 claims description 15
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 claims description 15
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 12
- -1 xanthan oligosaccharides Chemical class 0.000 claims description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 9
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 9
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims description 9
- 238000000105 evaporative light scattering detection Methods 0.000 claims description 8
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000004252 FT/ICR mass spectrometry Methods 0.000 claims description 7
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 7
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 6
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 5
- 239000000945 filler Substances 0.000 claims description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 5
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 claims description 4
- 238000002013 hydrophilic interaction chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 claims description 4
- 230000002000 scavenging effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 claims description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 3
- 239000002608 ionic liquid Substances 0.000 claims description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 2
- AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N D-glucopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N 0.000 claims 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 claims 1
- HHEAADYXPMHMCT-UHFFFAOYSA-N dpph Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC([N+](=O)[O-])=CC([N+]([O-])=O)=C1[N]N(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 HHEAADYXPMHMCT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims 1
- 239000000337 buffer salt Substances 0.000 abstract description 5
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 abstract description 5
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 abstract description 5
- 230000004907 flux Effects 0.000 abstract description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 abstract 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 abstract 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 14
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 6
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 4
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 4
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 4
- IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N aldehydo-D-glucuronic acid Chemical compound O=C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N 0.000 description 3
- 150000001408 amides Chemical group 0.000 description 3
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 3
- PLWSZOQYWKLNIL-UHFFFAOYSA-N 1-butyl-2-chloro-3-methyl-2h-imidazole Chemical compound CCCCN1C=CN(C)C1Cl PLWSZOQYWKLNIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002292 Radical scavenging effect Effects 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000218 acetic acid group Chemical group C(C)(=O)* 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- MGJZITXUQXWAKY-UHFFFAOYSA-N diphenyl-(2,4,6-trinitrophenyl)iminoazanium Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC([N+](=O)[O-])=CC([N+]([O-])=O)=C1N=[N+](C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 MGJZITXUQXWAKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007760 free radical scavenging Effects 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- GJCOSYZMQJWQCA-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthene Chemical compound C1=CC=C2CC3=CC=CC=C3OC2=C1 GJCOSYZMQJWQCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000394635 Acetomicrobium mobile Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical group CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000005575 aldol reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 229910001410 inorganic ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical group 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010525 oxidative degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 125000005372 silanol group Chemical group 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- XGPOMXSYOKFBHS-UHFFFAOYSA-M sodium;trifluoromethanesulfonate Chemical compound [Na+].[O-]S(=O)(=O)C(F)(F)F XGPOMXSYOKFBHS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
- C08B37/0024—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Glucans; (beta-1,3)-D-Glucans, e.g. paramylon, coriolan, sclerotan, pachyman, callose, scleroglucan, schizophyllan, laminaran, lentinan or curdlan; (beta-1,6)-D-Glucans, e.g. pustulan; (beta-1,4)-D-Glucans; (beta-1,3)(beta-1,4)-D-Glucans, e.g. lichenan; Derivatives thereof
- C08B37/0033—Xanthan, i.e. D-glucose, D-mannose and D-glucuronic acid units, saubstituted with acetate and pyruvate, with a main chain of (beta-1,4)-D-glucose units; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
- C07H1/06—Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H3/00—Compounds containing only hydrogen atoms and saccharide radicals having only carbon, hydrogen, and oxygen atoms
- C07H3/06—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0003—General processes for their isolation or fractionation, e.g. purification or extraction from biomass
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/54—Improvements relating to the production of bulk chemicals using solvents, e.g. supercritical solvents or ionic liquids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
本发明公开了一种高效制备单一分子量黄原胶寡糖的方法，包括降解黄原胶得到黄原胶寡糖混合物；使用亲水作用色谱柱对黄原胶寡糖混合物进行分离纯化；利用高效液相色谱‑蒸发光散射检测器，通过对缓冲盐和pH、柱温、进样量、流速等进行优化，并通过线性放大技术确定了分离纯化条件：XAmide(10×250mm，5μm)，25℃，流速4mL/min，进样40mg等，梯度洗脱进行收集黄原胶寡糖。寡糖样品在色谱柱上得到基线分离，有效解决了离子交换色谱和尺寸排阻色谱选择性不足的问题；该方法分辨率高，重复性好，纯度高，整个分离过程简单、快速，易于实现高通量，利于规模化；所制得黄原胶寡糖具备抗氧化活性，具备广泛的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于黄原胶寡糖分离纯化技术领域，具体涉及一种高效制备单一分子量黄原胶寡糖的方法。
背景技术
黄原胶寡糖是一种通过降解黄原胶产生的聚合度在2-20之间的新型寡糖产品，其理论结构是由五糖单元重复构成，具有类似纤维素的一级结构，以β-1，4糖苷键相连的葡萄糖构成，三个相连的单糖组成其侧链：甘露糖→葡萄糖醛酸→甘露糖。与主链相连的甘露糖通常由乙酰基修饰，侧链末端的甘露糖与丙酮酸发生缩醛反应从而被修饰。黄原胶寡糖因其独特的分子结构和理化性质而具有良好的生理活性，包括清除羟基自由基、氧自由基、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基等活性，还具有抑制黑腐病致病菌活性、抗氧化活性及较强的植物诱抗活性，从而使其具有十分广阔的商业应用前景。
目前黄原胶寡糖主要是通过黄原胶氧化降解或者酶解技术得到，然而这些技术制备的黄原胶寡糖是非常复杂的混合物，其中含有多种不同聚合度和取代基。而大部分黄原胶寡糖的生物活性都是采用这些混合物进行实验，这很难确定具体是哪个或哪些黄原胶寡糖分子在生物活性实验中起作用。因此，为了进一步研究黄原胶寡糖的生物活性，从黄原胶寡糖混合物中分离得到具有单一聚合度和取代基种类的黄原胶寡糖是十分必要的。
目前的分离技术对单一聚合度的寡糖的分辨率很低，规模化应用仍然存在困难，其瓶颈因素主要在于寡糖的分离纯化方法。黄原胶是具有复杂支链结构的杂多糖，经过裂解后可产生大小、组分及结构不同的黄原胶寡糖，属于复杂且异质的分子。较为常用的寡糖制备方法包括以下三种：尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法和薄层色谱法。尺寸排阻色谱法也称空间排阻色谱或凝胶渗透色谱法，是一种根据样品分子的尺寸差异进行分离的色谱技术，多用于生物大分子分离。但该方法选择性相对较差，较难分离具有相同聚合度的钙糖样品。离子交换色谱法是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。它不仅适用于无机离子混合物的分离，也可用于糖类、氨基酸、核酸和蛋白质等大分子，应用范围较广。但离子交换色谱依据的是样品所带电荷的差异，在分离带有相同电荷的寡糖时会遇到一定问题，不易达到极限分离。薄层色谱法又称为薄层层析，是快速分离物质的一种很重要的技术，属于固液吸附色谱。该技术也可用于制备复杂样品中的寡糖，但该方法操作相对繁琐，溶剂用量大，不易实现自动化。此外，寡糖类成分物易被紫外吸收，常见的紫外检测器不能对其进行检测，因此在纯化过程中难以对黄原胶寡糖进行跟踪检测。针对现有黄原胶寡糖制备方法存在的分子量高、含量低、分散度高等问题，函需寻找一种分子量分布窄、含量高的黄原胶寡糖分离纯化方法。
发明内容
为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明针对目前分离技术对单一分子量寡糖的分辨率低，规模化应用存在困难等缺点；提供了一种高效制备单一分子量黄原胶寡糖的方法，使分离过程简单、快速，易于实现高通量、高选择性。
为实现上述发明目的，本发明提供了一种高效制备单一分子量黄原胶寡糖的方法，包括如下步骤：
①降解黄原胶得到黄原胶寡糖混合物。
②配制寡糖混合物样品溶液：取步骤①获得的100mg寡糖混合物样品溶于1mL纯水中，经过0.22um滤膜过滤；
③亲水作用色谱对黄原胶寡糖混合物进行分离纯化：采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器HPLC-ELSD，使用极性填料作为色谱固定相，通过线性放大技术确定对黄原胶寡糖混合物分离纯化条件为：尺寸规格10×250mm的色谱柱XAmide，在25℃，流速4mL/min，进样40mg，梯度洗脱条件下进行收集黄原胶寡糖；所述黄原胶寡糖样品XGOS-Fr1、XGOS-Fr2和XGOS-Fr3的收集时间分别为15-17min、18-19min和20.5-21min；所述梯度洗脱中的洗脱剂A相为80％乙腈-10mM乙酸铵，B相为10mM乙酸铵，上述乙酸铵溶液的pH值为6.4；
④根据步骤③确定的收集时间收集馏分，经过多次进样，合并、浓缩，冻干得到黄原胶寡糖样品。
步骤①中所述黄原胶寡糖混合物的制备包括，将5g黄原胶溶于500mL浓度为0.4mol/L的盐酸溶液中，将2.5g离子液体氯化-1-丁基-3-甲基咪唑加入反应体系中，充分搅拌使黄原胶溶解，最后加入12.5mL浓度为30g/ml的H2O2；将上述反应体系置于80℃的水浴锅中反应4d后取出；利用4M NaOH将溶液中的pH调节至中性，而后将其放入截留分子量3500Da的多孔透析袋中，并将透析袋放入纯水中进行透析，透析结束后冻干得到黄原胶寡糖混合物样品。
步骤②中所述色谱柱XAmide为中性酰胺键合相；所述色谱柱XAmide的填料粒径为5μm。XAmide色谱柱的中性酰胺键合相结构独特，亲水性突出，而且避免了纯硅胶表面硅醇基的酸性和不均一性。使用高比例乙腈做流动相可以保留在传统的反相色谱柱上很难保留的强极性化合物。XAmide克服了常用的氨基柱和硅胶柱使用过程中静电作用的影响，适用于不同类型的强极性化合物——酸性、碱性和中性化合物，在XAmide上均能获得良好的峰形与分离度。
步骤④获得的黄原胶寡糖的分离组分经过质谱法FT-ICR-MS进行结构解析，确定寡糖组分聚合度为2-4，没有侧链基团修饰，均带有葡萄糖醛酸；并对所述黄原胶寡糖清除自由基DPPH能力进行生物活性表征。
一种单一分子量黄原胶寡糖，由所述的高效制备单一分子量黄原胶寡糖的方法制成；所述的单一分子量黄原胶寡糖在清除自由基活性、抑制黑腐病致病菌活性、抗氧化活性及植物诱抗活性中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
①高选择性：针对当前黄原胶寡糖制备遇到的问题，本发明提出使用亲水作用色谱方法制备单一分子量的黄原胶寡糖。寡糖样品在色谱柱上得到基线分离，有效解决了离子交换色谱和尺寸排阻色谱选择性不足的问题。
②高通量：本发明具有分辨率高、分离步骤少，只经过一步分离就能够得到纯的单一分子量黄原胶寡糖，整个分离过程简单、快速，易于实现高通量。
③本发明所制得黄原胶寡糖具备抗氧化活性，具备广泛的潜在应用价值。
附图说明
图1为HPLC-ELSD分析黄原胶寡糖混合物色谱图；
图2为缓冲盐种类(A为甲酸铵，B为乙酸铵)对黄原胶寡糖XGOS分离效果的影响；
图3为流动相pH值(A的pH值为2.6，B的pH值为3.2，C的pH值为6.4，D的pH值为7.6)对黄原胶寡糖XGOS分离效果的影响；
图4为单一分子量黄原胶寡糖(A为样品XGOS-Fr1，B为样品XGOS-Fr2，C为样品XGOS-Fr3)的组分高效液相色谱纯度验证结果；
图5为黄原胶寡糖组分Fr1-Fr3在负离子模式下的FT-ICR-MS一级质谱图；
图6为黄原胶寡糖组分Fr1-Fr3在正离子模式下的FT-ICR-MS一级质谱图；
图7为Fr1-Fr3的DPPH自由基清除活性测定结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不以任何方式限制本发明。黄原胶购于淄博中选生物有限公司；其他助剂均为市购。
黄原胶寡糖的液相色谱检测方法：仪器选用安捷伦科技有限公司生产的高效液相色谱仪LC1260-ELSD(G4260B)；ELSD检测器：漂移管温度80℃，雾化器温度60℃，流量：1.60SLM，LED强度：100％；色谱柱：Acchrom-XAmide(4.6×250mm，5μm)；流动相：A相纯水，B相100mmol/L甲酸铵(pH 3.2)，C相乙腈；流速：1mL/min，柱温：35℃；黄原胶寡糖样品浓度：2mg/mL；进样量：20μL：采用梯度分析条件分析寡糖，具体如表1所示：
表1HPLC-ELSD分析黄原胶寡糖洗脱剂梯度变化条件
分离纯化产物的质谱检测方法：将黄原胶寡糖XGOS进行真空干燥，配制寡糖样品溶液：1mg寡糖样品溶于1mL纯水中，经过0.22μm过滤处理：采集模式：正/负离子模式；在ESI源中提供了正负电离模式的光谱剖面。通过注射器直接注入上清液，流速为2.0μL/min；优化参数如下：雾化器气体压力为1.0bar，干燥气体流速为4.0L/min，温度为200℃，离子累积时间为0.2s，飞行时间为1s，毛细管电压为4.5kV。在质量范围为92–2000m/z的4M数据点(在m/z 400处分辨率为240000)下获得光谱，并对64个瞬态进行平均，以便进行傅里叶变换以获得一个质谱。采用线性校准模式，通过三氟甲酸钠溶液对质谱进行外部校准。
实施例
一种高效制备单一分子量黄原胶寡糖的方法，所述方法包括如下步骤：
①降解黄原胶得到黄原胶寡糖混合物，HPLC-ELSD分析黄原胶寡糖混合物色谱图见图1。
②配制寡糖混合物样品溶液：取步骤①获得的100mg寡糖混合物样品溶于1mL纯水中，经过0.22um滤膜过滤。
③亲水作用色谱对黄原胶寡糖混合物进行分离纯化：采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器HPLC-ELSD，使用极性填料作为色谱固定相，通过线性放大技术确定对黄原胶寡糖混合物分离纯化条件为：尺寸规格10×250mm的色谱柱Acchrom-XAmide，在25℃，流速4mL/min，进样40mg，梯度洗脱条件下进行收集黄原胶寡糖；所述黄原胶寡糖样品XGOS-Fr1、XGOS-Fr2和XGOS-Fr3的收集时间分别为15-17min、18-19min和20.5-21min；所述梯度洗脱中的洗脱剂A相为80％乙腈-10mM乙酸铵，B相为10mM乙酸铵，上述乙酸铵溶液的pH值为6.4。
④根据步骤③确定的收集时间收集馏分，经过多次进样，合并、浓缩，冻干得到的黄原胶寡糖样品。
步骤①中所述黄原胶寡糖混合物的制备包括，将5g黄原胶溶于500mL浓度为0.4mol/L的盐酸溶液中，将2.5g离子液体氯化-1-丁基-3-甲基咪唑加入反应体系中，充分搅拌使黄原胶溶解，最后加入12.5mL浓度为30g/ml的H2O2；将上述反应体系置于80℃的水浴锅中反应4d后取出；利用4M NaOH将溶液中的pH调节至中性，而后将其放入截留分子量3500Da的多孔透析袋中，并将透析袋放入纯水中进行透析，透析结束后冻干得到黄原胶寡糖混合物样品。
步骤②中所述色谱柱Acchrom-XAmide为中性酰胺键合相；所述色谱柱Acchrom-XAmide的填料粒径为5μm。
高效制备单一分子量黄原胶寡糖方法的技术条件的优化过程如下：
a.流动相缓冲盐和pH的优化：添加两种缓冲盐的分析结果如图2所示，可以看出在相同pH下，甲酸铵和乙酸铵的分离效果基本一致，且都为挥发性盐，都可经过反复冻干去除，因此这里主要考虑了后续制备的经济效益，为了节约后续分离制备的成本，选择成本较低的乙酸铵作为流动相的缓冲盐。不同的缓冲液pH的分析结果如图3所示，从图中可看出，较高的pH可以减少黄原胶寡糖的保留时间，而对于15-30min的寡糖的分离效果几乎没有影响，所以分离制备选择了pH6.4(乙酸铵溶液的初始pH)，以减少缓冲液配置步骤，简化制备方法。
b.通过线性放大技术将上述已优化的分离条件进行放大，最终确定了分离制备的条件：由于已优化的条件是利用分析柱XAmide(250×4.6mm,5μm)上得到的，而分离制备时用到的色谱柱为半制备柱XAmide(250×10mm，5μm)，因此采用了线性放大技术用于将色谱条件的流速和上样量从分析规模转换为制备规模，调整后流速＝0.8×(102/4.62)＝3.7mL/min；调整后上样量＝100×(102/4.62)＝472.6μL。根据计算的流速和上样量，为了节省流动相和提高制备效率，将流速调整为4.0mL/min，实际单针进样量提高到400μL，样品浓度提高到100mg/mL，即单针进样40mg，如表2所示。
表2黄原胶寡糖分离制备条件
梯度洗脱条件下进行收集黄原胶寡糖，所述洗脱剂为A相：80％乙腈-10mM乙酸铵(pH6.4)，B相：10mM乙酸铵(pH6.4)，具体的梯度变化条件如表3所示。
表3黄原胶寡糖的分离制备洗脱程序
黄原胶寡糖XGOS-Fr1、XGOS-Fr2和XGOS-Fr3的收集时间分别为15-17min、18-19min和20.5-21min。并对通过半制备色谱分离制备得到的上述三种单一分子量的寡糖XGOS-Fr1、XGOS-Fr2和XGOS-Fr3，根据确定好的收集时间收集馏分，经过多次进样，合并、浓缩，冻干得到的寡糖样品。
c.制备重复性和纯度验证：分离制备重复三次，收集对应时间的组分，接着用分析型XAmide色谱柱分析，记录三个色谱峰保留时间和峰面积并计算相对标准偏差RSD。结果表明三个主要色谱峰相对保留时间RSD范围是0.1％-1.3％，相对峰面积RSD范围是0.8％-11.5％，表明方法重复性良好，详见表4。
表4制备重复性考察
通过有效进样27次，共制备XGOS-Fr1、XGOS-Fr2和XGOS-Fr3分别93.4mg，37.2mg，51.7mg，总得率24.6％。冻干得到的寡糖样品使用分析型XAmide色谱柱检验纯度，共得到3个纯度大于90％的寡糖，其中Fr1和Fr3的纯度大于98％，分析结果如图4所示，各组分的纯度和得率信息见表5。
表5黄原胶寡糖不同组分的纯度和得率
d.黄原胶寡糖组分的质谱分析：FT-ICR-MS在正/负离子两种模式下对三种寡糖XGOS-Fr1、XGOS-Fr2和XGOS-Fr3进行质谱分析。首先在负离子模式下对黄原胶寡糖分离纯化组分进行表征，黄原胶寡糖Fr1-Fr3的负离子模式下容易产生[M-H]-离子，少部分产生[2M-H]-，其一级质谱分析结果如图5所示。在负离子模式下，Fr1-Fr3形成了稳定的[M-H]-离子峰和少部分[2M-H]-离子峰，Fr1的m/z为355、711，Fr2的m/z为517、1035，Fr3的m/z为：679、1359。Fr1-Fr3分子量分别为356、518和680，为聚合度(DP)2-4，不被乙酰基或丙酮酸基团修饰，是包含一份子葡萄糖醛酸的酸性寡糖。寡糖在正离子模式下，易产生[M+H]+、[M+NH4]+、[M+K]+、[M+Na]+离子，少部分产生[2M+H]+、[2M+NH4]+、[2M+K]+、[2M+Na]+等离子，其一级质谱分析结果如图6所示。在正离子模式下，Fr1形成的离子有[M+NH4]+、[2M+Na]+、[3M+Na]+和[4M+Na]+，对应的m/z分别为374、735、1091和1447；Fr2形成的离子有[M+NH4]+和[2M+NH4]+，对应的m/z为536、1054；Fr3形成的离子有[M+NH4]+和[2M+NH4]+，对应的m/z为698和1378；Fr1-Fr3分子量分别为356、518和680，与负离子模式下的分析结果一致。黄原胶寡糖组分Fr1-Fr3的FT-ICR-MS一级质谱数据总结见表6。
表6黄原胶寡糖组分Fr1-Fr3的FT-ICR-MS一级质谱数据总结
e.黄原胶寡糖的生物活性表征
黄原胶寡糖清除DPPH自由基测定：首先对上述分离得到的3种寡糖组分XGOS-Fr1、XGOS-Fr2和XGOS-Fr3进行DPPH自由基清除能力的测定，结果如图7所示。3种寡糖的DPPH清除活性具有浓度依赖性，Fr2和Fr3的IC50(半抑制浓度)分别为3.89mg/mL和1.86mg/mL，而Fr1和原始黄原胶寡糖XGOS，在实验条件下未检测到IC50值，对比未分离纯化的黄原胶寡糖XGOS，其在5mg/mL的浓度下的清除活性为45％，而Fr1、Fr2和Fr3分别为36％、54％和83％，可见纯化后的寡糖组分Fr3的DPPH清除活性有显著提高，这是由于经过了系统的分离纯化，寡糖组分的活性成分含量增加，3种寡糖组分的DPPH自由基清除活性随着寡糖聚合度的增加而提高。
对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。
Claims (6)
1.一种制备单一分子量黄原胶寡糖的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
①降解黄原胶得到黄原胶寡糖混合物；
②配制寡糖混合物样品溶液：取步骤①获得的100mg寡糖混合物样品溶于1mL纯水中，经过0.22μm滤膜过滤；
③亲水作用色谱对黄原胶寡糖混合物进行分离纯化：采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器HPLC-ELSD，使用极性填料作为色谱固定相，通过线性放大技术确定对黄原胶寡糖混合物分离纯化条件为：尺寸规格10×250mm的色谱柱XAmide，在25℃，流速4mL/min，进样40mg，梯度洗脱条件下进行收集黄原胶寡糖；所述黄原胶寡糖样品XGOS-Fr1、XGOS-Fr2和XGOS-Fr3的收集时间分别为15-17min、18-19min和20.5-21min；所述梯度洗脱中的洗脱剂A相为80％乙腈-10mM乙酸铵，B相为10mM乙酸铵，上述乙酸铵溶液的pH值为6.4；
④根据步骤③确定的收集时间收集馏分，经过多次进样，合并、浓缩，冻干得到黄原胶寡糖样品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤①中所述黄原胶寡糖混合物的制备包括，将5g黄原胶溶于500mL浓度为0.4mol/L的盐酸溶液中，将2.5g离子液体加入反应体系中，充分搅拌使黄原胶溶解，最后加入12.5mL浓度为30g/ml的H2O2；将上述反应体系置于80℃的水浴锅中反应4d后取出；利用4MNaOH将溶液中的pH调节至中性，而后将其放入截留分子量3500Da的多孔透析袋中，并将透析袋放入纯水中进行透析，透析结束后冻干得到黄原胶寡糖混合物样品。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤②中所述色谱柱XAmide为中性酰胺键合相；所述色谱柱XAmide的填料粒径为5μm。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤④获得的黄原胶寡糖的分离组分经过质谱法FT-ICR-MS进行结构解析，确定寡糖组分聚合度为2-4，没有侧链基团修饰，均带有葡萄糖醛酸；并对所述黄原胶寡糖清除自由基DPPH能力进行生物活性表征。
5.一种单一分子量黄原胶寡糖，其特征在于：由权利要求1-4任一所述的方法制成。
6.权利要求5所述的单一分子量黄原胶寡糖在清除自由基活性、抑制黑腐病致病菌活性、抗氧化活性及植物诱抗活性中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211014287.4A CN115232227B (zh) | 2022-08-23 | 2022-08-23 | 一种高效制备单一分子量黄原胶寡糖的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211014287.4A CN115232227B (zh) | 2022-08-23 | 2022-08-23 | 一种高效制备单一分子量黄原胶寡糖的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115232227A true CN115232227A (zh) | 2022-10-25 |
| CN115232227B CN115232227B (zh) | 2023-12-15 |
Family
ID=83681289
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211014287.4A Active CN115232227B (zh) | 2022-08-23 | 2022-08-23 | 一种高效制备单一分子量黄原胶寡糖的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115232227B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102101875A (zh) * | 2009-12-16 | 2011-06-22 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种寡糖纯化分离方法 |
| CN109517014A (zh) * | 2017-09-18 | 2019-03-26 | 中国科学院金属研究所 | 一种单一聚合度几丁寡糖的制备方法 |
| CN111154816A (zh) * | 2020-02-25 | 2020-05-15 | 李宪臻 | 一种利用大肠杆菌降解黄原胶制备黄原胶寡糖的方法 |
| CN111217870A (zh) * | 2020-02-27 | 2020-06-02 | 大连工业大学 | 一种黄原胶寡糖的制备方法 |
-
2022
- 2022-08-23 CN CN202211014287.4A patent/CN115232227B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102101875A (zh) * | 2009-12-16 | 2011-06-22 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种寡糖纯化分离方法 |
| CN109517014A (zh) * | 2017-09-18 | 2019-03-26 | 中国科学院金属研究所 | 一种单一聚合度几丁寡糖的制备方法 |
| CN111154816A (zh) * | 2020-02-25 | 2020-05-15 | 李宪臻 | 一种利用大肠杆菌降解黄原胶制备黄原胶寡糖的方法 |
| CN111217870A (zh) * | 2020-02-27 | 2020-06-02 | 大连工业大学 | 一种黄原胶寡糖的制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115232227B (zh) | 2023-12-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Pereira | Porous graphitic carbon as a stationary phase in HPLC: theory and applications | |
| Liu et al. | Global characterization of neutral saccharides in crude and processed Radix Rehmanniae by hydrophilic interaction liquid chromatography tandem electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry | |
| Pontarolo et al. | Simultaneous determination of metformin and vildagliptin in human plasma by a HILIC–MS/MS method | |
| Espina-Benitez et al. | Back to BAC: insights into boronate affinity chromatography interaction mechanisms | |
| Ai et al. | Rapid Determination of the Monosaccharide Composition and Contents in Tea Polysaccharides from Yingshuang Green Tea by Pre‐Column Derivatization HPLC | |
| KR20110028295A (ko) | 당쇄 시료 조제 방법, 당쇄 시료, 및 당쇄 분석법 | |
| AU2013227353B2 (en) | Improved analytical methods for analyzing and determining impurities in dianhydrogalactitol | |
| CN106706829B (zh) | 免疫亲和净化-液相色谱串联质谱测定贝类中腹泻性贝类毒素的方法 | |
| Zong et al. | Preparation and purification of raffinose family oligosaccharides from Rehmannia glutinosa Libosch. by fast protein liquid chromatography coupled with refractive index detection | |
| CN112724184B (zh) | 人参中特有化合物精氨酸双糖苷afg的分离制备方法 | |
| Chen et al. | Rapid determination of total solanesol in tobacco leaf by ultrasound-assisted extraction with RP-HPLC and ESI-TOF/MS | |
| CN109444318B (zh) | 一种用于分析杆菌肽组分的高效液相色谱方法 | |
| CN102590365A (zh) | 免疫亲合柱净化高效液相色谱检测中药酒剂中赭曲霉毒素a的方法 | |
| CN110988193B (zh) | 一种检测水产品中晚期糖基化终末产物的方法 | |
| Lazarus | Purification of plant extracts for ion-exchange chromatography of free amino acids | |
| Montes-Bayón et al. | Resolution of seleno-amino acid optical isomers using chiral derivatization and inductively coupled plasma mass spectrometric (ICP-MS) detectionPresented at the 2001 European Winter Conference on Plasma Spectrochemistry, Lillehamer, Norway, February 4–8, 2001. | |
| Li et al. | Structural analysis of Chromophore-Labeled | |
| CN115232227B (zh) | 一种高效制备单一分子量黄原胶寡糖的方法 | |
| Lu et al. | Resonance Rayleigh scattering for detection of proteins in HPLC | |
| De Goeij | Quantitative analysis methods for sugars | |
| Li et al. | Microwave-assisted extraction and ionic liquid-based dispersive liquid–liquid microextraction followed by HPLC for the determination of trace components in a Langdu preparation | |
| Luan et al. | Determination of Raddeanin A in rat plasma by liquid chromatography–tandem mass spectrometry: Application to a pharmacokinetic study | |
| CN103207256B (zh) | 坛紫菜中红藻糖苷和异红藻糖苷含量的检测方法 | |
| WO2015071335A1 (en) | Analytic methods for the determination of polysaccharides, especially glycosaminoglycans | |
| Yu et al. | Determination of myriocin in natural and cultured Cordyceps cicadae using 9-fluorenylmethyl chloroformate derivatization and high-performance liquid chromatography with UV-detection |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |