CN111205362A - 牛血清白蛋白及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种牛血清白蛋白及其制备方法，涉及牛血清白蛋白制备技术领域。本发明公开的制备方法包括：往牛血浆稀释液加入硫酸铵以使得到的混合溶液的电导率为500mS/cm‑600mS/cm，该方法以混合溶液的电导率作为控制蛋白沉淀的技术参数进行精准的盐浓度控制，大大地提高了终产品牛血清白蛋白的纯度，高达98％以上，并有效减少了杂质，提高了牛血清白蛋白的品质。

Description

牛血清白蛋白及其制备方法
技术领域
本发明涉及牛血清白蛋白制备技术领域，具体而言，涉及一种牛血清白蛋白及其制备方法。
背景技术
牛血清白蛋白是生命科学研究，免疫诊断检测常用的生化试剂，在科研和诊断产品开发上需求量很大。建立高纯度牛血清白蛋白的大规模生产方法是满足市场需求的根本途径。
目前生产牛血清白蛋白的方法有利凡诺法、辛酸钠法、低温乙醇法和硫酸铵沉淀法。
利凡诺法：利用利凡诺作为牛血清白蛋白保护剂，通过加热，使牛血清中的其他蛋白沉淀，采用离心或过滤的澄清技术，收获牛血清白蛋白。该方法主要的问题是产品纯度低，最高能达到90％纯度，并且利凡诺成本高，产生大量废弃物。
辛酸钠法：以一定浓度辛酸钠作为牛血清白蛋白保护剂，在控制pH和温度的条件下，通过加热保温，使其他蛋白沉淀，获得牛血清白蛋白。该方法辛酸钠用量较小，不会产生大量废料，牛血清白蛋白纯度也比较高，能达到90％以上，但是不能达到95％以上高纯度，同时在提取过程中引入了高浓度的辛酸盐，增加了牛血清白蛋白中的脂肪酸含量，会对后期实验使用产生干扰，所以需要增加脂肪酸的去除工艺。
低温乙醇法：以低温乙醇作为沉淀剂，对血浆蛋白选择性分批沉淀，最终获得牛血清白蛋白。该方法乙醇用量大，需要专门有机溶剂库房，需要大量耗能制备低温乙醇，同时白蛋白纯度只能达到80％以上，大量乙醇排放不能回收，造成严重环境污染。
硫酸铵法：以一定浓度的硫酸铵作为沉淀剂，对绝大部分杂蛋白进行沉淀，再采用离心或者过滤等澄清手段，分离其他蛋白沉淀，获得纯度比较高的牛血清白蛋白。该方法生产的白蛋白纯度能达到90％以上，但是白蛋白收率偏低，只能达到1.2％左右的收率，并且最终产品的颜色偏红，冻干后产品复溶度差，溶液浑浊，不能满足高浓度白蛋白溶液的实际应用，生产过程中产生了大量的硫酸铵废弃物，造成环境污染。
牛血清白蛋白是在生命科学和诊断检测中最常用的一种生化试剂，近年来生命科学和免疫诊断在快速发展，牛血清白蛋白的需求量迅速增加，需要吨级的供应量才能满足整个行业的需求。国内的血清白蛋白生产企业大都采用以上的方法进行生产，最终产品的外观和理化性质均不能达到精准实验的要求。以至于很多企业完全依靠大量进口牛血清白蛋白才能做出稳定的诊断试剂产品。因此，开发规模化制备高品质牛血清白蛋白的方法是支持科研满足诊断需求的关键因素。
从牛血浆中提取牛血清白蛋白经历了很长的时间和很多的技术改进。目前，能够达到科研和检测应用标准的牛血清白蛋白，必须是纯度高(98％以上)、残留杂质对实验干扰小(低内毒素、低蛋白酶、低脂肪酸)，蛋白稳定性好。血浆复杂的组分对牛血清白蛋白的分离造成了很大的障碍。以往采用的方法为了追求高纯度，难免会通过烈性条件影响白蛋白本身的品质，或者是引入其他杂质。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种牛血清白蛋白及其制备方法，本发明提供的牛血清白蛋白的制备方法能够提高牛血清白蛋白的纯度和收率，减少杂质，有效提高白蛋白的品质。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供一种牛血清白蛋白的制备方法，其包括：往牛血浆稀释液中加入硫酸铵以使得到的混合溶液的电导率为500mS/cm-600mS/cm。
本发明提供的制备方法，以硫酸铵盐析沉淀蛋白为技术基础，对其进行改进，该方法以混合溶液的电导率作为控制蛋白沉淀的技术参数进行精准的盐浓度控制，在常温下可以使绝大部分的杂蛋白都被沉淀，大大地提高了终产品牛血清白蛋白的纯度，高达98％以上，并有效减少了杂质，提高了牛血清白蛋白的品质。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述电导率为520mS/cm-580mS/cm。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述电导率为530mS/cm-560mS/cm。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述电导率为530mS/cm、550mS/cm或560mS/cm。进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述牛血浆稀释液为牛血浆与水混合得到。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述牛血浆与水的体积比为1:1-2。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述制备方法还包括：在加入硫酸铵之后，对所述混合溶液进行搅拌。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，搅拌的时间为1-2小时。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述制备方法还包括：在搅拌结束后，将所述混合溶液静置。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，静置的时间为2-4小时。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述制备方法还包括：在静置结束后，对所述混合溶液进行提纯，得到提纯液。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述提纯的方法包括：将所述混合溶液进行固液分离，去除沉淀，取过滤液进行超滤脱盐，然后进行缓冲液置换。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，固液分离的方式为过滤或板框压滤。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，采用分子截留量为8-12kD的中空纤维柱进行超滤。超滤可以对提纯液进行脱盐，以便于下一步得工艺实施。提纯液里的蛋白是大分子物质，可被截留，而无机盐是小分子，利用超滤设备可以把无机盐从蛋白液中分离出来。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，采用分子截留量为10kD的中空纤维柱进行超滤。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，进行缓冲液置换所用的缓冲液为磷酸盐缓冲液。
在其他的实施例中，也可以使用纯净水进行置换。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，磷酸盐缓冲液的pH为7.4。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述制备方法还包括：去除所述提纯液中的色素。
将提纯液中的色素去除，减少杂质，并且可以保证产品的外观洁白干净。而现有的制备方法通常没有此步骤。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，采用大孔吸附树脂柱对所述提纯液进行层析去除色素。
采用大孔吸附树脂柱层析，可以有效地去除提纯液中的色素，减少杂质，提高产品的澄清度。
第二方面，本发明提供一种牛血清白蛋白制品，其由如上任一项所述的制备方法制得。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1-3提供的牛血清白蛋白冻干粉的SDS-PAGE电泳结果，图中：泳道1-4为进口四个牛血清白蛋白样品，泳道5-6为国产两个牛血清白蛋白样品，泳道7-9分别是本发明实施例1-3的牛血清白蛋白。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的制备牛血清白蛋白的方法如下：
准确量取100L纯净水与70L牛血浆混合，充分搅拌稀释；往牛血浆稀释液中加入75kg硫酸铵以使混合溶液(即牛血浆稀释液与硫酸铵的混合)的电导率为560mS/cm；搅拌1小时，静置3小时，然后过滤或者板框压滤澄清，除去沉淀，过滤液采用10kD中空纤维柱超滤脱盐，然后进行缓冲液(磷酸盐缓冲液，pH7.4)置换，上大孔吸附树脂柱，吸附色素后再超滤浓缩至20％浓度，冷冻干燥。得冻干粉1800g，回收率2.57％，冻干粉电泳检测，SDS-PAGE电泳结果见图1，纯度在99％以上，复溶液清亮透明，色泽为淡黄色，属高纯度白蛋白溶解特征。
实施例2
本实施例提供的制备牛血清白蛋白的方法如下：
准确量取400L纯净水与280L牛血浆混合，充分搅拌稀释；往血浆稀释液中加入300kg硫酸铵以使混合溶液的电导率为550mS/cm；搅拌1小时，静置3小时，然后过滤或者板框压滤澄清，除去沉淀，过滤液采用10kD中空纤维柱超滤脱盐，然后进行缓冲液(磷酸盐缓冲液，pH7.4)置换，上大孔吸附树脂柱，吸附色素后再超滤浓缩至20％浓度，冷冻干燥。得冻干粉7460g，回收率2.66％。冻干粉电泳检测，SDS-PAGE电泳结果见图1，纯度在99％以上，复溶液清亮透明，色泽为淡黄色，属高纯度白蛋白溶解特征。
实施例3
准确量取1500L纯净水与1000L牛血浆混合，充分搅拌稀释；往血浆稀释液中加入1080kg硫酸铵以使混合溶液的电导率为530mS/cm；搅拌1小时，静置3小时，然后过滤或者板框压滤澄清，除去沉淀，过滤液采用10kD中空纤维柱超滤脱盐，然后进行缓冲液(磷酸盐缓冲液，pH7.4)置换，上大孔吸附树脂柱，吸附色素后再超滤浓缩至20％浓度，冷冻干燥。得冻干粉27000g，回收率2.7％。冻干粉电泳检测，SDS-PAGE电泳结果见图1，纯度在99％以上，复溶液清亮透明，色泽为淡黄色，属高纯度白蛋白溶解特征。
对比例1
本对比例与实施例1的方法基本相同，不同的是，加入硫酸铵以使混合溶液的电导率低于500mS/cm，具体为480mS/cm。得到的冻干粉纯度为75％。
对比例2
本对比例与实施例1的方法基本相同，不同的是，加入硫酸铵以使混合溶液的电导率高于600mS/cm具体为610mS/cm。得到的冻干粉纯度与实施例1基本保持一致，但是产率大幅度下降，产量只有实施例1的50％左右，回收率约为1.2％。
综上可以看出，经过连续生产三批(实施例1-3)以上，样品经检测批间差细微，说明该本发明提供的制备方法可以稳定制备牛血清白蛋白。经过十几倍放大后，产品依然保持稳定的检测参数标准，证明该方法的规模化生产可行性。此外，本发明的实施例的终产品经多家诊断试剂厂试用后，其效果完全和进口试剂(罗氏等品牌)性能效果相当。
本发明提供的制备方法具有周期短(提取分离仅两天)，不耗能(室温反应)，无污染物引入(硫酸铵本身是化肥，并且被回收循环使用)，无废渣产生(其他蛋白没有变性，还可再深加工)，纯度高，该方法最大限度地利用了血浆组分的潜在价值，在所有白蛋白生产方法中，成本最低，最环保。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种牛血清白蛋白的制备方法，其特征在于，其包括：往牛血浆稀释液中加入硫酸铵以使得到的混合溶液的电导率为500mS/cm-600mS/cm。
2.根据权利要求1所述的牛血清白蛋白的制备方法，其特征在于，所述电导率为520mS/cm-580mS/cm；
优选地，所述电导率为530mS/cm-560mS/cm；
优选地，所述电导率为530mS/cm、550mS/cm或560mS/cm；
优选地，所述牛血浆稀释液为牛血浆与水混合得到；
优选地，所述牛血浆与水的体积比为1:1-2。
3.根据权利要求2所述的牛血清白蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括：在加入硫酸铵之后，对所述混合溶液进行搅拌；
优选地，搅拌的时间为1-2小时。
4.根据权利要求3所述的牛血清白蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括：在搅拌结束后，将所述混合溶液静置；
优选地，静置的时间为2-4小时。
5.根据权利要求4所述的牛血清白蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括：在静置结束后，对所述混合溶液进行提纯，得到提纯液。
6.根据权利要求5所述的牛血清白蛋白的制备方法，其特征在于，所述提纯的方法包括：将所述混合溶液进行固液分离，去除沉淀，取过滤液进行超滤脱盐，然后进行缓冲液置换；
固液分离的方式为过滤或板框压滤。
7.根据权利要求6所述的牛血清白蛋白的制备方法，其特征在于，采用分子截留量为8-12kD的中空纤维柱进行超滤。
8.根据权利要求6所述的牛血清白蛋白的制备方法，其特征在于，进行缓冲液置换所用的缓冲液为磷酸盐缓冲液。
9.根据权利要求5-8任一项所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括：去除所述提纯液中的色素；
优选地，采用大孔吸附树脂柱对所述提纯液进行层析去除色素。
10.一种牛血清白蛋白制品，其特征在于，其由权利要求1-9任一项所述的制备方法制得。
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