CN111201231A - 抗菌药 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及有机杂环化合物的化学，即含有式I的维生素B6衍生物的片段的新的季铵盐，其表现出抗细菌、抗真菌、抗病毒和抗原生动物的特性。化合物可用于医药和兽药。

Description

抗菌药
本发明涉及有机杂环化合物化学，即包含式I的维生素B6衍生物的片段的新的季铵盐，其表现出抗细菌、抗真菌、抗病毒和抗原生动物的特性。化合物可用于药物和兽药。
Figure BDA0002403848110000011
传染病的预防和治疗目前是最重要的健康挑战之一。只有抗生素和抗菌药的复合应用才能成为有效的疗法[Morozova N.S.Modern view on the role of antiseptics inthe prevention and treatment of purulent and septic complications in patientswith surgical profile.The Ukrainian journal of extreme medicine named afterG.O.Mozhaeva[Morozova N.S.Sovremennyy vzglyad na rol'antiseptikov vprofilaktike i lechenii gnoyno-septicheskikh oslozhneniy u patsiyentovkhirurgicheskogo profilya.Ukrainskiy journal
Figure BDA0002403848110000012
medicini imeniG.O.Mozhaeva,2012—第13卷,第2期-P.6-9]。
抗菌药的必要条件在于其作用谱范围：它们必须具有抗细菌、抗真菌、抗病毒和抗寄生虫活性[Farmakologiya:uchebnik/Pod red.prof.R.N.Alyautdina.-4-yeizd.,pererab.i dop.-M.:GEOTAR-Media,2010.-832s.]Pharmacology:textbook/Ed.prof.R.N.Alyautdina.—4th ed.,revised and updated.—M.::GEOTAR-Media,2010.—p.832]。由于其宽的作用范围，抗菌药用于许多医学适应症。
季铵化合物(QAC)是最重要的抗菌药类别之一，并且具有广泛的应用，特别是在如下方面：治疗局部化脓性炎症过程，手术前完整皮肤的处理，滴眼液、注射液、牙膏、化妆品的保存，消毒和表面清洁。现代QAC的特征在于对革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物、真菌、病毒和原生动物具有广泛的抗微生物活性。QAC抗细菌作用的机制在于其吸附和穿透细菌的细胞壁，随后与质膜的磷脂发生相互作用，从而导致细菌细胞的完整结构破坏和随后的死亡[McDonnell G,Russell AD.Antiseptics and Disinfectants:Activity,Action,andResistance.Clinical Microbiology Reviews.-1999-V.12(1).-P.147-179]。
所用的QAC的缺点在于相对于孢子[Shandala M.G.Perspektivy i problemysovremennoy dezinfektologii.Zhurn.Dezinfektsionnoye delo.-2002,第4期.-S 13-19.[Shandala M.G.Prospects and problems of modern disinfectology.JournalDisinfection case.-2002,№4.-P 13-19]和简单的病毒[Reinbaben,Friedrichvon.Osnovy protivovirusnoy dezinfektsii:perevod s nemetskogo yazyka-Moskva:Samarovo:Letniy sad.-2014.-S.525].Reinbaben,Friedrich von.Fundamentals ofantiviral disinfection:translation from German-Moscow:Samarovo:Summergarden.-2014.-P.525]无效，并且对革兰氏阴性菌、分枝杆菌和真菌活性不足。还是缺乏所使用的抗菌药[Federal Register/第81卷,第126期/Thursday,June 30,2016/ProposedRules]及其高毒性[Rasmussen,C.A.,Kaufman P.L.,Kiland J.A.Benzalkonium Chlorideand Glaucoma.Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics.-2014-V.30.-P.163–169.]方面的知识。
在包含季铵盐的片段的药物中，应当注意：
米拉米斯停(Miramistin)((苄基二甲基[3-(肉豆蔻酰基氨基)丙基]-氯化铵一水合物)为在USSR时期公开的针对如下细菌具有广谱杀菌作用的抗菌药：革兰氏阳性菌(葡萄球菌属的种类(Staphylococcus spp.)、链球菌属的种类(Streptococcus spp.)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)等)、革兰氏阴性菌(铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、大肠杆菌(Escherichia coli)、克雷伯氏菌属的种类等)、需氧和厌氧菌和病毒，包括对抗生素具有多重耐药性的临床菌株[Registr lekarstvennyh sredstv RossiiRLSEntsiklopedia lekarstv 20-y vyp.Gl.red.G.L.Vyshkovskiy.-M.:LIBROFARM,2011.-S.1368[The Register of Medicines of Russia RMR Encyclopedia of Drugs.—第20期chief.ed.D.L.Vyshkovskiy.—M.:LIBROPHARM,2011.P.1368]。其用于预防化脓和化脓性伤口的治疗，皮肤和粘膜念珠菌病的预防和治疗，急慢性中耳炎的综合治疗，口腔传染性和炎性疾病(口炎、牙龈炎、牙周炎(periodontitis)、牙周炎(parodontitis))，传播疾病(梅毒、淋病、衣原体病、生殖器疱疹等)的个体预防[Blatun L.A.Miramistin vkompleksnoy programme bor'by s gospital'noy infektsiyey v khirurgicheskomstatsionare//V sb.:米拉米斯停:primeneniye v khirurgii,travmatologii ikombustiologii.M.-2006.-S.27-33.Makeyeva I.M.Ye.V.Borovskiy,M.V.Matavkina,Ye.A.Brovenko.Primeneniye preparata Miramistin v kompleksnom lecheniizabolevaniy slizistoy obolochki rta.Farmateka.-2013.-№3-S.1]BlatunL.A.Miramistin in the complex program of control of hospital infection in asurgical hospital//In report:Miramistin:application in surgery,traumatologyand combustiology.M.—2006.—P.27-33.；Makeeva I.M.E.V.Borovsky,M.V.Matavkina,E.A.Brovenko.Application of drug Miramistin in the complex treatmentofdiseases of the oral mucosa.Pharmacy.-2013.-第3期-P.1].
Fluomys in(地喹氯铵)为广谱抗菌药，其对如下细菌具有活性：大部分革兰氏阳性菌链球菌属的种类、金黄色葡萄球菌、利斯特菌属的种类(Listeria spp.)、厌氧菌消化链球菌属(Peptostreptococcus)(D族)、假丝酵母属(Candida)真菌(热带假丝酵母(Candida tropicalis)、Candida aМХicans、光滑假丝酵母(Candida glabrata)，革兰氏阴性菌阴道加德那菌(Gardnerella vaginalis)、大肠杆菌、沙雷菌属的种类(Serratiaspp.)、克雷伯菌属的种类、假单胞菌属的种类(Pseudomonas spp.)、变形杆菌属的种类(Proteus spp.)和原生动物(阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis))。其用于细菌性阴道病，念珠菌病皮肤、指甲壁、口腔粘膜念珠菌病，口腔和咽部的炎症过程(扁桃体炎、口炎，包括aphthose、舌炎等)、咽头炎)[Spravochnik Vidal'《Lekarstvennyye preparaty vRossii》.Vidal Handbook“Medicines in Russia”.https://www.vidal.ru/drugs/ fluomisin__22520]。
苯扎氯铵(烷基二甲基(苯基甲基)氯化铵)为对如下细菌具有活性的抗菌药：革兰氏阳性菌(葡萄球菌属的种类、链球菌属的种类、肺炎链球菌等)、革兰氏阴性菌(铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、大肠杆菌(Escherichia coli)、克雷伯氏菌属的种类等)和厌氧菌、真菌和霉菌。它可用于伤口的初级和初级延迟处理，预防医院的微生物菌株引起的伤口继发感染，细菌性阴道病，骨髓炎术后的骨腔引流[Spravochnik Vidal'《Lekarstvennyye preparaty v Rossii》.Vidal Handbook“Medicines in Russia”.https://www.vidal.ru/drugs/dettol_benzalkonium_chloride__30527]。
应当注意，申请人认为上述药物不能被视为所要求保护的发明的类似物，因为它们虽然具有抗细菌、抗真菌、抗病毒和抗原生动物的活性(目的一致)或多或少与所宣布的发明可比较，但是它们与根据化学结构要求保护的化合物并不一致。
所要求保护的技术方案由说明书文本中的图1、2和十六(16)个表来表示(用于加深专家对申请文本的理解)。
图1提供了化合物I、苯扎氯铵和米拉米斯停对浸入生物膜基质中的革兰氏阳性菌细胞的抗细菌活性的对比分析。
图2提供了化合物I、苯扎氯铵和米拉米斯停对浸入生物膜基质中的革兰氏阴性菌细胞的抗细菌活性的对比分析。
本发明的目的在于具有与现有抗菌药可比较的高抗细菌、抗真菌、抗病毒和抗原生动物的活性的新化合物，但是具有显著更低的毒性。
所要求保护的发明的技术效果在于获得一种新的式I化合物，其既包含天然化合物(维生素B6)的片段又包含季铵片段。
通过获得所要求保护的下图1的式I的维生素B6的新衍生物，解决了该技术问题，并获得了特定的技术成果：
Figure BDA0002403848110000051
其中要求保护的化合物由编号I表示。
Figure BDA0002403848110000052
图1
在特定性能的实施例中，下面给出了新化合物的特征。所获得的化合物的结构通过质谱、1H和13C NMR光谱证实。使用AVANCE-400装置(Bruker,Germany)记录NMR光谱。根据氘代溶剂的残留质子信号(1H和13C)确定化学位移。使用Stanford Research Systems MPA-100OptiMelt测定熔点温度。通过TLC方法在Sorbfil板上进行反应过程和化合物纯度的控制。使用TripleTOF 5600,AB Sciex(Germany)质谱仪通过离子化—涡轮喷雾(TIS)—以等于10eV的与氮分子的碰撞能量从甲醇溶液中进行高分辨率质谱(HRMS)实验。
实施例1.5,8-(双(亚甲基(N,N-二甲基-N-十二烷基铵))-2-乙基-4H-[1,3]二噁英并[4,5-c]吡啶鎓二氯化物(I)的制备
步骤1.5-(羟基甲基)-2-乙基-8-甲基-4H-[1,3]二氧杂芑并(dioxino)[4,5-c]吡啶(1)的制备
用Dean-Stark装置将28.1g(146.0mmol)对甲苯磺酸一水合物在500ml甲苯中煮沸2小时。然后将该溶液冷却至室温，加入30.0g(146.0mmol)的盐酸吡多醇和15.0ml(209.5mmol)的丙醛。用Dean-Stark装置将该反应混合物煮沸8小时。然后真空除去溶剂。在搅拌下将18.0g(450.0mmol)氢氧化钠在100ml水中的溶液添加到沉淀物中。接下来将水部分用500ml氯仿洗涤，分离有机部分，真空干燥，从100ml甲苯中重结晶。收率为17.0g(56％)的无色结晶物质，熔点等于111-112℃。
NMR光谱1H(400MHz,DMSO-d6)δ,ppm:1.00t(3H,3JH-H＝7.5Hz,CH3 CH2),1.77-1.83sqd(2H,3JH-H＝7.5Hz,3JH-H＝5.0Hz,CH3 CH2 ),2.30s(3H,CH3),4.38d(2H,3JH-H＝4.3Hz,CH2 OH),4.95s(2H,CH2O),5.06t(1H,3JH-H＝5.0Hz,CHC2H5),5.18t(1H,3JH-H＝4.3Hz,CH2 OH),7.93s(1H,CHpyr).
NMR光谱13C(100MHz,DMSO-d6)δ,ppm:7.78s(CH3 CH2),18.16s(CH3),27.06s(CH3 CH2 ),58.21s(CH2O),63.43s(CH2O),100.02s(CHC2H5),126.88s(Spyr),130.94s(Cpyr),138.95s(CHpir),145.09s(Cpyr),146.91s(Cpyr).
质谱(HRMS-ESI):测定值[М+H]+210.1125,C11H16NO3.计算值[M+H]+210.1130.
步骤2.5-(乙酰氧基甲基)-2-乙基-8-甲基—4H-[1,3]二氧杂芑并[4,5-c]吡啶(2)的制备
在搅拌下，向10.0g(47.8mmol)化合物1、7.64ml(55.1mmol)三乙胺在150ml二氯甲烷中的溶液中，滴加3.74ml(52.6mmol)乙酰氯在30ml二氯甲烷中的溶液，历时20分钟。将所得溶液在室温搅拌3小时。依次用200ml 5％碳酸氢钠溶液和100ml水洗涤反应混合物。分离有机部分，真空干燥。收率为12.0g(定量)，为无色油状物质。
NMR光谱1H(400MHz,CDCl3)δ,ppm:1.08t(3H,3JH-H＝7.5Hz,CH3 CH2),1.89-1.93m(2H,CH3 CH2 ),2.07s(3H,CH3),2.44s(3H,CH3),4.91,4.95AB system(2H,3JH-H＝16.0Hz,CH2),4.97s(2H,CH2),4.97t(1H,3JH-H＝5.0Hz,CHC2H5),8.04s(1H,CHpyr).
NMR光谱13C(100MHz,CDCl3)δ,ppm:7.94s(CH3 CH2),18.42s(CH3),20.91s(CH3),27.64s(CH3 CH2 ),61.16s(CH2O),64.07s(CH2O),100.95s(CHC2H5),124.85s(Cpyr),127.75s(Cpyr),140.78s(CHpyr),147.95s(Cpyr),148.34s(Cpyr),170.58s(C(O)).
步骤3.5-(乙酰氧基甲基)-2-乙基-8-甲基—4H-[1,3]二氧杂芑并[4,5-c]吡啶N-氧化物(3)的制备
向12.0g(47.8mmol)化合物2在300ml二氯甲烷中的溶液中加入19.2g(66.8mmol)的60％间氯过苯甲酸，在室温不透光下搅拌24小时。然后将反应混合物依次用10％亚硫酸钠溶液(2*150ml)、5％碳酸氢钠溶液(2*150ml)和水(75ml)洗涤。分离有机层，真空除去溶剂。产品收率11.91g(93％)，无色结晶。
NMR光谱1H(400MHz,CDCl3)δ,ppm:1.07t(3H,3JH-H＝7.5Hz,CH3 CH2),1.89-1.93m(2H,CH3 CH2 ),2.10s(3H,CH3),2.41s(3H,CH3),4.88s(2H,CH2),4.89s(2H,CH2),4.99t(1H,3JH-H＝5.0Hz,CHC2H5),7.98s(1H,CHpyr).
NMR光谱13C(100MHz,CDCl3)δ,ppm:7.75s(CH3 CH2),10.21s(CH3),20.71s(CH3),27.41s(CH3 CH2 ),59.88s(CH2O),63.76s(CH2O),101.50s(CHC2H5),117.89s(Cpyr),126.71s(Cpyr),132.06s(CHpyr),139.29s(Cpyr),149.52s(Cpyr),170.16s(C(O)).
步骤4.5.8双(乙酰氧基甲基)-2-乙基-4H-[1.3]二氧杂芑并[4.5-c]吡啶(4)的制备
将11.9g(44.6mmol)的化合物3在40ml(424mmol)的乙酐和60ml的二氯甲烷中的溶液在50℃加热6小时。然后真空除去溶剂，将剩余的油状物溶于二氯甲烷中。依次用5％碳酸氢钠溶液(150ml)和水(100ml)洗涤所得溶液。分离有机层，真空除去溶剂。该产物无需进一步纯化即可用于下一步。产品收率为13.5g(97％)，黑色油状物质。
步骤5:5,8-双(羟基甲基)-2-乙基-4H-[1,3]二氧杂芑并[4,5-c]吡啶(5)的制备
将13.5g(43.7mmol)的化合物4溶于140ml乙醇。向获得的混合物中加入3.48g(87.0mmol)的氢氧化钠在30ml水中的溶液。将该溶液在50℃下搅拌1小时，用盐酸酸化至pH＝6.5，真空蒸馏出溶剂。将150ml水倾入干燥的残余物中，煮沸15分钟。在80℃下滤出不溶性树脂状沉淀物，将溶剂浓缩至80ml，在冰箱中放置12小时。滤出沉淀物。产品收率为3.7g(38％)，棕色结晶物质。
NMR光谱1H(400MHz,DMSO-d6)δ,ppm:1.00t(3H,3JH-H＝7.5Hz,CH3 CH2),1.78-1.82m(2H,CH3 CH2 ),4.42d(2H,3JH-H＝4.2Hz,CH2 OH),4.48d(2H,3JH-H＝5.6Hz,CH2 OH),4.86t(1H,3JH-H＝5.6Hz,CH2 OH),4.97s(2H,CH2),5.07t(1H,3JH-H＝5.0Hz,CH2 OH),5.23t(1H,3JH-H＝4.8Hz,CHC2H5),8.04s(1H,CHpyr).
NMR光谱13C(100MHz,DMSO-d6)δ,ppm:7.68s(CH3 CH2),26.94s(CH3 CH2 ),58.14s(CH2),59.02s(CH2),63.44s(CH2),100.02s(CHC2H5),127.37s(Cpyr),132.24s(CHpyr),138.68s(Cpyr),146.52s(Cpyr),146.94s(Cpyr).
步骤6:5.8双(氯甲基)-2-乙基-4H-[1.3]二氧杂芑并[4.5-c]吡啶鎓氯化物(6)的制备
向3.7g(16.4mmol)物质5在40ml甲苯中的混悬液中滴加5.0ml(68.9mmol)亚硫酰氯。将该反应混合物在70℃下搅拌2小时。将50ml乙醚加入到该混合物中，滤出沉淀物。产品收率为4.66g(95％)，黄色结晶物质。
步骤7:5,8-(双(亚甲基(N,N-二甲基-N-十二烷基铵))-2-乙基-4H-[1,3]二氧杂芑并[4,5-c]吡啶鎓二氯化物(I)的制备
在搅拌的同时，向1.1g(13.1mmol)碳酸氢钠在40ml水中的溶液中添加3.8g(12.7mmol)的化合物6。滤出所得沉淀物，真空干燥。将所得的2.9g(11.1mmol)产物(88％收率)溶于50ml乙醇，加入5.98ml(22.2mmol)N,N-二甲基十二烷基胺。将该反应混合物在70℃下搅拌8小时。真空蒸馏出溶剂。将所得沉淀物在120ml丙酮中煮沸。冷却至室温后，将沉淀滤出，真空干燥。收率为5.64g(74％)，为白色结晶物质。
NMR光谱1H(400MHz,CDCl3)δ,ppm:0.84t(6H,3JHH＝6.7Hz,2CH3 C11H22),1.00t(3H,3JH-H＝7.5Hz,CH3 CH2),1.22-1.33m(32H,16CH2),1.70-1.84m(6H,3CH2),2.96m(2H,CH2),3.29-3.32m(12H,4CH3N+),3.50-3.83m(4H,2CH2N+),4.69,4.74(AB-系统,2H,2JHH＝-13.6Hz,CH2),5.10,5.55(AB-系统,2H,2JHH＝-16.7Hz,CH2),5.11,5.21(AB-系统,2H,2JHH＝-13.6Hz,CH2),8.60s(1H,CHpyr).
NMR光谱13C(100MHz,CDCl3)δ,ppm:8.01s(CH3),14.21s(CH3),22.77s(CH3),23.18s(CH2),26.46s(CH2),27.57s(CH2),29.43s(CH3),29.46s(CH2),29.53s(CH2),29.62s(CH2),29.70(s,CH2),31.99s(CH2),49.60s(CH3N+),49.76s(CH3N+),51.11s(CH3N+),51.34s(CH3N+),61.94s(CH2),s 62.26(CH2),65.60s(CH2),65.66s(CH2N+),66.34s(CH2N+),102.04s(C(CH3)2),122.92s(Cpyr),134.60s(Cpyr),136.87s(Cpyr),146.54s(Cpyr),150.88s(Cpyr).
实施例2.季铵盐I的抗细菌活性的体外研究
根据[Opredeleniye chuvstvitel'nosti mikroorganizmov k antibakterial'nym preparatam(Metodicheskiye ukazaniya MUK4.2.1890-04).Utverzhdeny i vvedenyv deystviye Glavnym gosudarstvennym sanitarnym vrachom Rossiyskoy FederatsiiG.G.Onishchenko 04.03.2004g.Determination of the sensitivity ofmicroorganisms to antibacterial drugs(Guidelines MUK4.2.1890-04).Approved andput into effect by the Chief State Sanitary Doctor of theRussian FederationG.G.Onishchenko on 04.03.2004]，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌微生物的档案(archival)和临床菌株进行抗细菌作用谱的对比评价。
最低抑菌浓度(MIC)值通过使用96-孔无菌平板对Müller-Hinton肉汤进行系列稀释的方法测定。制备测试物质在营养培养基中的两倍稀释液。终浓度为1-128ug/ml。目视评价培养物的生长，将测试化合物存在下的微生物的生长与没有它们存在下的培养物生长进行比较。肉汤中微生物存在生长(肉汤的浊度)表明所研究药物的这种浓度不足以抑制其生存能力。将无法目视确定细菌生长的研究物质的第一最低浓度(来自一系列连续稀释液)视为最低抑菌浓度(MIC)。MIC通过以增量＝2的肉汤连续稀释的方法确定，因此相邻稀释液之间的差异不被视为显著的。在每种体验中，均存在阳性(具有生长培养物的肉汤)和阳性(没有生长培养物的肉汤)对照。
为了确定MIC，从未观察到生长的孔中取出10μl培养基，并在致密的Müller-Hinton肉汤上进行接种。为了制备接种物，使用了在致密的营养培养基上生长的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌微生物的纯净日常培养物。营养培养基是Müller-Hinton肉汤，它由干燥培养基(Müller-Hinton肉汤,Acumedia,Baltimore)制备，在琼脂糖化的Müller-Hinton肉汤中进行培养，其包括另外的2％琼脂。将培养基在121℃下高压灭菌15分钟。在无菌的等渗氯化钠溶液中，制备了微生物混悬液，根据McFarland标准(1.5·108CFU/ml)将接种物密度调节至0.5。然后，将所得接种物用Müller-Hinton肉汤稀释至107CFU/ml的浓度。制备后15分钟内使用接种物；在每次实验前都要监测细菌菌株的纯度。
将100μl的Müller-Hinton肉汤添加到每个板的孔中；将测试物质以100μl的体积以128μg/ml的浓度导入第一孔，并通过连续两倍稀释将其浓度调节至0.5μg/ml。然后，将制备的接种物(100μl)添加到每个孔中，由此将所研究化合物的浓度稀释两倍。作为对照，包括不含测试物质的孔(控制培养物的生长)。另外，监测营养培养基和溶剂的纯度。将板在恒温器中于37℃温育24小时。目视评价培养物的生长，将测试化合物存在下的微生物的生长与没有它们存在下的培养物的生长进行比较。
对于MIC，采用了所研究化合物的最小浓度，其提供了对所研究微生物菌株的可见生长的完全抑制。将在三个独立实验中获得的最大值作为该化合物的MIC。
作为筛选化合物I的抗细菌活性的结果确定临床葡萄球菌的MIC为1-8μg/ml，只有一种情况为16μg/ml(金黄色葡萄球菌967MRSA菌株)，对于临床肠球菌MIC在0.03-4μg/ml范围内。这些值与苯扎氯铵中发现的指标可比较，且平均比米拉米斯停(表1)指标高(2-4)倍。
就革兰氏阴性菌而言，药物活性较低，11个菌株中的MIC为2-4μg/ml，18个菌株中的MIC为8-16μg/ml，12个菌株中的MIC为32-64μg/ml。测试的新药在活性上与苯扎氯铵可比较，并且在某些菌株中超过它(特别是在铜绿假单胞菌菌株的情况下)。与米拉米斯停相比，化合物I的活性要高得多，其中MIC在32-64μg/ml，但档案菌株(archival strain)大肠杆菌ATCC 25922除外。
表1.
当接种物浓度为107CFU/ml时，相对于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌微生物，化合物I和对照药物的MIC平均值(以μg/ml计)
Figure BDA0002403848110000121
Figure BDA0002403848110000131
Figure BDA0002403848110000141
Figure BDA0002403848110000151
应当指出，所有细菌菌株(MIC100<64ug/ml)均对化合物I敏感，而米拉米斯停MIC89<64ug/ml且苯扎氯铵MIC92<64ug/ml。
实施例3.化合物I对浸入生物膜基质中的细胞的抗细菌活性的测定
为了确定抗生素对细胞中细菌的有效性，使细菌在Basal培养基中于37℃的温度下不经摆动生长3天，以获得致密的生物膜[A.R.Kayumov,Khakimullina E.,Sharafutdinov I.,Trizna E.,Latypova L.,Lien Thi,Margulis A.,Bogachev M.,Kurbangalieva A.Inhibition of biofilm formation in Bacillus subtilis by newhalogenated furanones.J.Antibiotics.-2014.-第68卷.-第5期-Р.297-301.]。然后用无菌的0.9％NaCl溶液洗涤生物膜，倾倒新鲜的无菌培养基。加入抗菌药至浓度(1-16)×MBC(最低杀菌浓度)并温育24小时。然后从孔中取出培养流体，用0.9％NaCl溶液洗涤一次以除去非粘附细胞，并通过Drop板分析计数CFU来评价生物膜中的细胞活力[B.Herigstad,M.Hamilton,J.Heersink How to optimize the drop plate method for enumeratingbacteria.J Microbiol Methods.-2001.-第44卷-P.121-129]。为此，将生物膜从表面上以机械方式去除，并通过移液和超声处理在0.9％NaCl中均化。然后，制备细菌混悬液在0.9％NaCl中的10-倍系列稀释液，并将5μl每种混悬液转移至带有浓营养培养基的平板中。从含有5-10个菌落的液滴中计数CFU。
与米拉米斯停和苯扎氯铵相比，对浸入生物膜基质中的研究菌株细胞的抗微生物活性的研究结果如图1和图2中所示。
关于生物膜中的革兰氏阳性菌微生物，化合物I表现出比米拉米斯停和苯扎氯铵高2-倍的活性：发生相同的CFU数量减少，化合物I与米拉米斯停和苯扎氯铵比较的MBC低2倍还多。同时，米拉米斯停的活性比苯扎氯铵低2倍。
对于生物膜中的革兰氏阴性菌微生物，化合物I表现出与米拉米斯停和苯扎氯铵相同的抗肺炎克雷伯氏菌、粘质沙雷氏菌、大肠杆菌的活性。至于铜绿假单胞菌菌株，化合物Ⅰ的活性明显高于对比抗菌药。当MBC对于化合物I超过4-8倍以及对于米拉米斯停和苯扎氯铵超过16倍时，CFU数量减少了3个数量级，这无疑是研发的抗菌药的优势。
实施例4.化合物I的抗病毒活性的体外研究
根据[D.L.Kuznetsov,A.YA.Samuylenko,V.I.Belousov Immunofermentnayadiagnostika IRT KRS.Veterinariya.-2002.-第3期.-S.22-25.D.L.Kuznetsov,A.Y.бSamuylenko,V.I.Belousov Enzyme-linked immunosorbent assay for cattleIBR.Veterinary medicine.-2002.-第3期.-P.22-25]进行化合物I的体外抗病毒活性研究。
轻型奶牛胚胎(light cow embryo)(LCE)的细胞得自Federal State BudgetaryInstitution“All-Russian Institute of Experimental Veterinary Medicine”,Moscow。牛鼻气管炎病毒(疱疹病毒家族)、疫苗株“TK-A(VIEV)-V2”得自Federal StateBudgetary Institution“All-Russian Institute of Experimental VeterinaryMedicine”,Moscow。
在适当的培养基中，对感染了属于1型疱疹病毒家族的IBR病毒的LCE细胞进行了化合物I的抗病毒活性评价。
将病毒在不同浓度的化合物I存在下于37℃在培养基中温育1小时；米拉米斯停和苯扎氯铵作为对照制剂。将病毒与物质一起温育后，将其添加到细胞培养物中，然后将其在37℃、5％CO2中温育72小时。
与对照(不与药物一起温育的病毒，无病毒的研究药物浓度)相比，根据细胞单层的状态目测评价细胞致病作用。使用在Ashmarin改变的Reed-Muench方法中计算病毒滴度，并以lg TCD50/ml表示。
作为对化合物I的抗病毒活性的研究结果，揭示出该物质对1型疱疹病毒具有杀毒作用，其中感染滴度为6.0lg TCD50/ml(表2)。化合物I的杀病毒作用(200ug/ml)比米拉米斯停(150ug/ml)略弱，但与苯扎氯铵的作用是可比较的。
表2.
药物的抗病毒活性研究结果
Figure BDA0002403848110000171
其中：
++++-90-100％单层破坏；
+++-70-90％单层破坏；
++-40-70％单层破坏；
+10-40％单层破坏；
-0-10％单层破坏。
实施例5.化合物I的体外抗原生动物的活性的测定
化合物I的抗原生动物的活性的评价根据在研究物质存在下、在营养培养基中的原生动物属腹纤毛虫贻贝棘尾虫(Stylonychia mytilus)的生存力来确定。在DMSO和96％乙醇(1∶1)的混合物中制备化合物I的母液(10mg/ml)。1％的DMSO和乙醇水溶液作为阴性对照，而米拉米斯停、苯扎氯铵和氯己定用作参比制剂。然后，通过用水反复稀释由母液制备相当于5、10、20、25、50、75、100和150μg/ml的剂量的工作溶液。将具有原生动物的10μl培养基和10μl测试物质的溶液涂布于腔室载玻片上。本实验一式五份进行。
在光学显微镜下检查载玻片，根据原生动物的死亡确定物质的抗原生动物的活性(MIC和IC50)。使用具有5个参数的Hill回归模型进行分析。
作为研究的结果，发现化合物I对贻贝棘尾虫(Stylonychia mytilus)具有显著的抗原生作用(表3)。化合物I对腹纤毛虫(贻贝棘尾虫)的抗原生动物作用(25μg/ml)与氯己定(20μg/ml)、苯扎氯铵(30μg/ml)可以比较，但优于米拉米斯停(50μg/ml)。
表3.
药物的抗原生动物的活性的研究结果
Figure BDA0002403848110000181
实施例6.化合物I的抗真菌活性的体外研究
根据[Metodicheskiye rekomendatsii第2期.Mikologicheskoye issledovaniyeob"yektov okruzhayushchey sredy i opredeleniye protivogribkovoy aktivnostirazlichnykhveshchestv.-GOU DPO SPbMAPO NII meditsinskoy mikologiiim.P.N.Kashkina,GBOU VPO SZGMU im.I.I.Mechnikova Minzdrava.SPb.:Izd.DomSPbMAPO.-2008.-S.16.Methodological recommendations第2期.Mycologicalexamination of environmental objects and determination of antifungal activityof various substances.-State Educational Institution of St.Petersburg MedicalAcademy of Postgraduate Education with Scientific Research Institute ofMedical Mycology named after P.N.Kashkin,State Educational Institution ofHigher Professional Education North-West State Medical University named afterI.I.Mechnikov,Ministry of Health.St.Petersburg.::Publishing House SPbMAPO.-2008.-P.16]进行化合物I的体外抗真菌活性研究。
通过2-倍系列稀释的方法，在生物试管中的液体营养培养基(Saburo葡萄糖肉汤)中进行物质的体外抗真菌活性研究。在试管中，以下列方式制备三个平行系列的测试物质稀释液。
将Saburo的液体肉汤以无菌方式倾入每个试管中3ml；将4.5ml倾入该行的第一个试管中。一行中使用总计14个试管。其中最后一个是对照管。取400mg测试物质作为标准样品，并溶于10ml蒸馏水。因此，初始稀释液包含40000ug/ml浓度的测试物质。然后将0.5毫升这种稀释液导入该系列的第一个试管中(具有4.5ml培养基)，从而将该物质的浓度再稀释10倍。因此，该系列的第一个试管包含4000μg/ml的测试物质。然后，从第一个试管中取出3ml溶液并转移到第二个试管中，彻底净化吹扫(purged)，然后再次从第二个试管中取出3ml溶液并转移到第三个试管中,等等；从倒数第二个试管中倾入3ml。该物质未添加到最后一个试管中，因为它是对照管。因此，获得以下以μg/ml计的稀释度：4000；2000；1000；500；250；125；62.5；31.2；15.6；7.8；3.9；1.9。首先用肉眼评价培养物的生长，将测试化合物存在下的微生物的生长与没有它们存在下的培养物的生长进行比较。液体培养基中存在微生物生长(不透明或菌丝体形成)表明测物质的浓度不足以抑制其生存能力。该物质的第一最低浓度(来自一系列连续稀释液)被视为最低抑制浓度(MIC)，其中真菌得到或无法通过肉眼确定。
为了制备接种物，分别使用纯净的(2-5)天的酵母和菌丝真菌培养物，使它们在Saburo的致密营养肉汤中生长。根据真菌的种类的不同，以不同的方式制备用于铺板的接种物。因此，通过经琼脂搅拌(stroke)洗涤培养物来制备白色假丝酵母RCPF Y-401/NCTC-885-653(白色假丝酵母(C.albicans))的酵母培养物。将菌丝体真菌米根霉(Rhizopusoryzae)RCPF F-1537/1722(米根霉)、烟曲霉(Aspergillus fumigates)RCPF F-1248/880(Asp.fumigatus)的培养物在捣碎器(pounder)中预先降解。用无菌等渗氯化钠溶液制备微生物的混悬液，根据MacFarland标准(2·108CFU/ml)，使接种物密度达到20亿，前提是真菌成分的尺寸约为细菌的尺寸的10倍。本实验中的最终细胞浓度对于酵母菌为(1-5)×103，而对于菌丝体为(0.4-5.0)×104。制备后15分钟内使用接种物；在每次实验前都要监测真菌菌株的纯度。
在具有三行平行稀释的测试物质的试管中(如上所述)，以及在没有测试物质存在下的对照试管中，使用在1ml中包含加入25滴的滴定的移液管加入一滴定接种混悬液。铺板后，将三脚架(tripod)剧烈振摇，并放置在温度为27℃的恒温器中，相应地，对于酵母真菌(2-4)天，对于菌丝体真菌(7-14)天。
使用分级标度通过目视评价培养物生长，将测试化合物存在下的微生物的生长与没有它们存在下的培养物生长进行比较。
0＝光学透明，目视完全没有生长存在；
1＝增长乏力(对照水平的25％)；
2＝显著抑制生长(对照水平的50％)；
3＝弱的生长抑制(对照水平的75％)；
4＝无生长抑制。
对于MIC，采用了研究化合物的最小浓度，从而完全抑制了所研究微生物菌株的可见生长(生长等级＝0)。
作为研究结果，确定了对所有类型的微观真菌均具有明显杀真菌活性的测试化合物I的MIC值。米拉米斯停展现出对烟曲霉(Asp.fumigates)和Rh.Nigricans可比较的活性，而对白色假丝酵母(C.albicans.)无活性。对于所有类型的真菌，苯扎氯铵比化合物I和米拉米斯停明显更具有活性。
结果如表4和5中所示。
考虑到在文本中提供表格材料的可行性，申请人将其描述保留在文本中，因为这简化了对申请材料的理解。
表4.
测试物质对真菌的菌丝体和酵母种类的MIC值
Figure BDA0002403848110000211
表5.
测试物质对真菌的菌丝体和酵母种类的MIC的测定
Figure BDA0002403848110000212
实施例7.微观真菌对溶液中化合物I敏感性的测定
为了制备接种物，分别使用纯净的(2-5)天的酵母和菌丝真菌培养物，使它们在Saburo的致密营养肉汤中生长。根据真菌的种类的不同，以不同的方式制备用于铺板的接种物。因此，通过经琼脂搅拌洗涤培养物来制备酵母作物(白色假丝酵母)。将菌丝体真菌(米根霉、烟曲霉)的培养物在捣碎器中预先降解。用无菌等渗氯化钠溶液制备微生物的混悬液，使接种物密度达到5个单位(GISK[State Research Institute of Standardizationand Control]L.A.Tarasevich后命名)或根据MacFarland标准具有至少1×106CFU/ml浓度的1个单位UNIT，考虑到真菌成分的尺寸约为细菌的尺寸的10倍(这提供了产生杀生物剂与混悬液的混合物的可能性，微生物浓度约为1×105CFU/ml数量级)。
将化合物I、米拉米斯停和苯扎氯铵溶液以工作浓度(0.1％、0.2％、0.3％)倾入0.9ml无菌试管中。将0.1ml的微生物混悬液添加到含有杀菌剂(disinfectant)溶液的试管中，并通过摇动几秒钟进行混合。暴露(exposition)持续1、5和15分钟。在需要暂时暴露以使杀菌剂起作用后，加入0.5ml中和剂溶液并摇动混合。
然后，将0.1ml的混合物接种在致密的营养培养基上，并含有接种物的平板置于温度为27℃的恒温器中，相应地，对于酵母(2-4)天，对于菌丝真菌发酵(5-7)天。
与实验平行地设置了以下控制条件：
1)控制微生物的存活力(将微生物培养物铺在营养培养基上)；
2)不添加培养物即可控制杀菌剂溶液的无菌性(将制备的杀菌剂溶液铺在营养培养基上)；
3)控制中和杀菌剂的完成(1-向杀菌剂(D)的溶液中添加中和剂，2-向所得混合物中添加微生物混悬液，3-将混合物保持必要的暴露，4-将混合物铺在营养培养基上。
在培养这种物种的微生物所需的时间后，根据在平皿上生长的菌落数对结果进行计数。在没有生长的情况下，培养微生物的时间增加了2倍。对生长的菌落进行显微镜检查。
对酵母和菌丝体真菌的临床和档案菌株(archival strain)研究了测试物质。作为对比药物，使用了在临床实践中常用的药物：米拉米斯停和苯扎氯铵。在杀菌剂所需的暴露时间后，将一系列0.1ml的混合物以无菌方式铺板在平皿中的致密营养培养基表面上。在培养微生物之后，根据在平皿上生长的菌落数对结果进行计数。结果如表6中所示。
表6.
在使用不同暴露时间测定真菌对在溶液中的化合物I、米拉米斯停和苯扎氯铵的敏感性时平皿中生长的菌落数
Figure BDA0002403848110000231
本研究结果表明，化合物I的杀真菌效果优于米拉米斯停，并且略低于苯扎氯铵。化合物I对所有物种的浓度为0.2％时均具有明显的活性，而米拉米斯停即使在浓度为0.3％的情况下对米根霉也没有活性。
因此，根据获得的结果，化合物I和苯扎氯铵在暴露5分钟的情况下以0.2％的浓度具有相同的抗真菌活性。
实施例8.化合物I在混悬液测试中的杀菌活性的测定
为了制备培养物的细菌混悬液，用无菌等渗氯化钠溶液洗去在致密营养培养基中生长(18-24)小时的微生物。使每种微生物的细菌混悬液达到相当于1x 109个细胞/ml的浓度的浊度，相当于3个单位的McFarland。为了进行蛋白质加载实验，将牛血清白蛋白(BSA)溶液添加到细菌混悬液中，达到终浓度为0.2％。
将化合物I、米拉米斯停和苯扎氯铵的溶液以工作浓度(0.1％,0.2％)倾入每孔0.9ml的24-孔板中。将0.1ml的微生物混悬液添加到带有杀菌剂溶液的各孔中，并通过摇动几秒钟进行混合。
在暴露的第1、5和15分钟结束时，添加0.5ml的通用中和剂，并通过摇晃进行混合以使药物失活并使其抗菌活性停止。中和剂由100ml磷酸盐缓冲溶液中的tween-80(Sigma-Aldrich)-3.0ml、皂苷(DIAEM)-3.0g、组氨酸-0.1g、半胱氨酸-0.1g组成。
将液体接种在致密营养培养基(Müller-Hinton琼脂)上的0.1ml混合物中，在37℃下进行培养(24-48)小时。由干燥培养基(Mueller Hinton肉汤,Acumedia,Baltimore)制备Müller-Hinton肉汤，在琼脂糖化的Müller-Hinton肉汤中进行培养，其中包括另外2％的琼脂。将培养基在121℃下高压灭菌15分钟。
与本实验平行设置了以下控制条件：
-控制微生物的生存力(将微生物培养物铺在营养培养基上)；
-不添加培养物即可控制杀菌剂溶液的无菌性(将制备的杀菌剂溶液铺在营养培养基上)；
-控制中和杀菌剂的完成(向杀菌剂溶液中添加中和剂，向所得混合物中添加微生物混悬液，维持所需的暴露时间，并将混合物铺在营养培养基上)。
在培养微生物所需的时间后，根据在平皿上生长的菌落数对结果进行计数。在没有生长的情况下，微生物的培养时间增加了2倍(例如，当培养时间为24小时时，将其在恒温器中放置至多2天)。在相同条件下进行了三次本实验。
药物在混悬液中功效标准是100％测试微生物死亡，其中作用持续时间不超过30分钟。
作为0.1％化合物I溶液在混悬液中的杀菌能力的结果，结果观察到99.99％金黄色葡萄球菌ATCC 209p死亡。在蛋白质加载和暴露15分钟的实验中，化合物I导致100％的细菌死亡，这满足杀菌剂有效性的标准。化合物I的杀菌活性略低于苯扎氯铵的活性，其中在1分钟后检测到蛋白质加载时100％的细菌死亡，但高于米拉米斯停，对于后者，在暴露15分钟后在蛋白质加载下未达到100％细菌死亡(表7和8)。
表7.
在不同暴露时间下金黄色葡萄球菌ATCC 209p对化合物I、米拉米斯停和苯扎氯铵在混悬液中的0.1％溶液的敏感性，n＝3
Figure BDA0002403848110000251
-BSA—无蛋白质BSA研究
+BSA—使用蛋白质加载的BSA研究
表8.
在不同暴露时间下金黄色葡萄球菌ATCC 209p对化合物I、米拉米斯停和苯扎氯铵在混悬液中的0.2％溶液的敏感性，n＝3
Figure BDA0002403848110000261
在蛋白质加载实验中，使用浓度为0.1％的化合物I和苯扎氯铵暴露15分钟会导致100％大肠杆菌CDC F-50死亡(表9)。在浓度为0.2％的情况下，米拉米斯停也实现在暴露15-分钟暴露时表现出100％的杀菌活性(表10)。
表9.
在不同暴露时间下大肠杆菌CDC F-50对化合物I、米拉米斯停和苯扎氯铵在混悬液中的0.1％溶液的敏感性，n＝3
Figure BDA0002403848110000262
表10.
大肠杆菌CDC F-50对在混悬液中0.2％化合物I、米拉米斯停和苯扎氯铵溶液与不同暴露时间的敏感性，n＝3
Figure BDA0002403848110000271
因此，化合物I表现出杀菌活性，该活性与苯扎氯铵可比较或略低于苯扎氯铵，但高于米拉米斯停。
实施例8.化合物I在污染金属表面测试中的杀菌活性测定
细菌混悬液的制备按照类似于确定混悬液中化合物I杀菌活性的方法进行(参见实施例7)。为了模拟金属表面的蛋白质污染，将BSA溶液添加到细菌混悬液中，使其终浓度为0.4％。将金属桌面被绘制成正方形，其数量取决于所研究的菌株数量。测试表面应清洁，完整，无菌。为此，用酒精清洁桌表，再用无菌水清洁。将体积为0.125ml的微生物混悬液涂布于5×5cm的表面积上，并用无菌刮刀将其分布在整个正方形区域上。将微生物悬液干燥后，将0.5ml的化合物I(米拉米斯停和苯扎氯铵作为对照)溶液以0.1和0.2％的工作浓度均匀地涂在表面上，并用无菌刮刀分配，然后保持1、5和15分钟。
暴露结束后，用浸入1ml中和剂溶液中的无菌纱布(尺寸为5x5cm)彻底擦拭污染的表面，然后将其浸入烧瓶中的10ml无菌生理盐水中，振摇10分钟。
除进行对照外，按照实施例7中进行铺板：
-控制表面的无菌性(在施用微生物混悬液之前，用无菌棉签将金属桌洗净，然后在营养培养基上铺板)；
-控制微生物的存活力(将微生物混悬液涂布于金属桌上后，用无菌棉签将其洗净，然后在营养培养基上铺板)。
取从对照表面去除的菌落数为100％，计算1cm2表面的污染密度和杀菌百分比。表面杀菌有效性的标准为不小于测试微生物死亡的99.99％，杀菌时间不超过120分钟。
当将化合物I、米拉米斯停和苯扎氯铵的0.1％溶液保持在金黄色葡萄球菌ATCC209p污染的金属表面上时，全部三种制剂在施用5分钟后均能有效抑制细菌生长(99.99％)(表11)。当暴露于浓度为0.2％的化合物I时，在1分钟后有效抑制细菌生长(与苯扎氯铵可比较，但比米拉米斯停更有效)(表12)。
表11.
不同暴露时间下在金属表面上金黄色葡萄球菌ATCC 209p对化合物I、米拉米斯停和苯扎氯铵的0.1％溶液的敏感性，n＝3
Figure BDA0002403848110000281
表12.
不同暴露时间下在金属表面上金黄色葡萄球菌ATCC 209p对化合物I、米拉米斯停和苯扎氯铵的0.2％溶液的敏感性，n＝3
Figure BDA0002403848110000291
当将化合物I、米拉米斯停和苯扎氯铵的0.1％溶液在污染大肠杆菌CDC F-50的金属表面上暴露1、5和15分钟时，仅在施用制剂后15分钟观察到对细菌生长的有效抑制(表13)。在浓度为0.2％下，三种药物在5分钟后均能有效抑制细菌生长，而且在1分钟后无蛋白质加载苯扎氯铵中的测试中有效抑制细菌生长(表14)。
表13.
不同暴露时间下在金属表面上大肠杆菌CDC F-50对化合物I、米拉米斯停和苯扎氯铵的0.1％溶液的敏感性，n＝3
Figure BDA0002403848110000292
表14.
不同暴露时间下在金属表面上大肠杆菌CDC F-50对化合物I、米拉米斯停和苯扎氯铵的0.2％溶液的敏感性，n＝3
Figure BDA0002403848110000301
因此，化合物I的杀菌活性与苯扎氯铵可比较或略低于苯扎氯铵，但高于米拉米斯停。
实施例9.化合物I的抗菌活性研究
按照[R 4.2.2643—10Metody laboratornykh issledovaniy i ispytaniymediko-profilakticheskikh dezinfektsionnykh sredstv dlya otsenki ikheffektivnosti i bezopasnosti:Rukovodstvo.—M.:Federal'nyy tsentr gigiyeny iepidemiologii Rospotrebnadzora,2010.—S.615.R 4.2.2643-10 Laboratory methodsfor the study and testing of medical prophylactic disinfectants to assesstheir effectiveness and safety:Guide.—M.::Federal Center for Hygiene andEpidemiology of Rospotrebnadzor,2010.-P.615]进行化合物I在大鼠胃内施用中的抗菌活性的研究。用具有180—250g体重的雄性Wistar大鼠进行实验。
用无菌等渗氯化物溶液洗涤在致密的营养培养基上生长(18-20)小时大肠杆菌CDC F-50培养物，以5000rpm离心5分钟，沥干上清液，并用无菌等渗氯化钠溶液重悬细胞。
根据McFarland，使微生物的细菌混悬液达到浊度为0.05，这相当于1.5x 107个细胞/ml的浓度。
将动物分成5组，每组6只。对动物的所有操作均在异氟烷麻醉下进行(4％-麻醉诱导(2分钟，1l/min)，2％-基础麻醉)。用理发器在动物身体的背部剃除5x 5cm的部分。
用分配器将含有1x107 CFU大肠杆菌CDC F-50的0.25ml微生物悬浮液涂在大鼠背部的剃除部位，并用无菌一次性刮刀将其分布在整个方形区域上。放置2-3分钟直至干燥。
然后，将纱布(5×5cm)铺在大鼠皮肤上5分钟。在实验组中，将组织用化合物I的0.2％溶液1ml预先润湿，在阳性对照组中，将组织浸入1ml的0.2％米拉米斯停、苯扎氯铵和氯己定中。在阴性对照组中，将纱布浸入1ml无菌盐水中。
在使用抗菌药的暴露时间结束时，为了终止其对微生物的作用，使用了通用的中和剂，其由吐温80-3.0ml，皂苷-3.0g，组氨酸-0.1g，半胱氨酸-0.1g组成，用磷酸盐缓冲溶液达到至多100ml。用无菌中和剂溶液浸湿的无菌纱布(5x5厘米)洗净大鼠皮肤(1-3秒内)。然后将布浸入falcon中的10ml无菌盐水中，摇动10分钟。
此后，将洗涤液铺在2-3个平皿中各0.1ml的致密营养培养基(Müller-Hinton琼脂)中，在37℃下进行培养24-48小时。由干培养基(Mueller Hinton肉汤,Acumedia,Baltimore)制备Müller-Hinton肉汤，在琼脂糖化的Müller-Hinton肉汤中进行培养，其包括另外2％的琼脂。将培养基在121℃下高压灭菌15分钟。
在培养该物种的微生物所需的时间后，根据在平皿上生长的菌落数对结果进行计数。通过评价用抗菌药溶液处理后表面的残留污染来考虑结果。在计数在平皿上生长的菌落数后，取从对照表面去除且未暴露于抗菌作用的菌落数为100％，计算每1cm2表面的污染密度和杀菌百分比。大肠杆菌CDC F-50的生长抑制百分比由下式计算：
Figure BDA0002403848110000321
其中
I—生长抑制百分比，％
K—对照组动物中的菌落数
O—实验组中的菌落数。
体内抗菌特性研究揭示出，化合物I在暴露5分钟后可降低大鼠皮肤上大肠杆菌CDCF-50的CFU。使用苯扎氯铵、米拉米斯停和氯己定发现无统计学显著性差异(表15)。
表15.
在0.2％抗菌剂浓度和5min暴露时间时大肠杆菌CDC F-50(CFU/cm2)在大鼠皮肤上的生长抑制n＝6
药物 生长抑制率(M±SD)
I,0.2％ 97.5±1.7
苯扎氯铵,0.2％ 96.8±2.0
米拉米斯停,0.2％ 97.2±1.8
氯己定,0.2％ 95.7±3.4
实施例10.在小鼠中胃内施用后化合物I的急性毒性测定
本研究对雄雌两性的CD-1(ICR)品系小鼠(6-8周，体重不低于18g)进行。使用胃管对小鼠的胃内(口服)施用的化合物I溶液，体积不超过小鼠的0.5ml/30g体重。小鼠施用的剂量为3000mg/kg、2000mg/kg、1000mg/kg、500mg/kg和50mg/kg。
当按照GOST 32644-2014口服施用时(表16)，根据化合物I的急性毒性研究结果，将研究药物根据“化学品危险性分类和标签的全球统一制度”(Globally HarmonizedSystem of Classification of Hazards and Labeling of Chemical Products)
归为第四类毒性，并且根据GOST 12.1.007-76–第三类中等危害性有害物质。
表16.
对小鼠的化合物I急性毒性研究结果
Figure BDA0002403848110000331
因此，从上述内容可以得出结论，要求保护的化合物表现出高水平的抗细菌、抗真菌、抗病毒和抗原生动物的活性。化合物I的重要优势在于安全性高。胃内施用小鼠的急性毒性研究表明，化合物I的LD50为1,706mg/kg。目前广泛使用的抗菌药米拉米斯停(LD50＝1000mg/kg)[专利2161961Russian Federation,MPK7,C1,A 61K 31/14,A 61P 31/00.Medicinal preparation/Krivoshein Y.S.,Rudko A.P.；申请人和专利权人Krivoshein Y.S.,Rudko A.P.-№2000106427/14；申请17.03.2000公开号20.01.2001]、苯扎氯铵(LD50＝150mg/kg)[Benzalkonium chloride.Kemsol MOSS-KILL安全数据表]和氯己定(LD50＝1260mg/kg)[0.05％Chlorhexidine&0.5％Cetrimide Aqueous IrrigationPfizer material安全数据表]在对小鼠的胃内施用中毒性明显更高。总之，要求保护的技术方案允许创建一种新型的高效和安全的抗菌药物，这可能会显著改善患者的质量和预期寿命。
要求保护的技术方案满足适用于发明的“新颖性”标准，因为所研究的技术水平并未曾确定出具有所陈述的一系列区别特征的技术方案，这些特征可以确保实现所陈述的技术效果。
要求保护的技术方案满足适用于本发明的“创造性”的标准，因为对于本科学和技术领域的人员而言这是非显而易见的。
要求保护的技术方案满足“工业适用性”的标准，因为它可以在使用标准设备、众所周知的国内材料和技术的任何专业企业中实施。

Claims (2)

1.式I的季铵盐：
Figure FDA0002403848100000011
2.权利要求1的季铵盐，具有抗细菌、抗真菌、抗病毒和抗原生动物的活性。
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