CN111187770A - 一种均质型生物分子纳米粒子及其合成方法 - Google Patents

一种均质型生物分子纳米粒子及其合成方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种均质型生物分子纳米粒子，所述均质型生物分子纳米粒子的核苷酸序列为：TTT CTC CAT GGT GCT CAC。本发明还提供了所述均质型生物分子纳米粒子的合成方法，包括以下步骤：S1，向DNA原料中加入NaCl溶液溶解，震荡、混合均匀；S2，向环糊精中加入DMSO溶解，震荡、混合均匀；S3，将步骤S1的溶液和步骤S2的溶液混合后置于摇床上反应，即得到均质型生物分子纳米粒子。

Description

一种均质型生物分子纳米粒子及其合成方法
技术领域
本发明涉及生物纳米材料技术领域，尤其涉及一种均质型生物分子纳米粒子及其合成方法。
背景技术
纳米科技对于科技进步、社会发展以及人类日常生活具有重要作用。纳米科学技术的目标是制备纳米级尺度上构效关系明确的纳米结构、材料或者器件，并且能够表现出特定的功能。生物分子包括核酸(DNA，RNA)、蛋白质、多肽等，其中DNA(Deoxyribonucleicacid，脱氧核糖核酸)作为天然的纳米分子不仅能够储存和传播遗传信息，还能作为纳米材料的构建工具，其独特的优良性能如：容易合成、良好的碱基配对性、可编程性及高保真分子识别等使其在纳米技术领域的应用前景更为广阔。
1996年Mirkin等通过Au-S键，将寡核苷酸与金纳米粒子(简称AuNPs)连接，形成多价寡核苷酸纳米粒子偶联物。这种DNA功能化的纳米粒子也被称为球形核酸(sphericalnucleic acids,简称SNAs)。SNAs结合了金纳米粒子的刚性和稳定性以及DNA链段的分子识别等功能。但是这类SNAs在分子级别上不具有精准的结构，构效关系不明确。另外Au-S键能较低，使得修饰上的DNA容易脱落。因此，针对传统SNAs的不足，制备一种分子级别上结构精准、结构可调以及稳定性高的功能化材料对于实际应用分析尤为重要。
目前，广泛研究的分子纳米粒子主要有富勒烯、多面体笼型倍半硅氧烷、C60、金属杂多酸、环糊精等，与传统的纳米金粒子相比，这些分子纳米粒子具有固定的纳米尺寸、确定的化学组成、结构规整、易修饰多官能团。分子纳米粒子能够解决SNAs结构不精确、不可调等局限，基于分子纳米粒子能够精准合成分子级别上结构精确可调、稳定性高的DNA分子纳米粒子。纳米粒子与生物分子可通过点击化学法来进行偶联，常用的点击反应有一价铜催化的叠氮-炔基环加成(CuAAC)反应、环张力促进的叠氮-炔基环加成反应(SPAAC)、硫醇-烯点击偶合反应(TECC)等。
在分子纳米粒子中，环糊精是一类截顶圆锥状中空环状低聚物，其空腔可与疏水客体进行主客体自组装而成为超分子。环糊精分为ɑ-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精(简称ɑ-CD、β-CD和γ-CD)，β-环糊精因其优良的性能(物理化学性质稳定，容易制取、成本较低、无毒副作用)被广泛使用。
发明内容
针对传统SNAs的局限，本发明主要利用促进叠氮与炔环点击化学反应(SPAAC)的方法精准合成一种分子级别上结构精确、可调以及稳定性高的均质型β-环糊精基DNA分子纳米粒子。
本发明提供一种均质型生物分子纳米粒子，所述均质型生物分子纳米粒子的核苷酸序列为：TTT CTC CAT GGT GCT CAC。
本发明还提供了上述均质型生物分子纳米粒子的合成方法，包括以下步骤：
S1，向DNA原料中加入NaCl溶液溶解，震荡、混合均匀；
S2，向环糊精中加入DMSO溶解，震荡、混合均匀；
S3，将步骤S1的溶液和步骤S2的溶液混合后置于摇床上反应，即得到均质型生物分子纳米粒子。
进一步地，环糊精与DNA原料的摩尔比为1:10.5～1:17.5。
进一步地，DNA原料包含但不限于HER2-anti-DBCO，环糊精包含但不限于N3-β-CD。
进一步地，步骤S3中，摇床的温度设置为25℃，转速设置为1000rmp。
本发明提供的技术方案带来的有益效果是：本发明提供的方法利用易操作、高产率的点击化学方法精准合成均质型生物分子纳米粒子，该均质型生物分子纳米粒子在分子级别上的结构精确可调、稳定性高，为进一步研究生物分子纳米粒子在微纳尺度上的性质及自组装行为奠定基础，能够应用于生物细胞成像领域、基因调控和载药。
附图说明
图1为实施例1合成均质型β-环糊精基DNA分子纳米粒子的过程示意图；
图2为实施例1初步合成条件下琼脂糖凝胶电泳进行合成情况的分析结果示意图；
图3为利用高效液相色谱法检测实施例1的合成物分离结果的示意图；
图4为EIS-MS法对实施例1合成分离物的表征示意图；
图5为本发明中聚丙烯酰胺凝胶电泳对不同投料比下合成情况及切胶纯化物分析示意图；
图6为本发明中聚丙烯酰胺凝胶电泳对优化反应时间为5h下合成情况分析示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地描述。
本发明的实施例提供了一种均质型生物分子纳米粒子，其核苷酸序列为：TTT CTCCAT GGT GCT CAC，如SEQ ID No.1所示。
上述均质型生物分子纳米粒子的合成方法为：
步骤S1，向DNA原料中加入NaCl溶液溶解，震荡、混合均匀；
步骤S2，向环糊精中加入DMSO(二甲基亚砜)溶解，震荡、混合均匀；
步骤S3，将步骤S1的溶液和步骤S2的溶液混合后置于摇床上反应，获得合成物，先采用高效液相色谱法(HPLC)对合成物进行粗分离，然后采用聚丙烯酰胺凝胶DNA回收试剂盒进行进一步分离，即得到均质型生物分子纳米粒子。
上述步骤中，环糊精与DNA原料的摩尔比为1:10.5～1:17.5，摇床的温度设置为25℃，转速设置为1000rmp。
下面结合实施例对本发明提供的均质型生物分子纳米粒子及其合成方法进行详细说明。
以下实施例中使用的HER2-anti-DBCO原料的核苷酸序列为HER2-anti-DBCO:5’DBCO-TTT CTC CAT GGT GCT CAC-3’。
实施例1：
称取2.192g NaCl置于锥形离心管中，加入25mL超纯水溶解，配制得到1.5mol/L的NaCl溶液；向HER2-anti-DBCO原料离心管中加入2.56μL 1.5mol/L的NaCl溶液，震荡、混合均匀；称取0.0022g N3-β-CD于1.5mL离心管中，然后加入0.59mL DMSO溶解，震荡、混合均匀；利用移液枪取0.5μL HER2-anti-DBCO原液和0.5μL N3-β-CD溶液于1.5mL离心管中，然后置于摇床上，设定反应参数：72h、25℃、1000rmp，进行反应，即得到均质型β-环糊精基DNA分子纳米粒子，该均质型β-环糊精基DNA分子纳米粒子的分子量为42897.77，合成过程如图1所示。
使用4％的琼脂糖凝胶对观察合成情况，结果如图2所示，从图2可以看出，跑得较快的条带与原料(HER2-anti-DBCO)中的条带并列，即原料HER2-anti-DBCO过量，靠后的大分子量条带则是产物条带(N3-β-CD SNAs)，因此可以初步判断全取代的均质型β-环糊精基DNA分子纳米粒子合成。
上述实施例1合成均质型β-环糊精基DNA分子纳米粒子时的分离过程和表征过程具体为：
(1)均质型β-环糊精基DNA分子纳米粒子的HPLC分离：
配制流动相：A相为有机相(80％MeCN(乙腈))+20％TEAA)，B相为水相(TEAA,pH≈7.0)。TEAA溶液由5.6mL冰醋酸与13.86mL三乙胺混合，加入超纯水至体积为1000mL配制，用pH计调节PH至约7.0；
20μL参比样(DNA原料)：取5μL 250μM HER2-anti-DBCO加入到15μL 1.5M NaCl中至进样浓度为63μM。
20μL产物样品：取2.5μL 1mM实施例1的产物加入到17.5μL的超纯水中至进样浓度为125μM；
在室温下，对参比样的谱图进行采集(结果见图3)；
用相同的条件对产物样进行分离纯化(结果见图3)。
结果表明：未分离的产物在色谱图上有三个峰，有两个与原料相同的峰，和一个不同于原料的峰(目标产物峰)。
(2)均质型β-环糊精基DNA分子纳米粒子的EIS-MS表征：
将HPLC收集的实施例1的产物用浓缩机浓缩，除去流动相，进行质谱检测(结果见图4)。
图4表明：主峰的分子量为42899.3，与实施例1合成的均质型β-环糊精基DNA分子纳米粒子的理论分子量42897.77一致，证明基于β-环糊精DNA分子纳米粒子合成成功。
(3)均质型β-环糊精基DNA分子纳米粒子的合成及分离优化：
聚丙烯酰胺凝胶DNA回收试剂盒对合成物分离纯化与观察：
用100μL平衡液平衡分离柱；切取含DNA片段的PAGE凝胶，放入1.5mL离心管中，捣碎；向凝胶中加入2倍体积的Diffusion Buffer，55℃温浴2h，期间每15min涡旋震荡混匀；12000rpm离心5min，取上清液转入新的离心管，记录上清体积；加入9倍上清体积的BindingBuffer，混匀；将上一步所得溶液加入吸附柱EC中(吸附柱放入收集管中)，室温放置1min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；加入600μL漂洗液WB，12000rpm离心30s，弃掉废液，重复进行一次；将吸附柱EC放回空收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应；取出吸附柱EC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm离心1min；纯化产物用12％的聚丙烯酰胺凝胶电泳观察(结果见图5)。
图5表明，用聚丙烯酰胺凝胶DNA回收试剂盒纯化后从凝胶上能观察到单一的产物条带，得到纯的目标产物均质型β-环糊精基DNA分子纳米粒子。
实施例2：
实施2与实施例1的区别仅在于：N3-β-CD与HER2-anti-DBCO的投料摩尔比为2:1；其余则与实施例1基本相同。
实施例3：
实施3与实施例1的区别仅在于：N3-β-CD与HER2-anti-DBCO的投料摩尔比为1:7；其余则与实施例1基本相同。
实施例4：
实施4与实施例1的区别仅在于：N3-β-CD与HER2-anti-DBCO的投料摩尔比为1:10.5；其余则与实施例1基本相同。
从实施例2-实施例4获得的溶液中各取适量样品加水适当稀释，取5μL于0.2mL离心管中，在离心管中加1μL 6x Loading Buffer，震荡混匀，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(结果见图6)，从图6可以看出原料摩尔比为2:1、1:7时无法合成均质型的目标DNA分子纳米粒子，原料摩尔比为1:10.5时可以合成均质型的目标DNA分子纳米粒子。
抽取实施例4中反应5h、24h、36h、48h、60h时的产物进行检测，直至能通过聚丙烯酰胺凝胶电泳确定该时间下的反应合成完成，并与72h的产物进行对比，结果表明：反应时间5h样品中，原料HER2-anti-DBCO过量，与72h样品的电泳结果一致，表明反应时间为5h时即完成了合成反应。
实施例5：
实施5与实施例1的区别仅在于：N3-β-CD与HER2-anti-DBCO的投料摩尔比为1:12.5；其余则与实施例1基本相同。
实施例6：
实施6与实施例1的区别仅在于：N3-β-CD与HER2-anti-DBCO的投料摩尔比为1:15.5；其余则与实施例1基本相同。
在不冲突的情况下，本文中上述实施例及实施例中的特征可以相互结合。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure BDA0002359454460000081
序列表
<110> 中国地质大学（武汉）
<120> 一种均质型生物分子纳米粒子及其合成方法
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成（Artificial）
<400> 1
TTT CTC CAT GGT GCT CAC 18

Claims (5)

1.一种均质型生物分子纳米粒子，其特征在于，所述均质型生物分子纳米粒子的核苷酸序列为：TTT CTC CAT GGT GCT CAC。
2.权利要求1所述的均质型生物分子纳米粒子的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，向DNA原料中加入NaCl溶液溶解，震荡、混合均匀；
S2，向环糊精中加入DMSO溶解，震荡、混合均匀；
S3，将步骤S1的溶液和步骤S2的溶液混合后置于摇床上反应，即得到均质型生物分子纳米粒子。
3.根据权利要求2所述的均质型生物分子纳米粒子的合成方法，其特征在于，环糊精与DNA原料的摩尔比为1:10.5～1:17.5。
4.根据权利要求2所述的均质型生物分子纳米粒子的合成方法，其特征在于，DNA原料包含但不限于HER2-anti-DBCO，环糊精包含但不限于N3-β-CD。
5.根据权利要求2所述的均质型生物分子纳米粒子的合成方法，其特征在于，步骤S3中，摇床的温度设置为25℃，转速设置为1000rmp。
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